Name: Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania interakcji leukocytów i płytek krwi ze śródbłonkiem w żyłach krezkowych myszy. Ta metoda pozwala obserwować procesy zapalne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt (TierSchG). Myszy trzymano w pomieszczeniach i obchodzono się z nimi zgodnie z dobrą praktyką zwierzęcą określoną przez FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) i krajowy organ ds. dobrostanu zwierząt GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Komisja ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu we Fryburgu Bryzgowijskim oraz władze lokalne (Regierungspräsidium Freiburg) zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Postępowanie ze zwierzętami, przygotowanie i indukcja stanu zapalnego
<ol>
	<li>Użyj 4-6 tygodniowych samców myszy o wadze 16 - 20 g. Uwaga: Jeśli myszy są starsze lub cięższe, wykazują nadmierną ilość tłuszczu otaczającego naczynie, co ogranicza obserwację mikroskopową.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia i stół mikroskopowy przed zabiegiem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 mg/kg LPS (lipopolisacharyd) dootrzewnowo na 4 godziny przed mikroskopią żywej myszy w celu wywołania zapalenia bakteryjnego.</li>
	<li>Podgrzej 0,9% roztwór soli fizjologicznej w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby nawilżyć plastikową komorę i tkankę krezkową.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) tuż przed zabiegiem mikroskopowym. Można zastosować alternatywne znieczulenie, np. inhalację 2% izofluranu. Prawidłowe znieczulenie potwierdzić utratą odpowiedzi na stymulację odruchową (uszczypnięcie palca u nogi lub ogona przy mocnym ucisku).</li>
	<li>Zdepiluj brzuch za pomocą golarki i usuń luźne włosy gazą nasączoną etanolem 70%.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Wysterylizuj brzuch przy użyciu 70% etanolu. Ta metoda nie jest metodą sterylną i może być śmiertelna pod koniec eksperymentu.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię pośrodkową: Otwórz skórę brzucha za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy i małych nożyczek. Zidentyfikuj naczynia epigastryczne i otwórz otrzewną w okolicy kresy białej, aby chronić naczynia.</li>
	<li>Nałóż kilka kropli podgrzanej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać wilgotność tkanki.</li>
	<li>Znakować fluorescencyjnie leukocyty i płytki krwi przez wstrzyknięcie 50 μl rodaminy 6G (1 mg/ml) po orbicie, jak opisano wcześniej w punkcie 9,10.</li>
	<li>Zewnętrznie uformować pętlę jelita krętego i umieścić ją w pietryszku o średnicy 10 cm i upewnić się, że tkanka jest wilgotna, stosując wstępnie podgrzany roztwór soli o temperaturze 37 °C (0,9%) co drugą minutę.</li>
</ol>
3. Mikroskopia przyżyciowa
<ol>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem i umieść żyłę krezkową o średnicy 200 - 300 μm w centrum view. Wybierz naczynie bez widocznego tłustego otoczenia.</li>
	<li>Nie dotykaj naczyń krezki, unikając w ten sposób stymulacji śródbłonka. Z pętlą jelita krętego należy obchodzić się ostrożnie.</li>
	<li>Wizualizuj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem za pomocą mikroskopu odwróconego lub pionowego i kamery za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Rejestruj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem przez 1 minutę w 4 różnych żyłach na mysz.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po zakończeniu eksperymentów obrazowych.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę w trybie offline i z zaślepieniem dla wszystkich parametrów. Przeprowadź analizę za pomocą dowolnego odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Potwierdź stabilne i porównywalne międzyosobniczo warunki przepływu krwi w klipach filmowych o wysokiej rozdzielczości czasowej (maksymalna liczba klatek na sekundę) skoncentrowanych na wewnątrzświetlnym przepływie krwinek.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę toczących się leukocytów. W tym celu narysuj pionową linię przechodzącą przez żyłę i policz wszystkie leukocyty przekraczające tę linię w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Określ prędkość toczenia, mierząc czas, w którym pojedynczy leukocyt musi przejść odległość 50 μm podczas stabilnego toczenia się po śródbłonku. Aby to zrobić, narysuj dwie pionowe linie w odległości 50 μm przez żyłę.
	<ol>
		<li>Zmierz czas, w którym reprezentatywny leukocyt musi przejść z jednej linii do drugiej. Oblicz prędkość leukocytów, dzieląc 50 μm przez potrzebny czas (μm/s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz adhezję leukocytów w polu 0,04 mm2 . Aby to zrobić, narysuj kwadrat o boku długości 200 μm do żyły.
	<ol>
		<li>Policz twarde przylegające leukocyty, zdefiniowane jako brak widocznego ruchu przez 30 sekund, w tym kwadracie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz liczbę płytek krwi związanych z jednym leukocytem, aby określić ilościowo interakcje płytk-leukocyty.</li>
</ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule opisano przygotowanie i wykonanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych myszy in vivo. Metoda ta daje nam możliwość obserwacji oddziaływań leukocytów-śródbłonka i płytek-śródbłonka11 bezpośrednio w żywym organizmie.
Jako wczesna reakcja na stan zapalny śródbłonek zostaje aktywowany i wchodzi w interakcję z leukocytami i płytkami krwi, powodując toczenie, adhezję i transmigrację12. Ale leukocyty oddziałują również z płytkami krwi, tworząc t...

Celem tego protokołu jest opisanie uproszczonej techniki mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u żywych myszy do bezpośredniej obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i leukocytów-płytek krwi w warunkach zapalnych.
Mikroskopia przyżyciowa została opracowana do badania interakcji leukocytów i śródbłonka in vivo w warunkach zapalnych1,2, co nie jest trywialne, ale ważne dla zrozumienia rekrutacji i funkcji leukocytów zapalnych. Metoda, którą opisujemy w niniejszym protokole, została opracowana w oparciu o wcześniej opublikowane publikacje. Podobnie jak w przypadku wizualizacji włączenia płytek krwi do rosnącej skrzepliny3 i równolegle do tego, co zostało opublikowane wcześniej4, zewnętrzna żyła krezkowa jest badana za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Istnieje wiele innych modeli mikroskopii przyżyciowej, takich jak mięsień cremaster u szczurów5 lub wątroba myszy i szczurów6.
Mikroskopia przyżylna żyły krezkowej została opracowana i zastosowana w poprzednich badaniach przez kilka grup. Użyliśmy tej techniki, aby zaobserwować różnice w rekrutacji leukocytów między myszami typu dzikiego a hydroksylazą tryptofanu1 (Tph1) -/- myszy, które mają niedobór nieneuronalnej serotoniny i porównaliśmy wyniki z myszami, u których serotonina płytkowa była farmakologicznie zubożona przez długotrwałe stosowanie selektywnego inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny fluoksetyny7. Zbadano również interakcje leukocyty-śródbłonek po ostrym leczeniu fluoksetyną8.
W tym protokole skupiamy się na mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych, ponieważ ten model można wykonać szybko i pozwala na prawidłowe pomiary interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów. Jest to znacznie trudniejsze i bardziej czasochłonne w mikroskopii przyżyciowej innych narządów, takich jak kości, wątroba, skóra lub mięsień cremaster. Opisany tutaj model jest idealny do powtarzalnej oceny interakcji zapalnej komórka-komórka po sprowadzeniu jej za pomocą bodźca zapalnego, takiego jak dootrzewnowe wstrzyknięcie lipopolisacharydu.

<table><tbody><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Mikroskopia przyżyciowe to metoda, która może być używana do badania różnych procesów w różnych regionach i naczyniach u żywych zwierząt. W tym protokole opisujemy mikroskopię przyżytkową żył krezkowych. Można to zrobić w krótkim czasie, uzyskując powtarzalne wyniki pokazujące interakcje leukocyty-śródbłonek in vivo. Opisujemy stan zapalny po prowokacji śródbłonka przez LPS. Ale w tym modelu można zastosować wiele różnych rodzajów stanów zapalnych, takich jak bakteryjne, chemiczne lub biologiczne, i badać podawanie leków i ich bezpośredni wpływ na żywe zwierzę oraz jego wpływ na rekrutację leukocytów. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w wielu różnych metodach leczenia myszy i ich wpływie na odpowiedź zapalną w naczyniach. W niniejszym artykule opisujemy wizualizację leukocytów i płytek krwi poprzez fluorescencyjne znakowanie ich rodaminą 6G. Dodatkowo, dowolne specyficzne obrazowanie może być wykonane przy użyciu ukierunkowanych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie.

Przegląd ustawień eksperymentalnych opisanych w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawia on mysz z zewnętrznioną pętlą jelita cienkiego (ileum) oraz jej naczyniami, które można obserwować za pomocą mikroskopii wewnątrzorganowej. Rysunek 2 pokazuje pewien stopień aktywacji u zwierząt nieleczonych, wynikający z samego zabiegu. Jednak w porównaniu z myszami traktowanymi LPS niemal nie obserwuje się powolnego toczenia ani trwałej adhezji leukocytów. Rysunek 2</str...

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie interakcji leukocytów, komórek śródbłonka i płytek krwi podczas stanu zapalnego in vivo. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie podanie myszy wybranych substancji oraz znakowanie komórek krwi; następnie pętla jelita cienkiego wraz z towarzyszącymi naczyniami krezowymi zostaje wypreparowana na zewnątrz, a interakcje komórek zachodzące w obrębie wybranej żyły krezowej są obrazowane za pomocą intravitalnej mikroskopii. Ostatecznie można przeanalizować interakcje między leukocytami a płytkami krwi, śródbłonkiem lub wzajemnie między sobą.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny stanu zapalnego, takie jak rodzaje interakcji leukocytów z śródbłonkiem lub płytek krwi i leukocytami, które występują in vivo podczas różnych modeli zapalnych lub po wybranych wstępnych opracowaniach. Na cztery godziny przed obrazowaniem wewnątrzżyciowym wstrzyknij 20 mg/kg LPS drogą IP myszy samcu o masie 16–20 g i wieku od 4 do 6 tygodni, aby wywołać modelową bakteryjną odpowiedź zapalną. W tym samym czasie podgrzej roztwór soli fizjologicznej 0,9% w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu nawilżenia komory plastikowej oraz tkanki krezk

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Poznaj mikroskopię przyżyciową do badania interakcji leukocytów i płytek krwi ze śródbłonkiem w żyłach krezkowych myszy. Ta metoda pozwala obserwować procesy zapalne w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów