Name: Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania interakcji leukocytów i płytek krwi ze śródbłonkiem w żyłach krezkowych myszy. Ta metoda pozwala obserwować procesy zapalne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt (TierSchG). Myszy trzymano w pomieszczeniach i obchodzono się z nimi zgodnie z dobrą praktyką zwierzęcą określoną przez FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) i krajowy organ ds. dobrostanu zwierząt GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Komisja ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu we Fryburgu Bryzgowijskim oraz władze lokalne (Regierungspräsidium Freiburg) zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Postępowanie ze zwierzętami, przygotowanie i indukcja stanu zapalnego
<ol>
	<li>Użyj 4-6 tygodniowych samców myszy o wadze 16 - 20 g. Uwaga: Jeśli myszy są starsze lub cięższe, wykazują nadmierną ilość tłuszczu otaczającego naczynie, co ogranicza obserwację mikroskopową.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia i stół mikroskopowy przed zabiegiem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 mg/kg LPS (lipopolisacharyd) dootrzewnowo na 4 godziny przed mikroskopią żywej myszy w celu wywołania zapalenia bakteryjnego.</li>
	<li>Podgrzej 0,9% roztwór soli fizjologicznej w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby nawilżyć plastikową komorę i tkankę krezkową.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) tuż przed zabiegiem mikroskopowym. Można zastosować alternatywne znieczulenie, np. inhalację 2% izofluranu. Prawidłowe znieczulenie potwierdzić utratą odpowiedzi na stymulację odruchową (uszczypnięcie palca u nogi lub ogona przy mocnym ucisku).</li>
	<li>Zdepiluj brzuch za pomocą golarki i usuń luźne włosy gazą nasączoną etanolem 70%.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Wysterylizuj brzuch przy użyciu 70% etanolu. Ta metoda nie jest metodą sterylną i może być śmiertelna pod koniec eksperymentu.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię pośrodkową: Otwórz skórę brzucha za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy i małych nożyczek. Zidentyfikuj naczynia epigastryczne i otwórz otrzewną w okolicy kresy białej, aby chronić naczynia.</li>
	<li>Nałóż kilka kropli podgrzanej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać wilgotność tkanki.</li>
	<li>Znakować fluorescencyjnie leukocyty i płytki krwi przez wstrzyknięcie 50 μl rodaminy 6G (1 mg/ml) po orbicie, jak opisano wcześniej w punkcie 9,10.</li>
	<li>Zewnętrznie uformować pętlę jelita krętego i umieścić ją w pietryszku o średnicy 10 cm i upewnić się, że tkanka jest wilgotna, stosując wstępnie podgrzany roztwór soli o temperaturze 37 °C (0,9%) co drugą minutę.</li>
</ol>
3. Mikroskopia przyżyciowa
<ol>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem i umieść żyłę krezkową o średnicy 200 - 300 μm w centrum view. Wybierz naczynie bez widocznego tłustego otoczenia.</li>
	<li>Nie dotykaj naczyń krezki, unikając w ten sposób stymulacji śródbłonka. Z pętlą jelita krętego należy obchodzić się ostrożnie.</li>
	<li>Wizualizuj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem za pomocą mikroskopu odwróconego lub pionowego i kamery za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Rejestruj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem przez 1 minutę w 4 różnych żyłach na mysz.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po zakończeniu eksperymentów obrazowych.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę w trybie offline i z zaślepieniem dla wszystkich parametrów. Przeprowadź analizę za pomocą dowolnego odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Potwierdź stabilne i porównywalne międzyosobniczo warunki przepływu krwi w klipach filmowych o wysokiej rozdzielczości czasowej (maksymalna liczba klatek na sekundę) skoncentrowanych na wewnątrzświetlnym przepływie krwinek.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę toczących się leukocytów. W tym celu narysuj pionową linię przechodzącą przez żyłę i policz wszystkie leukocyty przekraczające tę linię w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Określ prędkość toczenia, mierząc czas, w którym pojedynczy leukocyt musi przejść odległość 50 μm podczas stabilnego toczenia się po śródbłonku. Aby to zrobić, narysuj dwie pionowe linie w odległości 50 μm przez żyłę.
	<ol>
		<li>Zmierz czas, w którym reprezentatywny leukocyt musi przejść z jednej linii do drugiej. Oblicz prędkość leukocytów, dzieląc 50 μm przez potrzebny czas (μm/s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz adhezję leukocytów w polu 0,04 mm2 . Aby to zrobić, narysuj kwadrat o boku długości 200 μm do żyły.
	<ol>
		<li>Policz twarde przylegające leukocyty, zdefiniowane jako brak widocznego ruchu przez 30 sekund, w tym kwadracie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz liczbę płytek krwi związanych z jednym leukocytem, aby określić ilościowo interakcje płytk-leukocyty.</li>
</ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule opisano przygotowanie i wykonanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych myszy in vivo. Metoda ta daje nam możliwość obserwacji oddziaływań leukocytów-śródbłonka i płytek-śródbłonka11 bezpośrednio w żywym organizmie.
Jako wczesna reakcja na stan zapalny śródbłonek zostaje aktywowany i wchodzi w interakcję z leukocytami i płytkami krwi, powodując toczenie, adhezję i transmigrację12. Ale leukocyty oddziałują również z płytkami krwi, tworząc t...

Celem tego protokołu jest opisanie uproszczonej techniki mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u żywych myszy do bezpośredniej obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i leukocytów-płytek krwi w warunkach zapalnych.
Mikroskopia przyżyciowa została opracowana do badania interakcji leukocytów i śródbłonka in vivo w warunkach zapalnych1,2, co nie jest trywialne, ale ważne dla zrozumienia rekrutacji i funkcji leukocytów zapalnych. Metoda, którą opisujemy w niniejszym protokole, została opracowana w oparciu o wcześniej opublikowane publikacje. Podobnie jak w przypadku wizualizacji włączenia płytek krwi do rosnącej skrzepliny3 i równolegle do tego, co zostało opublikowane wcześniej4, zewnętrzna żyła krezkowa jest badana za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Istnieje wiele innych modeli mikroskopii przyżyciowej, takich jak mięsień cremaster u szczurów5 lub wątroba myszy i szczurów6.
Mikroskopia przyżylna żyły krezkowej została opracowana i zastosowana w poprzednich badaniach przez kilka grup. Użyliśmy tej techniki, aby zaobserwować różnice w rekrutacji leukocytów między myszami typu dzikiego a hydroksylazą tryptofanu1 (Tph1) -/- myszy, które mają niedobór nieneuronalnej serotoniny i porównaliśmy wyniki z myszami, u których serotonina płytkowa była farmakologicznie zubożona przez długotrwałe stosowanie selektywnego inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny fluoksetyny7. Zbadano również interakcje leukocyty-śródbłonek po ostrym leczeniu fluoksetyną8.
W tym protokole skupiamy się na mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych, ponieważ ten model można wykonać szybko i pozwala na prawidłowe pomiary interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów. Jest to znacznie trudniejsze i bardziej czasochłonne w mikroskopii przyżyciowej innych narządów, takich jak kości, wątroba, skóra lub mięsień cremaster. Opisany tutaj model jest idealny do powtarzalnej oceny interakcji zapalnej komórka-komórka po sprowadzeniu jej za pomocą bodźca zapalnego, takiego jak dootrzewnowe wstrzyknięcie lipopolisacharydu.

<table><tbody><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Mikroskopia przyżyciowe to metoda, która może być używana do badania różnych procesów w różnych regionach i naczyniach u żywych zwierząt. W tym protokole opisujemy mikroskopię przyżytkową żył krezkowych. Można to zrobić w krótkim czasie, uzyskując powtarzalne wyniki pokazujące interakcje leukocyty-śródbłonek in vivo. Opisujemy stan zapalny po prowokacji śródbłonka przez LPS. Ale w tym modelu można zastosować wiele różnych rodzajów stanów zapalnych, takich jak bakteryjne, chemiczne lub biologiczne, i badać podawanie leków i ich bezpośredni wpływ na żywe zwierzę oraz jego wpływ na rekrutację leukocytów. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w wielu różnych metodach leczenia myszy i ich wpływie na odpowiedź zapalną w naczyniach. W niniejszym artykule opisujemy wizualizację leukocytów i płytek krwi poprzez fluorescencyjne znakowanie ich rodaminą 6G. Dodatkowo, dowolne specyficzne obrazowanie może być wykonane przy użyciu ukierunkowanych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie.

Przegląd ustawień eksperymentalnych opisanych w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawia on mysz z zewnętrznioną pętlą jelita cienkiego (ileum) oraz jej naczyniami, które można obserwować za pomocą mikroskopii wewnątrzorganowej. Rysunek 2 pokazuje pewien stopień aktywacji u zwierząt nieleczonych, wynikający z samego zabiegu. Jednak w porównaniu z myszami traktowanymi LPS niemal nie obserwuje się powolnego toczenia ani trwałej adhezji leukocytów. Rysunek 2</str...

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie interakcji leukocytów, komórek śródbłonka i płytek krwi podczas stanu zapalnego in vivo. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie podanie myszy wybranych substancji oraz znakowanie komórek krwi; następnie pętla jelita cienkiego wraz z towarzyszącymi naczyniami krezowymi zostaje wypreparowana na zewnątrz, a interakcje komórek zachodzące w obrębie wybranej żyły krezowej są obrazowane za pomocą intravitalnej mikroskopii. Ostatecznie można przeanalizować interakcje między leukocytami a płytkami krwi, śródbłonkiem lub wzajemnie między sobą.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny stanu zapalnego, takie jak rodzaje interakcji leukocytów z śródbłonkiem lub płytek krwi i leukocytami, które występują in vivo podczas różnych modeli zapalnych lub po wybranych wstępnych opracowaniach. Na cztery godziny przed obrazowaniem wewnątrzżyciowym wstrzyknij 20 mg/kg LPS drogą IP myszy samcu o masie 16–20 g i wieku od 4 do 6 tygodni, aby wywołać modelową bakteryjną odpowiedź zapalną. W tym samym czasie podgrzej roztwór soli fizjologicznej 0,9% w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu nawilżenia komory plastikowej oraz tkanki krezkowej.Następnie potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u myszy traktowanej LPS, a następnie nałożyć maść na miejsce nacięcia, ogolić brzuch zwierzęcia shaverem i usunąć luźne włosy gazą nasączoną 70% ethanol. Następnie za pomocą małych zakrzywionych pęset i nożyczek otworzyć jamę brzusną, zidentyfikować naczynia nadbrzusznia i otworzyć otrzewną w okolicy białej linii brzusznej, aby chronić naczynia. Wprowadzić kilka kropli podgrzanego soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać tkankę w stanie wilgotnym, a następnie wykonać retroorbitalne wstrzyknięcie 50 µL rod Domine six G w celu znakowania krążących komórek krwi.Następnie umieść mysz w szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów, wyciągnij pętlę jelita cienkiego i podawaj uprzednio ogrzaną sól fizjologiczną co minutę, aby utrzymać tkankę w stanie wilgotnym. Aby zwizualizować odpowiedź zapalną za pomocą mikroskopii intravitalnej, umieść mysz pod mikroskopem i wprowadź w pole widzenia żyłę krezkową o średnicy od 200 do 300 mikrometrów z jak najmniejszą ilością widocznego tłuszczu otaczającego, korzystając z odpowiedniego oprogramowania mikroskopowego.Nagraj interakcje komórek krwi z śródbłonkiem przez jedną minutę w czterech różnych żyłach u każdej myszy. Następnie przeanalizuj odpowiedzi komórka-komórka, aby potwierdzić stabilne i indywidualne warunki przepływu krwi. Aby określić liczbę toczących się leukocytów, narysuj linię pionową w poprzek żyły i ręcznie policz wszystkie leukocyty, które przekroczą tę linię w ciągu jednej minuty.Aby wyznaczyć prędkość toczenia, narysuj w naczyniu dwie pionowe linie w odległości 50 µm od siebie i zmierz czas, w jakim pojedynczy leukocyt pokona odległość między liniami, stabilnie tocząc się po śródbłonku. Aby zmierzyć adhezję leukocytów, narysuj w naczyniu kwadrat o wymiarach 200 na 200 µm. Następnie ręcznie policz silnie przylegające leukocyty, które nie wykazują widocznego ruchu w obrębie kwadratu przez 30 s.W końcu, aby ilościowo określić interakcje płytek krwi z leukocytami, należy ręcznie policzyć liczbę płytek związanych z jednym leukocytem. Chociaż u zwierząt nieleczonych występuje pewien stopień aktywacji wynikający z samej procedury, prawie nie obserwuje się powolnego toczenia ani silnej adhezji leukocytów. Rzeczywiście, u myszy poddanych działaniu LPS obserwuje się większą liczbę toczących się i przylegających leukocytów oraz spadek prędkości toczenia się krążących komórek krwi.W tym doświadczeniu mikroskopia intravitalna została przeprowadzona bez dodatkowego podawania LPS bezpośrednio po ostrym leczeniu fluoksetyną drogą dosytrytchalną. Należy zauważyć, że większa liczba silnie przylegających leukocytów oraz niższe prędkości toczenia u zwierząt leczonych fluoksetyną wskazują na wpływ ostrego leczenia fluoksetyną na interakcje leukocytów z śródbłonkiem. Co więcej, jak widać na tym reprezentatywnym obrazie interakcji płytek krwi z leukocytami w żyle krezkowej podczas wywołanego przez LPS zapalenia otrzewnej, można zaobserwować gromadzenie się płytek wokół leukocytów, a także interakcje tych kompleksów ze ścianą naczynia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania mikroskopii w celu zbadania oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem oraz oddziaływań leukocytów z płytkami krwi.

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania interakcji leukocytów i płytek krwi ze śródbłonkiem w żyłach krezkowych myszy. Ta metoda pozwala obserwować procesy zapalne w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów