Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis
5 października 2015
Zakażenie gruźlicą u ludzi jest złożonym procesem, który jest trudny do modelowania in vitro. W tym miejscu opisujemy nowatorski model 3D ludzkiej tkanki płucnej, który podsumowuje dynamikę zachodzącą podczas infekcji, w tym migrację komórek odpornościowych i wczesne tworzenie ziarniniaka w środowisku fizjologicznym.
Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie modelu tkanki płucnej in vitro do badań nad zakażeniem gruźlicą M. Osiąga się to poprzez uprzednie nałożenie macierzy kolagenowej fibroblastów na filtr wkładki płytki do hodowli komórkowej. W drugim etapie zakażone komórki układu odpornościowego i nabłonka płuc są osadzane na warstwie kolagenu fibroblastów.
Uzyskany w ten sposób model tkanki 3D jest następnie poddawany działaniu powietrza, aby ułatwić wydzielanie śluzu i stratyfikację nabłonka. W ostatnim etapie tkanka jest pobierana i montowana. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna służy do analizy powstawania wczesnego ziarniniaka wywołanego gruźlicą M.
Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak monowarstwa komórek in vitro, jest to, że komórki w tym systemie są obecne w mikrośrodowisku 3D, co pozwala na tworzenie się ziarniniaków po zakażeniu zjadliwymi mikrobakteriami przypominającymi ludzką gruźlicę Aby przygotować fibroblasty osadzone w kolagenie, zacznij od traktowania komórek fibroblastów płuc tripyną przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy komórki się odłączą, Zatrzymaj reakcję za pomocą ośmiu mililitrów kompletnego DMEM, a następnie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić granulki w ilości 230 000 komórek na mililitr w świeżym DMM i umieścić komórki na lodzie. Następnie dodaj jedną wkładkę na studzienkę do szóstki.
Dobrze utrzyj na płytce i dozuj jeden mililitr świeżo przygotowanej mieszaniny warstwy komórkowej do każdej wkładki, upewniając się, że mieszanina pokrywa całą wkładkę bez pęcherzyków powietrza. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Pod koniec inkubacji wymieszaj dwa mililitry kolagenu z 615 mikrolitrami premiksu w sterylnej stożkowej probówce na lodzie, aby zneutralizować pH kolagenu na wkładkę.
Następnie do mieszaniny kolagenu dodać 58 mikrolitrów kompletnego DMEM i 327 mikrolitrów fibroblastów płuc na wkładkę. Pipetowanie w górę i w dół w celu równomiernego rozprowadzenia komórek w całej mieszaninie. Teraz szybko dodaj trzy mililitry warstwy komórkowej z boku każdej wkładki do każdej warstwy kolagenu bezkomórkowego.
Uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na kolejne dwie godziny. Po polimeryzacji kolagenu dodaj dwa mililitry kompletnego dmem na dno każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 24 godziny. Następnego dnia użyj pary czystych kleszczy, aby ostrożnie podnieść wkładki pojedynczo i zassać pożywkę hodowlaną od spodu każdej z nich.
Następnie dodaj dwa mililitry kompletnego DMM na dno każdej studzienki i dwa mililitry kompletnego DMM do każdej wkładki. Zmiana obu objętości podłoża co drugi dzień przez pięć do siedmiu dni. Aby przygotować zakażone makrofagi, należy rozpocząć od inkubacji kultury makrofagów przez cztery godziny ze zjadliwą gruźlicą M przy wielokrotności infekcji wynoszącej 10.
Pod koniec inkubacji przemyj komórki trzykrotnie PBS w celu usunięcia bakterii zewnątrzkomórkowych i potraktuj makrofagi dwoma milimolowymi A DTA przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki oderwą się od żywicy, zawieś je w kompletnym DMM wolnym od antybiotyków. Następnie odessać całą pożywkę z płytki macierzy kolagenowej fibroblastów i dodać 1,5 mililitra świeżego, kompletnego DMM bez antybiotyków do komór zewnętrznych.
Następnie wymieszaj znakowane fluorescencyjnie monocyty z zakażonymi makrofagami w stosunku pięć do jednego w 50 mikrolitrach kompletnego DM EM bez antybiotyków na insert. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny makrofagów monocytów do wnętrza każdej wkładki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Po godzinie powoli dodaj dwa mililitry kultury, pośrodkuj ścianki wkładek, aby uniknąć przemieszczenia komórek i inkubuj kultury przez kolejne 24 godziny.
Aby wysiać kultury komórkami nabłonka płuc, dodaj 4 miliony komórek nabłonkowych na mililitr w 50 mikrolitrach kompletnego DMM na wierzch matryc kolagenowych fibroblastów komórek odpornościowych. Inkubuj komórki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry kompletnego DMM bez antybiotyków do wkładek, jak właśnie pokazano, i hoduj komórki przez kolejne trzy dni.
Pięć dni po wysianiu zakażone makrofagi odsysają całą pożywkę hodowlaną z płytki i dodają 1,8 mililitra wolnego od antybiotyków, kompletnego DMM do komór zewnętrznych. Następnie modele tkanek 3D w inkubatorze były wystawione na działanie powietrza przez dwa dni bez dodawania pożywki do wkładki w siódmym dniu. Po wysiewie.
Całkowicie usunąć podłoże z płytki i mieszać modele tkanek z 4% paraldehydem przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie za pomocą skalpela oddziel membrany od wkładów studzienkowych. Następnie za pomocą czystego skalpela ostrożnie usuń boki modeli tkanek i pokrój każdą tkankę na cztery w przybliżeniu równej wielkości kwadratowe kawałki.
Przełóż kawałki na szkiełka super frosts i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut. Następnie za pomocą montażu fluorescencyjnego, medium zawierającego anti fade i dpi, zamontuj chusteczki i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności, aż wyschną, a następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
Po wyschnięciu lakieru zanurz szkiełka w 70% etanolu w celu przeniesienia z zakładu BSL three. Aby zobrazować tkanki, uzyskaj obrazy 3D od pięciu do 10 różnych pól pokrywających cały fragment tkanki w rozdzielczości 512 na 512, przy czym Zack pokrywa o grubości co najmniej 20 mikronów z separacją od jednego do 1,5 mikrona między stosami na fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym w celu ilościowej identyfikacji 3D klastrów komórek. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu 3D i załaduj interesujący Cię obraz.
Następnie, korzystając z narzędzia do regulacji wyświetlania, dostosuj każdy kanał pod kątem obrazu, kontrastu, jasności i krycia mieszania, aby zoptymalizować renderowanie głośności i zminimalizować zakłócenia szumów. Następnie, aby uwidocznić powierzchnię tkanki, wybierz czerwony kanał monocytów i ustaw odpowiednie progi za pomocą filtrów, aby ograniczyć wybór czerwonych monocytów lub w razie potrzeby wykluczyć tło. Na koniec wyeksportuj dane do odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
Siódmego dnia, mikroskopia konfokalna po zakażeniu gruźlicą M ujawnia skupienie czerwonych monocytów w miejscu infekcji, co zauważa obecność zielonych bakterii naśladujących zmiany w ludzkiej gruźlicy, znane jako ziarniniak 3D. Wizualizacja zapewnia elastyczność interakcji, badania i ilościowego określania kilku cech. Na przykład obraz 3D na tych obrazach przedstawiający skupisko monocytów w miejscu gruźlicy.
Przestrzenne rozmieszczenie zielonych bakterii i czerwonych skupisk monocytów można obserwować z widoku wierzchołkowego, rotacyjnego i bocznego. Zgodnie z oczekiwaniami, skupisk tych nie zaobserwowano w niezakażonych tkankach. Kwantyfikacja wielkości i liczby monocytów, klastrów komórkowych i tkanek zakażonych gruźlicą M wykazała, że rozmiar klastrów komórek jest zwiększony, podczas gdy liczba pojedynczych monocytów jest zmniejszona w porównaniu z niezakażonymi modelami tkankowymi.
Potencjalni użytkownicy tego modelu tkanki płucnej obejmują badanie roli różnych komórek odpornościowych i odporności tkankowej w gruźlicy, badanie fenotypów prątków oraz testowanie kandydatów na leki, które zabijają prątki w ziarniniaku.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy trójwymiarowy model tkanki płuca człowieka, który symuluje dynamikę infekcji gruźlicy u ludzi, w tym migrację komórek odpornościowych oraz wczesne tworzenie się ziarniniaków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby zakaźne
- Biologia komórki
Wstęp
- Gruźlicę u ludzi trudno jest modelować in vitro.
- Istniejące metody często nie oddają trójwymiarowego mikrośrodowiska.
- Tworzenie się ziarniniaków jest kluczowym aspektem patologii gruźlicy.
- Modele 3D mogą dostarczyć lepszych informacji na temat dynamiki infekcji.
Cel badania
- Opracowanie trójwymiarowego modelu tkanki płucnej do badania infekcji M tuberculosis.
- Analiza interakcji komórek odpornościowych oraz procesu tworzenia się ziarniniaków.
- Pogłębienie zrozumienia patogenezy gruźlicy.
Zastosowane metody
- Nakładanie kolagenowej macierzy fibroblastycznej na wkładkę do hodowli komórkowych.
- Wysiewanie zainfekowanych komórek odpornościowych oraz nabłonka płuc na macierz.
- Ekspozycja na powietrze w celu ułatwienia wydzielania śluzu i stratyfikacji nabłonka.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna w celu analizy tworzenia się ziarniniaków.
Główne wyniki
- Model 3D skutecznie odwzorował dynamikę infekcji M tuberculosis.
- W odpowiedzi na infekcję utworzyły się ziarniniaki przypominające te występujące w przebiegu gruźlicy u ludzi.
- W modelu tkankowym zaobserwowano migrację komórek odpornościowych.
- Model ten zapewnia środowisko bardziej istotne fizjologicznie do badania gruźlicy.
Wnioski
- Nowoczesny trójwymiarowy model tkanki płucnej stanowi cenne narzędzie w badaniach nad gruźlicą.
- Model ten może przyczynić się do lepszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych podczas infekcji.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model w opracowywaniu nowych terapii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten trójwymiarowy model ludzkiej tkanki płucnej wypełnia istotną lukę w badaniach nad gruźlicą, zapewniając fizjologicznie istotne mikrośrodowisko, które odtwarza proces tworzenia się ludzkich ziarniniaków – kluczową cechę patologiczną, która jest słabo modelowana w tradycyjnych kulturach 2D lub systemach zwierzęcych. Umożliwiając analizę przestrzenną i czasową interakcji między gospodarzem a patogenem, model ten wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku kandydatów na leki przeciwinfekcyjne i zwiększa wiarygodność predykcyjną w ocenie przedklinicznej. Możliwość manipulowania poszczególnymi typami komórek sprawia, że jest on skalowalną platformą do szerszej walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywania testów w kontekście infekcyjnych chorób płuc.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez obserwację migracji komórek odpornościowych oraz tworzenia struktur przypominających ziarniaki w kontekście tkanki istotnej dla człowieka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system 3D do walidacji celów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną gospodarza oraz przeżywalność patogenów w obrębie ziarniaków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do ilościowej oceny wpływu związków na integralność ziarniniaka i skupianie się komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Oferuje zestandaryzowane modele tkanek eksponowanych na powietrze, z wydzielaniem śluzu i stratyfikacją nabłonka, zapewniając spójne wyniki w badaniach przesiewowych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez odtworzenie wczesnego tworzenia się ziarniniaków, które są charakterystycznym elementem patologii gruźlicy u ludzi, a których brakuje w wielu modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki trójwymiarowej wizualizacji i kwantyfikacji czasowo-przestrzennej dynamiki infekcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną – dostarczając platformy tkankowej o charakterze ludzkim do oceny związków immunomodulujących i przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez modelowanie rekrutacji komórek odpornościowych i ograniczania rozprzestrzeniania się patogenów w ustrukturyzowanej tkance.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej hodowli 3D z mierzalnymi wynikami, takimi jak wielkość skupisk monocytów i lokalizacja bakterii.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, umożliwiając statystyczne porównanie warunków infekcji i efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie specyficznej dla człowieka cechy patologicznej (ziarniaka) w celu poprawy ciągłości translacyjnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modularna platforma, w której poszczególne typy komórek (nabłonkowe, fibroblasty, makrofagi) mogą być modyfikowane w celu badania różnych patogenów płucnych poza M. tuberculosis.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach gospodarz-patogen w mikrośrodowisku przypominającym tkankę.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu macierzy kolagenowej, hodowli na granicy faz powietrze-ciecz oraz określonym proporcjom wysiewu komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wczesne wykrycie związków, które nie przenikają lub nie działają w obrębie struktur przypominających ziarniniaki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację kandydatów wykazujących aktywność w złożonych środowiskach tkankowych, co lepiej przewiduje wyniki kliniczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pierwotnych hodowlach komórkowych, inżynierii tkankowej 3D oraz mikroskopii konfokalnej w zakresie akwizycji i analizy obrazów 3D.
- Zależne od dostępu do laboratoriów BSL-3 w celu pracy z wirulentnymi szczepami M. tuberculosis oraz od ustandaryzowanego sprzętu do polimeryzacji kolagenu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej protokołów pobierania tkanek, ich sekcjonowania oraz immunofluorescencji, aby zapewnić spójne wyniki ilościowe w różnych laboratoriach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy rozszerzaniu go na inne patogeny płucne lub typy komórek odpornościowych, szczególnie w odniesieniu do wielokrotności infekcji i czasu trwania hodowli.
- Ograniczone przez obecne skupienie modelu na wczesnym etapie tworzenia ziarniniaków, co może nie oddawać późnych etapów martwicy serowatej lub tworzenia jam obserwowanych w chronicznej gruźlicy u ludzi.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Fibroblast-collagen Matrix Continuous Culture
3:35
Immune and Lung Epithelial Cell Seeding
5:42
3D Lung Tissue Model Air Exposure, Harvest and Mounting
7:12
3D Model Visualization, Acquisition and Quantitative Analysis
8:26
Results: Representative 3D Visualization and Quantitative Tissue Model Analysis
9:39
Conclusion
