Name: Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę tworzenia rusztowań polimerowych z włóknami IPC do kontrolowanego uwalniania biomolekuł w inżynierii tkankowej. Technika umożliwia naśladowanie niszy komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Singapurską Narodową Fundację Badawczą zarządzaną przez jedno z jej Centrów Doskonałości Badawczej, Instytut Mechanobiologii w Singapurze. MFAC jest wspierany przez Agencję ds. Nauki, Technologii i Badań (Singapur) oraz Narodową Agencję ds. Badań Naukowych (Francja) w ramach projektu nr 1122703037. BKKT jest wspierany przez Instytut Mechanobiologii. Dziękujemy Panu Danielowi HC Wong za korektę manuskryptu oraz Pani Dawn JH Neo za pomoc w produkcji filmu.

1. Przygotowanie roztworów polielektrolitu
<ol>
	<li>Oczyść chitozan, jak szczegółowo opisano w Liao i wsp. Krótko mówiąc, utwórz 1% (w/v) roztwór chitozanu w 2% (v/v) kwasie octowym i przefiltruj próżniowo, używając bibuły filtracyjnej klasy 93. Zneutralizować filtrat za pomocą 5M NaOH, aż pH ustabilizuje się do 7. Odwirować wytrącony chitozan o sile 1 200 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant i dodać wodę dejonizowaną, aby przemyć chitozan. Powtórz etap wirowania i mycia jeszcze dwa razy. Zamrozić wytrącony chitozan w temperaturze -80 °C i liofilizować O/N w celu uzyskania oczyszczonej postaci. Oczyszczony chitozan należy przechowywać w osuszonej szafce.</li>
	<li>Odważyć 1 g oczyszczonego chitozanu do sterylnego naczynia do hodowli tkankowych. Umieścić chitozan w naczyniu do hodowli tkankowej jak najbliżej lampy UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wystawić na działanie światła UV przez 15 minut. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wysterylizowany chitozan w szklanym pojemniku. Rozpuścić chitozan za pomocą przefiltrowanego 0,15 M kwasu octowego do końcowego stężenia od 0,5% do 1% (w/v).</li>
	<li>Odważyć 0,1 g soli sodowej kwasu alginowego i rozpuścić w 10 ml destylowanej wody dejonizowanej (DDI) do uzyskania 1% (w/v) roztworu. Mieszaj sól sodową kwasu alginowego przez co najmniej 2 godziny w mieszalniku wirowym, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Przefiltrować roztwór alginianu przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Przechowywać roztwór alginianu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Należy rozpuścić ludzkie rekombinowane czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) lub czynnik wzrostu beta - nerwów (NGF), zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
2. Rysunek włókien IPC
<ol>
	<li>Wymieszaj białka, czynniki wzrostu lub inne biomolekuły w 10-20 μl podwielokrotności roztworu polielektrolitu o podobnym ładunku netto. Cząsteczki biologiczne o ujemnym ładunku netto (np. albumina surowicy bydlęcej [BSA]) należy zmieszać z roztworem alginianu. Cząsteczki biologiczne o dodatnim ładunku netto (np. VEGF) należy zmieszać z roztworem chitozanu.</li>
	<li>Umieść małe porcje (10-20 μl) chitozanu i alginianu na stabilnej płaskiej powierzchni pokrytej parafilmem. Kropelki chitozanu i alginianu należy umieszczać w bliskiej odległości, ale nie stykać się ze sobą.</li>
	<li>Lekko zanurz każdą końcówkę na kleszkach w kropelkach chitozanu i alginianu. Zbliż do siebie kropelki polielektrolitów, ściskając kleszcze. Gdy kropelki zetkną się ze sobą, powoli pociągnij kleszcze pionowo do góry, aby wyciągnąć włókno IPC z interfejsu dwóch kropel (rysunek 1A).</li>
	<li>Ostrożnie umieść koniec ciągnionego włókna IPC na kleszkach na kolektorze, takim jak płaskie rusztowanie polimerowe przymocowane do obracającego się trzpienia (patrz rozdział 3 i 4). Obracaj trzpień ze stałą prędkością 10 mm/s, aby umożliwić formowanie jednolitych i pozbawionych koralików włókien IPC. Zwiększenie prędkości ciągnięcia włókien IPC spowoduje utworzenie koralików, które spowodują pęknięcie wbudowanego biochemicznego i przedwczesne zakończenie włókna. 10</li>
	<li>Aby określić skuteczność włączania, należy zebrać wszystkie pozostałe ciecze pozostawione na parafilmie, rozcieńczając 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS). Zmierzyć zawartość białka lub czynnika wzrostu w pozostałości za pomocą testu BCA (dla BSA), ELISA (dla VEGF i NGF) lub odpowiedniego testu w celu wykrycia włączonej biocząsteczki.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie kompozytowego rusztowania hydrożelowego z polisacharydu pullulan-dekstranu (PD) i włókien IPC
<ol>
	<li>Wytwarzanie protektorowej ramy pullulanowej do zbierania włókien IPC
	<ol>
		<li>Odważyć polisacharyd pullulanu i wymieszać z destylowaną wodą dejonizowaną (DDI), aby uzyskać 20% (w/v) roztwór wodny. Wymieszać roztwór pullulanu O/N, aby zapewnić jednorodność.</li>
		<li>Wlać 15 g roztworu pullulanu do naczynia z polistyrenu tkankowego (TCPS) o średnicy 10 cm. Wysuszyć roztwór pullulanu O/N w temperaturze 37 °C. Pociąć folie pullulan na kwadratowe ramki o wymiarach 7 mm x 7 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu polisacharydów pullulan-dekstran
	<ol>
		<li>Stworzyć 30% (w/v) roztwór polisacharydów pullulanu i dekstranu (w stosunku 3:1) w wodzie DDI. Wymieszać O/N, aby zapewnić jednorodność roztworu polisacharydów. Powoli dodawać wodorowęglan sodu do roztworu polisacharydów, aby osiągnąć końcowe stężenie 20% (w/v). Wymieszać O/N, aby zapewnić jednorodność roztworu. Roztwór polisacharydu przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie włókien IPC na ramie pullulan
	<ol>
		<li>Przymocować ramkę z pullulana (sekcja 3.1) za pomocą zacisku krokodylkowego. Przyklej zacisk krokodylkowy i ramkę pullulan na końcu obrotowego trzpienia za pomocą taśmy klejącej pokrytej tworzywem sztucznym. Obracać trzpień z zamontowaną ramą ze stałą prędkością 10 mm/s. Ramę pullulan można przymocować do trzpienia obrotowego w żądanej orientacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysuj włókna IPC za pomocą kleszczy (sekcja 1) i przymocuj narysowany koniec włókien IPC do obracającej się ramy pullulan. Narysuj włókna IPC ze stałą prędkością. Po dotarciu do końcowego końca włókna IPC, wysusz włókna na ramie konstruktor O / N w RT.</li>
	<li>Osadzanie włókien IPC w rusztowaniu hydrożelowym PD</li>
	<li>Aby usieciować każdy gram roztworu pullulanu-dekstranu, należy dodać 100 μl 11% (w/v) wodnego roztworu trimetafosforanu sodu i 100 μl 10M wodorotlenku sodu. 7 Mieszaj roztwór przy 60 obr./min za pomocą mieszadła przez 1 do 2 minut. Po dodaniu trimetafosforanu sodu i wodorotlenku sodu roztwór polisacharydu usieciuje się niemal natychmiast. Wlej lepki roztwór polisacharydu na konstrukcję włókien na ramie, aby w pełni osadzić włókna IPC. Inkubować połączone włókna pullulan-dektran-IPC (PD-IPC) w temperaturze 60 °C przez 30 minut, aby utworzyć chemicznie usieciowane rusztowania kompozytowe (ryc. 1B).</li>
	<li>UWAGA: Wykonaj krok 3.3.2 w dygestoriach i użyj odpowiedniego sprzętu ochronnego, ponieważ kwas octowy jest substancją i łatwopalną.</li>
	<li>W celu wywołania tworzenia się porów w rusztowaniu PD-IPC należy zanurzyć całe rusztowanie w 20% (w/v) kwasie octowym na 20 minut.</li>
	<li>Usunąć nieprzereagowane odczynniki, myjąc rusztowania PD-IPC w 1X PBS przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 100 obr./min. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Usunąć nadmiar PBS i natychmiast zamrozić rusztowania PD-IPC w temperaturze -80 °C O/N. Liofilizować rusztowania co najmniej 24 godziny przed użyciem w jakichkolwiek testach kontrolowanego uwalniania lub bioaktywności.</li>
</ol>
4. Produkcja rusztowań kompozytowych z włókien PCL i IPC
UWAGA: Dichlorometan jest materiałem niebezpiecznym. Podczas obchodzenia się z dichlorometanem należy używać dygestorium i środków ochrony osobistej. 
<ol>
	<li>Tworzenie nieskazitelnych i wzorzystych podłoży PDMS
	<ol>
		<li>Stwórz nieskazitelne podłoże elastomerowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) za pomocą kawałka TCPS o pożądanym wymiarze, korzystając z procesu miękkiej litografii. Twórz wzorzyste podłoża PDMS przy użyciu standardowych metod miękkiej litografii na szablonach z poli(metakrylanu metylu) o pożądanej topografii. 12</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie protektorowej ramy PCL do zbierania włókien IPC
	<ol>
		<li>Odważyć PCL i rozpuścić w dichlorometanie, aby uzyskać 0,9% (w/v) roztwór. Na każde 1cm2 powierzchni podłoża PDMS upuść 500 μl 0,9% roztworu PCL. Pozwolić, aby cały rozpuszczalnik dichlorometanu całkowicie odparował w dygestorium. Powtórz proces odlewania 0,9% PCL, aby zagęścić folię do pożądanej grubości. Usuń wysuszoną folię PCL z podłoża PDMS. Utwórz otwór w ramie PCL za pomocą dziurkacza o odpowiedniej wielkości. cyfra arabska</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie włókien IPC na ramie PCL
	<ol>
		<li>Przymocować protektorową ramę PCL z otworem (od 4.2.1) do zacisku krokodylkowego. Przyklej zacisk krokodylkowy do obracającego się trzpienia za pomocą taśmy klejącej pokrytej tworzywem sztucznym. Przymocuj narysowany koniec światłowodu IPC do ramy PCL przed rozpoczęciem obrotu ze stałą prędkością 10 mm/s (sekcja 2). Po zakończeniu ciągnienia włókien IPC wysuszyć konstrukcję światłowodową na ramie O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie konstrukcji światłowodowej na ramie w wzorzystym podłożu PCL
	<ol>
		<li>Upuść 500 μl 0,9% roztworu PCL na podłoże PDMS, aby stworzyć nieskazitelną lub wzorzystą bazę PCL, zgodnie z wymaganiami. Odlewać wiele warstw 0,9% roztworu PCL, aby uzyskać rusztowanie o pożądanej grubości. Pozwolić, aby cały rozpuszczalnik dichlorometanu całkowicie odparował w dygestorium.</li>
		<li>Umieść konstrukcję fiber-on-frame (sekcja 4.3.1) na górze podstawy PCL. Kilkakrotnie dodać 0,9% roztwór PCL do konstrukcji fiber-on-frame, aby uzyskać pożądaną grubość i w pełni osadzić włókna IPC, tworząc rusztowanie kompozytowe PCL-IPC (rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar uwalniania czynników biologicznych z kompozytowych rusztowań IPC
<ol>
	<li>Kompozytowe rusztowania PD-IPC lub PCL-IPC oraz samodzielne włókna IPC należy umieszczać oddzielnie w płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Zanurz rusztowanie i samodzielne włókna IPC w 500 μl 1X PBS. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C. Zebrać PBS w różnych punktach czasowych (pożywka antyadhezyjna) i zastąpić 500 μl 1X PBS.</li>
	<li>Zmierzyć ilość białka lub czynnika wzrostu w pożywce uwalniającej za pomocą testu BCA (BSA), ELISA (VEGF i NGF) lub innego odpowiedniego testu w celu obliczenia profilu łącznego uwalniania dla włączonej biocząsteczki.</li>
</ol>
6. Wysiewanie komórek na kompozytowych rusztowaniach IPC w celu zbadania bioaktywności uwolnionych czynników biologicznych
<ol>
	<li>Sterylizować liofilizowane rusztowania kompozytowe PD-IPC lub PCL-IPC za pomocą światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Stosować standardowe techniki hodowli komórkowej, aby uzyskać zawiesinę komórkową składającą się z 2 x 105 komórek w pożywce wzrostowej o objętości 200 μl. Zasiądź skoncentrowaną zawiesinę komórkową na rusztowaniach kompozytowych. Po 20 minutach uzupełnij objętość pożywki wzrostowej, aby całkowicie zanurzyć rusztowania.</li>
	<li>Mierz aktywność komórek za pomocą standardowych technik, takich jak test aktywności metabolicznej błękitu Alamar, test wzrostu neurytów PC12 lub immunofluorescencja.</li>
</ol>

<ol><li>Annabi, N., Tamayol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+Anniversary+Article%3A+Rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).</li>
<li>Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synergistic+effect+of+nanotopography+and+sustained+dual+release+of+hydrophobic+and+hydrophilic+neurotrophic+factors+on+human+mesenchymal+stem+cell+neuronal+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).</li>
<li>Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery-based+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments.</a> J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+vascular+endothelial+growth+factor+delivery+enhances+angiogenesis+and+perfusion+in+ischemic+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb.</a> Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).</li>
<li>Rui, J., Dadsetan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>King, T. W., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+in+vitro+characterization+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-loaded+poly%28DL-lactic-co-glycolic+acid%29%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+microspheres+using+a+solid+encapsulation%2Fsingle+emulsion%2Fsolvent+extraction+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique.</a> J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).</li>
<li>Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+pullulan-dextran+polysaccharide+scaffold+with+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibers%3A+A+platform+with+enhanced+cell+interaction+and+spatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution.</a> Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).</li>
<li>Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+fibrous+scaffold+for+spatial+organization+of+encapsulated+and+seeded+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).</li>
<li>Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cell+encapsulated+in+polyelectrolyte+complexation+fibrous+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold.</a> Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).</li>
<li>Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+from+fibers+of+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes.</a> J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).</li>
<li>Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+fiber+formation+by+interfacial+polyelectrolyte+complexation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation.</a> Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).</li>
<li>Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).</li>
<li>Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+evaluation+of+NGF-microsphere+conduits+for+regeneration+of+defective+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves.</a> Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).</li>
<li>Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated-PLGA+microparticles+containing+VEGF+for+long+term+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery.</a> Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).</li>
<li>Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+from+gelatin+microparticles+and+biodegradable+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds.</a> Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).</li>
<li>Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+the+effects+of+various+additives+and+polymers+on+nerve+growth+factor+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Int.+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres.</a> Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).</li>
<li>Lee, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+drug+release+from+hydrogel+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Kinetics of drug release from hydrogel matrices.</a> J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).</li>
<li>Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+of+poly%28vinyl+alcohol%29+and+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibers+for+controlled+biomolecule+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Bioeng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery.</a> Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).</li>
<li>Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Electroactive+Polypyrrole-Collagen+Fibrous+Scaffold+for+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering.</a> Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).</li>
<li>Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+prevascularised+tissue+constructs+by+assembly+of+polyelectrolyte+hydrogel+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres.</a> Nat. Commun. 4, 2353(2013).</li>
<li>Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+polyacrylamide+hydrogels+by+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography.</a> Nanotechnology. 16 (5), S165(2005).</li>
<li>Revzin, A., Russell, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogel+microstructures+using+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography.</a> Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).</li>
<li>Yim, E. K. F., Liao, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compatibility+of+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibrous+scaffold%3A+evaluation+of+blood+compatibility+and+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility.</a> Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).</li>
<li>Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+a+small-diameter+polysaccharide-based+arterial+graft+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats.</a> Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).</li>
<li>Eshraghi, S., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+microstructural+properties+of+polycaprolactone+scaffolds+with+one-dimensional%2C+two+dimensional%2C+and+three-dimensional+orthogonally+oriented+porous+architectures+produced+by+selective+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering.</a> Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Włókna IPC powstają w wyniku interakcji dwóch przeciwnie naładowanych polielektrolitów. Proces wykorzystuje ekstrakcję kompleksu z granicy faz polielektrolitów, ułatwiając proces samoorganizacji w celu stabilnego tworzenia włókien. Mechanizm powstawania włókien IPC zapewnia, że każda biomolekuła dodana do podobnie naładowanego polielektrolitu może zostać włączona podczas procesu kompleksowania. 10,11 I odwrotnie, dodanie biomolekuły do przeciwnie naładowanego polielektrolitu spowoduje natychmiastowe wytrącenie...

Macierz zewnątrzkomórkowa ma wrodzone biochemiczne i biofizyczne wskazówki, które kierują zachowaniem komórki. Naśladowanie tego fizjologicznego trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska jest szeroko badaną strategią w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Na przykład zarówno podłoża pochodzenia naturalnego, jak i syntetycznego zostały zmodyfikowane za pomocą wskazówek topograficznych jako sposób na naśladowanie biofizycznego środowiska komórkowego. 1 Na przykład rusztowania polikaprolaktonowe (PCL) można łatwo modelować, odlewając je na wzorzystych podłożach PDMS. 2 Jednak większość syntetycznych rusztowań nieodpowiednio podsumowuje kontrolowane środowisko biochemiczne in vivo. Modyfikacje masowe lub powierzchniowe materiałów syntetycznych wykazują jedynie biochemiczne wskazówki dotyczące przyłączania komórek, ale nadal brakuje czasowej regulacji dostarczania biochemicznego. 3 W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na optymalne rusztowania, które mogą naśladować czasowo regulowany biochemiczny system dostarczania macierzy zewnątrzkomórkowej. 
Biochemiczne systemy dostarczania, takie jak mikrosfery, są nękane problemami utraty bioaktywności i niską wydajnością inkorporacji ze względu na dotkliwość i złożoność wieloetapowego procesu syntezy. 4-6 Udowodniono, że alternatywne metody, które wykorzystują jednoetapową metodę wytwarzania i włączania, mają doskonały potencjał w tworzeniu korzystnego mikrośrodowiska biochemicznego bez towarzyszącej mu nieefektywności inkorporacji i utraty bioaktywności. Jednym z realnych rozwiązań jest zastosowanie włókien kompleksowania międzyfazowego polielektrolitu (IPC) do dostarczania i ochrony czynników biologicznych. Po połączeniu dwóch przeciwnie naładowanych wodnych roztworów polielektrolitu można wyciągnąć włókna IPC z interfejsu. Praktycznie każdy rodzaj biomolekuły hydrofilnej w roztworze wodnym może być dodany do ujemnie lub dodatnio naładowanego roztworu polielektrolitu, ułatwiając w ten sposób włączenie użytecznych biomolekuł do włókna IPC podczas procesu kompleksowania. Co więcej, proces ten wymaga jedynie warunków wodnych i otoczenia, co zmniejsza ryzyko utraty bioaktywności. Za pomocą tej metody udało się dostarczyć aktywne czynniki wzrostu2,7 nawet komórki8,9. Ponadto prosta metoda formowania włókien IPC pozwala na formowanie w dowolny kształt i orientację. Stabilność takich włókien była korzystna w ich włączaniu zarówno do polimerów hydrofobowych2, jak i hydrofilowych7 w celu tworzenia rusztowań kompozytowych. Te kompozytowe rusztowania z włóknami IPC są korzystne dla tworzenia fizjologicznie istotnego środowiska biochemicznego, zapewniając jednocześnie fizyczne zakotwiczenie komórek. 
W tym badaniu pokazujemy metodę włączania włókien IPC do hydrofilowego i hydrofobowego rusztowania z topografią w celu kontrolowanego uwalniania aktywnych biomolekuł. Jako dowód słuszności koncepcji, włączamy włókna IPC wykonane z chitozanu i alginianu do biokompatybilnego, nieimmunogennego i nieantygenowego hydrofilowego hydrożelu pullulan-dekstran lub biokompatybilnego hydrofobowego rusztowania polikaprolaktonowego.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Japonia</td><td></td><td>Masa cząsteczkowa (MW) 200 kDa. Materiał ten to pullulan klasy farmaceutycznej używany do produkcji ram pullulan i rusztowań PD-IPC.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Materiał ten nie jest już produkowany przez Sigma Aldrich. Alternatywnie sugerowany jest numer katalogowy 31392 (Sigma Aldrich). Materiał ten służy do produkcji rusztowań PD-IPC.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Wodorowęglan sodu należy powoli dodawać do roztworu polisacharydów pullulan-dekstran. Szybkie dodanie wodorowęglanu sodu spowoduje wytrącanie się.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trimetafosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Ta substancja chemiczna jest higroskopijna i musi być przechowywana w szafie osuszającej. Wodny roztwór trimetafosforanu sodu musi być zawsze świeży.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Ten materiał jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawice nitrylowe.</td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Stopień acetylacji od 75% do 85%. Oczyszczanie chitozanu jest wymagane do wytworzenia stabilnych włókien IPC.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td></td><td>Można go zastąpić innym typem marki. Ten materiał jest i łatwopalny. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną w dygestoriach należy nosić sprzęt ochronny, taki jak osłona twarzy, rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i pokrowiec na buty.</td></tr><tr><td>Kwas alginowy sól sodowa z alg brunatnych, niska lepkość</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Rozpuścić w wodzie na noc. Przefiltruj przez sterylne 0,2&nbsp; &mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sinopharm Odczynnik</td><td></td> chemiczny <td>Rozpuścić w sterylnym PBS i przefiltrować za pomocą 0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zestaw testowy BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Ten zestaw służył do pomiaru uwalniania BSA z rusztowań PD-IPC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego</td><td>R& Systemy D</td><td>293-VE</td><td>Rozpuszczają czynnik wzrostu w 0,2% roztworze heparyny do końcowego stężenia 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa z wieprzowiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Można ją zastąpić innym typem marki. Rozpuść sól heparyny w sterylnej wodzie o końcowym stężeniu 1% i przefiltruj przez 0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem.</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Ten pierwotny typ komórek został wykorzystany w teście do określenia bioaktywności VEGF po uwolnieniu z rusztowań PD-IPC.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Służy do pomiaru aktywności metabolicznej komórek. Inkubuj błękit Alamar z komórkami i utrzymuj w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 2 do 4 godzin. Zmierz absorbancję przy 570 nm, aby określić procentową redukcję błękitu Alamar, która jest skorelowana z aktywnością komórki.</td></tr><tr><td>Liofilizator ScanVac Coolsafe</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Jest to nieprogramowalny liofilizator, który działa w zakresie od -105 do -110&nbsp; &deg;C. Można go zastąpić innymi standardowymi liofilizatorami laboratoryjnymi.</td></tr><tr><td>Polikaprolakton (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Nie jest on już produkowany przez Sigma Aldrich. Można go zastąpić numerem katalogowym Sigma Aldrich 704105.</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Można go zastąpić innym typem marki. Materiał ten jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS; zestaw elastomerów silikonowych 184)Dow</td> <td>Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Zestaw elastomerów jest dostarczany z bazą polimerową i środkiem sieciującym. Mieszanie bazy polimerowej i środka sieciującego w różnych proporcjach spowoduje różną sztywność PDMS.</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu nerwów beta (NGF)</td><td>R& Systemy D</td><td>256-GF</td><td>Rozpuszczony w sterylnej wodzie demineralizowanej do końcowego stężenia 100&nbsp; &mikro; g&#8288;/&#8288;ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Ten typ komórek został wykorzystany w teście w celu określenia synergicznego efektu NGF i nanotopografii.</td></tr><tr><td>Szczurze komórki guza chromochłonnego PC12&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Ten typ komórek został wykorzystany w teście wzrostu neurytów w celu określenia bioaktywności NGF. Po ekspozycji na pożywkę antyadhezyjną z NGF zmierz liczbę komórek z rozszerzeniami neurytów i znormalizuj do całkowitej liczby komórek.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna klasy 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Służy do oczyszczania chitozanu po jego wytrąceniu wodorotlenkiem sodu o pH&nbsp;7.</td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Do stosowania podczas oczyszczania chitozanu przy użyciu prędkości 1 200 x g.</td></tr><tr><td>Silnik z trzpieniem obracającym się ze stałą prędkością</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>Silnik służy do wytwarzania włókien IPC na ramie pullulan lub PCL.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Sterylizować przez filtrację (0,2 &mikro; m filtr) i autoklaw.&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie z polistyrenu do kultur tkankowych o średnicy 10 mm (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>Naczynie TCPS służy do odlewania ramy pullulanowej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzki zestaw VEGF ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DVE00</td><td>Zestaw ELISA służy do wykrywania VEGF w podłożu antyadhezyjnym.</td></tr><tr><td>Ludzki zestaw NGF ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DY256</td><td>Zestaw ELISA służy do wykrywania NGF w medium uwalniającym.</td></tr><tr><td>Taśma klejąca powlekana tworzywem sztucznym</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>Taśma klejąca służy do bezpiecznego przyklejenia zacisku krokodylkowego do obracającego się trzpienia</td></tr></tbody></table>

rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Różne rusztowania używane w inżynierii tkankowej wymagają kontrolowanego środowiska biochemicznego, aby naśladować fizjologiczną niszę komórkową. Włókna międzyfazowego kompleksowania polielektrolitów (IPC) mogą być stosowane do kontrolowanego dostarczania różnych czynników biologicznych, takich jak leki małocząsteczkowe, komórki, białka i czynniki wzrostu. Prostota metodologii wytwarzania włókien IPC daje elastyczność w jej zastosowaniu do kontrolowanego dostarczania biomolekuł. W tym miejscu opisujemy metodę włączania włókien IPC do dwóch różnych rusztowań polimerowych, hydrofilowego polisacharydu i hydrofobowego polikaprolaktonu, w celu stworzenia wieloskładnikowego rusztowania kompozytowego. Wykazaliśmy, że włókna IPC można łatwo osadzić w tych strukturach polimerowych, zwiększając zdolność do przedłużonego uwalniania i poprawiając zachowanie biomolekuł. Stworzyliśmy również kompozytowe rusztowanie polimerowe ze wskazówkami topograficznymi i przedłużonym uwalnianiem biochemicznym, które może mieć synergiczny wpływ na zachowanie komórek. Kompozytowe rusztowania polimerowe z włóknami IPC stanowią nowatorską i prostą metodę odtwarzania niszy komórkowej.

W niniejszym artykule dążyliśmy do stworzenia rusztowań kompozytowych z włóknami IPC do przedłużonego uwalniania różnych biomolekuł. Charakterystyka biomolekuł wykorzystanych w tej badaniu znajduje się w Tabeli 1. Włókna IPC osadzono najpierw w hydrofilowym hydrożelu PD, aby stworzyć kompozytowe rusztowanie PD-IPC (Rysunek 1B). W celu sprawdzenia wykonalności zastosowania rusztowania kompozytowego do kontrolowanego uwalniania biomolekuł, w pierwszej kolejności przetestowano cząsteczkę mo...

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie kontrolowanego dostarczania biomolekuł z kontrolą przestrzenną w celu odwzorowania niszy komórkowej za pomocą hydrofilowych lub hydrofobowych kompozytowych rusztowań polimerowych. Osiąga się to najpierw poprzez stworzenie poświęcalnego szkieletu z wybranych polimerów, aby zapewnić przestrzenne rozmieszczenie włókien uwalniających biomolekuły, nazywanych polielektrolitami międzyfazowymi lub włóknami IPC. Drugim krokiem jest wbudowanie włókien IPC zawierających docelową hydrofilową biomolekułę na poświęcalnym szkieletie.Następnie włókna IPC na konstrukcjach ramowych są osadzane na większym rusztowaniu przy użyciu podłoża z mikrowzorcem pełniącym rolę formy odlewniczej, która wprowadza na podłoże sygnały topograficzne. Ostatnim krokiem jest umożliwienie pełnej asymilacji włókien na konstrukcji ramowej oraz zestalenie polimerów w celu utworzenia podłoży bez wzoru lub z mikrowzorcem. W końcowej fazie można zastosować standardowe analizy, aby wykazać profile uwalniania i bioaktywność cząsteczek docelowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak mikroenkapsulacja, jest możliwość wbudowania hydrofilowych biomolekuł w szeroką gamę hydrofilowych lub hydrofobowych rusztowań polimerowych w ramach prostego procesu inkorporacji i wytwarzania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, w tym dotyczące regulowanego uwalniania wielu substancji biochemicznych, gradientów biochemicznych oraz synergistycznego wpływu wskazówek topograficznych i przedłużonego uwalniania substancji biochemicznych na zachowanie komórek. Wizualna prezentacja procesu tworzenia włókien polielektrolitowych jest kluczowa, ponieważ poszczególne etapy są trudne do opanowania.Szybkość, stężenie i czystość roztworu polielektrolitu są kluczowe dla stabilnego formowania włókien IPC. Aby rozpocząć, należy zmieszać białka, czynniki wzrostu lub inne interesujące biomolekuły w alikwotach od 10 do 20 µL roztworów polielektrolitów, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy nanieść małe krople chitozanu i alginianu o objętości od 10 do 20 µL na stabilną, płaską powierzchnię pokrytą parafirmą. Krople chitozanu i alginianu powinny zostać umieszczone blisko siebie, ale nie mogą się ze sobą stykać.Lekko zanurz jeden koniec pęsety w kropli piasku kite, a drugi koniec w kropli alginianu. Następnie zbliż do siebie krople polielektrolitów, ściskając pęsetę. Gdy krople wejdą ze sobą w kontakt, powoli pociągnij pęsetę pionowo w górę, aby wyciągnąć z powierzchni styku obu kropli włókno kompleksowe polielektrolitów międzyfazowych, znane jako włókno IPC.Koniec wyciągniętego włókna IPC należy ostrożnie umieścić na kolektorze składającym się z płaskiego rusztowania polimerowego przymocowanego do obracającego się trzpienia. Trzpieniem należy obracać ze stałą prędkością 10 millimeters per second, aby umożliwić formowanie jednorodnych włókien IPC bez grudek. Zwiększenie prędkości wyciągania włókien IPC spowoduje powstanie grudek, co doprowadzi do gwałtownego uwolnienia włączonych substancji biochemicznych oraz przedwczesnego przerwania formowania włókna.Zgodnie z obserwacjami liao et al. oraz KO et al., po zakończeniu przędzenia włókien należy rozcieńczyć pozostały płyn 500 µL PBS, a następnie zmierzyć stężenie pozostałego białka lub czynnika wzrostu w pozostałości. W celu określenia wydajności inkorporacji biomolekuł, należy odważyć 3 g polisacharydu z Polski i dodać go do 15 mL destylowanej wody dejonizowanej.Aby przygotować 20% roztwór wodny, mieszać roztwór Poland przez noc, aby zapewnić jego jednorodność następnego dnia. Wlać 15 ml roztworu Poland do szalki z polistyrenu do hodowli tkanek o średnicy 10 cm. Suszyć roztwór przez noc w temperaturze 37°C; po wyschnięciu wyciąć z folii kwadratowe ramki poświęcalne Poland o wymiarach 7 mm na 7 mm.Następnie przygotuj 30% roztwór polisacharydów: pululanu i dekstryny w wodzie destylowanej i dejonizowanej w stosunku trzy do jednego. Mieszaj przez noc, aby zapewnić jednorodność. Powoli dodawaj wodorowęglan sodu do roztworu polisacharydów, aby uzyskać stężenie końcowe 20%. Mieszaj roztwór przez noc i przechowuj końcowy roztwór polisacharydów w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Przymocuj poświęcalną ramkę z pululanu w pożądanej orientacji do obrotowego trzpienia, używając klipsa typu krokodylk oraz plastikowej taśmy klejącej.Obracaj trzpień z przymocowaną ramką ze stałą prędkością 10 mm/s. Następnie rozpocznij wyciąganie włókien IPC zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Tym razem jednak przymocuj wyciągnięty koniec włókien IPC do obracającej się ramki.Następnie należy odczekać do zakończenia procesu wyciągania włókien IPC. Włókna na konstrukcji ramy należy suszyć przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie należy zwolnić konstrukcję z obrotowego trzpienia, zdejmując ją z klipsa krokodylka.Umieść konstrukt w zakrętce probówki do mikrocentryfugi. Następnie odważ pięć gramów roztworu dekstryny Poland do zlewki i rozpocznij mieszanie z prędkością 60 RPMs. Korzystając z mieszadła magnetycznego, dodaj 500 µL 11% roztworu trimetafosforanu sodu oraz 500 µL 10 M wodorotlenku sodu.Aby doprowadzić do sieciowania roztworu, należy kontynuować jego mieszanie przez jedną do dwóch minut, a następnie wylać lepki roztwór polisacharydowy na włókna w konstrukcji ramowej, aby całkowicie zatopić włókna IPC. Konstrukcję inkubuje się w temperaturze 60 °C przez 30 minut w celu utworzenia chemicznie sieciowanego rusztowania kompozytowego, co indukuje powstawanie porów w rusztowaniu kompozytowym.Zanurz cały rusztowanie w 20% roztworze kwasu octowego na 20 minut. Następnie przemyj rusztowanie trzykrotnie w PBS przez pięć minut, wstrząsając z prędkością 100 RPMs. Aby usunąć wszelkie pozostałe niereaktywne odczynniki, odlej nadmiar PBS i natychmiast zamroź rusztowania kompozytowe w temperaturze minus 80 °C na noc.Następnie liofilizuj rusztowania przez co najmniej 24 godziny przed ich wykorzystaniem w jakichkolwiek testach uwalniania kontrolowanego lub testach bioaktywności. Rozpocznij od utworzenia czystego i wzorowanego podłoża z PDMS o pożądanej topografii, stosując standardowe metody miękkiej litografii. Następnie przygotuj zarówno poświęcającą ramkę z PCL do zbierania włókien IPC, jak i wzorowaną podstawę z PCL, rozpuszczając najpierw 0,9% PCL w dichlorometanie.Na każdy centymetr kwadratowy powierzchni formy do odlewania filmu z PDMS nanieś 500 µL 0,9% roztworu PCL. Pozostaw rozpuszczalnik do całkowitego odparowania w dygestorium, a następnie powtórz proces odlewania 0,9% PCL w celu pogrubienia filmu. Następnie przygotuj ramkę poświęcalną, nakładając po 500 µL 0,9% roztworu PCL na oddzielny, czysty podłoże z PDMS.Aby utworzyć czystą podstawę z PCL, należy odlać kilka warstw PCL, aż do uzyskania rusztowania o pożądanej grubości. Po osiągnięciu odpowiedniej grubości należy odczekać w dygestorium do całkowitego odparowania rozpuszczalnika w postaci chlorometanu. Następnie należy zdjąć wysuszoną błonę PCL z czystego podłoża z PDMS i wyciąć otwór w ramce z PCL za pomocą wycinaka o rozmiarze PSAP.Następnie zamocuj ramkę z PCL na trzpieniu zbierającym i rozpocznij nawijanie włókna IPC na ramkę zgodnie z wcześniejszym opisem. Po zakończeniu nawijania włókna IPC zdejmij konstrukcję włókna na ramce i pozostaw ją do wyschnięcia przez noc w temperaturze 25 °C. Umieść konstrukcję włókna na ramce na wierzchu wzorowanej podstawy z PCL i kilkukrotnie nanieś 0,9% roztwór PCL na konstrukcję włókna na ramce, aby uzyskać pożądaną grubość i zapewnić pełne zatopienie włókien IPC.Seryjna albumina wołowa lub BSA uwalniana z kompozytu dekstryny IPD z Polski wykazała niemal liniową kinetykę z początkowo osłabionym gwałtownym uwalnianiem (burst release), po którym nastąpił towarzyszący mu stan stacjonarny. Po dwóch miesiącach całkowity stopień uwalniania BSA osiągnął 97%. W przeciwieństwie do tego, samodzielne włókna IPC wykazały szybkie uwalnianie 80% BSA w ciągu czterech godzin. Z wykorzystaniem tego samego kompozytu możliwe było również zrównoważone uwalnianie czynnika wzrostu naczyniowego z włókien, przy zastosowaniu ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej jako platformy testowej.Stwierdzono, że uwolniony czynnik wzrostu zachowywał aktywność biologiczną po każdym punkcie czasowym uwalniania. W tym przykładzie czynnik wzrostu nerwów został wprowadzony do włókien w ciągu 18 dni. Około 80% załadowanego czynnika wzrostu nerwów zostało uwolnione z kompozytu P-C-L-I-P-C w sposób ciągły i liniowy, co potwierdzono za pomocą testu wypustek neurytów komórek PC 12.Ilość bioaktywnego czynnika wzrostu nerwów uwalnianego z rusztowania do pożywki w każdym punkcie czasowym miała podobny wpływ na wzrost neurytów, jak dodanie 30 ng/ml czynnika wzrostu nerwów do zwykłej pożywki. Kompozytowe rusztowania P-C-L-I-P-C, które łączą topografię z kontrolowanym uwalnianiem czynnika wzrostu nerwów, mogą wywierać synergistyczny wpływ na zachowanie komórek. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste hodowane na nanostrukturalnych rusztowaniach kompozytowych wykazały wyższy poziom różnicowania neuronalnego w porównaniu z komórkami poddanymi działaniu samej topografii lub samego czynnika wzrostu.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wymieszaniu pożądanej cząsteczki hydrofilowej z roztworem polielektrolitu o tym samym ładunku netto, aby włączyć ją do włókien. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia kompozytowych rusztowań polimerowych z możliwością kontrolowanego uwalniania cząsteczek. Wiedza przekazana w tym filmie powinna umożliwić Państwu stworzenie rusztowania płucnego z możliwością przedłużonego uwalniania czynnika wzrostu, uwalniania wielu czynników wzrostu oraz stworzenie gradientu sygnałów biochemicznych, które odtworzą niszę fizjologiczną.Należy pamiętać, że praca z kwasem octowym, wodorotlenkiem sodu i chlorkiem metylu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony indywidualnej oraz praca w dygestorium.

composite-scaffolds-interfacial-polyelectrolyte-fibers-for-temporally

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub...

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Interesujące są rusztowania zdolne do dopasowania się do ubytków kostnych czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), wykazując jednocześnie osteoprzewodnictwo i bioaktywność. Protokół ten opisuje przygotowanie rusztowania z pamięcią kształtu na bazie dikrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnikiem i ługowania cząstek stałych (SCPL) z wykorzystaniem stopionej matrycy solnej i nałożeniu bioaktywnej powłoki polidopaminowej .

Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

W tej pracy, rusztowania z poli(kwasu mlekowego)/glikolu polietylenowego (PLA/PEG) zostały przygotowane przy użyciu kombinacji mieszania stopionego i selektywnego ługowania. Omawiana tu metoda pozwoliła na opracowanie rusztowań trójwarstwowych poprzez ścisłą kontrolę zarówno porowatości, jak i wielkości porów. Właściwości mechaniczne oceniano również w środowisku fizjologicznym.

Łatwa i przyjazna dla środowiska metoda wytwarzania rusztowań z poli(kwasu mlekowego) o stopniowanej wielkości porów

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Poznaj metodę tworzenia rusztowań polimerowych z włóknami IPC do kontrolowanego uwalniania biomolekuł w inżynierii tkankowej. Technika umożliwia naśladowanie niszy komórkowej.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Przeglądaj więcej filmów