Name: Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę budowy 3D modelu tkanki płucnej do badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis. Technika umożliwia obserwację migracji komórek odpornościowych i formowania się wczesnych granulomów w warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują podstawowej placówce mikroskopii na Wydziale Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Linköping za zapewnienie dostępu do zaawansowanych systemów obrazowania; Karl-Eric Magnusson (emerytowany naukowiec) z Wydziału Medycyny Klinicznej i Eksperymentalnej, Uniwersytet w Linköping za zapewnienie dostępu do oprogramowania do przetwarzania obrazów Imaris 3D/4D (Bitplane, Szwajcaria); oraz S. Braianowi za pomoc przy rysunkowym modelu płuc. Prace te były wspierane przez fundusze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (Alternatywy dla badań na zwierzętach, 2012-1951) i Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (2012-3349) dla M.L. oraz Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych dla S.B. S.B. sb. otrzymały granty od Karolinska Institutet, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiej Agencji Współpracy na rzecz Rozwoju Międzynarodowego (Sida) i Szwedzkiej Agencji ds. Sytuacji Nadzwyczajnych (MSB) oraz Szwedzkiej Fundacji Serca i Płuc (HLF). M.S. otrzymała stypendia od Karolinska Institutet i Rady Hrabstwa Sztokholm.

Uwaga: Ludzka krew obwodowa od zdrowych, anonimowych dawców krwi zakupiona w banku krwi Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping w Szwecji została wykorzystana jako źródło komórek odpornościowych w tym badaniu. Protokół ten jest przeznaczony do wkładów z płytkami 6-dołkowymi 24 mm. Bezpośrednia adaptacja do innych formatów studzienek nie jest zalecana, ponieważ model tkankowy kurczy się zarówno w pionie, jak i w poziomie podczas rozwoju.
1. Przygotowanie materiałów, pożywek i hodowli bakterii/linii komórkowych
<ol>
	<li>Hodowla bakterii:
	<ol>
		<li>Hodować szczep prątkowy M. tuberculosis H37Rv przenoszący plazmid pFPV2 w celu konstytutywnej ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP), w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej 0,05% Tween-80, 0,5% glicerolu, kanamycyny (20 μg/ml) i uzupełniony albuminą Middlebrook, dekstrozą i wzbogaceniem katalazy (Middlebrook ADC Enrichment), w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-10 dni. 
		Uwaga: Wszystkie etapy doświadczalne z udziałem żywych, zjadliwych szczepów M. tuberculosis powinny być przeprowadzane w obiekcie BSL-3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1x Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletne podłoże (uzupełnione 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 mM HEPES, 0,1 mM aminokwasów endogennych i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS)). Przygotuj również kompletną pożywkę DMEM bez antybiotyków.</li>
	<li>Przygotuj 1x kompletną pożywkę Minimum Essential Medium (MEM) (1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 mM HEPES, 0,1 mM aminokwasów endogennych i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).</li>
	<li>Przygotowanie kolb pokrytych fibronektyną/kolagenem (łącznie 10 ml):
	<ol>
		<li>Odpipetować 8,8 ml sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do czystej probówki. Dodać 1 ml albuminy surowicy bydlęcej (1 mg/ml), 100 μl kolagenu bydlęcego typu I (3 mg/ml) i 100 μl rekombinowanej fibronektyny ludzkiej (1 mg/ml).</li>
		<li>Wymieszaj roztwór, obracając probówkę do góry nogami 5 razy. Kolby są pokryte roztworem fibronektyny/kolagenu (1 ml dla kolby T-25 i 2 ml dla kolby T-75). Pozostawić O/N w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usunąć roztwór i przechowywać kolby powlekane w temperaturze RT. 
		Uwaga: Zebrany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C i użyć ponownie trzy razy. Przechowywanie przez okres dłuższy niż 2 tygodnie może spowodować brązowienie cieczy (tworzenie się kryształów), po czym należy ją wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewy fibroblastów:
	<ol>
		<li>Hoduj i utrzymuj MRC-5 (ludzka linia komórkowa fibroblastów płuc pochodząca z normalnej tkanki płucnej 14-tygodniowego płodu płci męskiej) w kompletnym DMEM w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Użyj fibroblastów w pasażach 24-26 i rośnij do 70-80% zlewania się. 
		Uwaga: Linia komórkowa MRC-5 w pasażu >30 ma tendencję do utraty morfologii i nie jest zalecana do stosowania w modelu tkankowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiew komórek nabłonkowych:
	<ol>
		<li>Uzyskaj 16HBE14o- (16HBE), unieśmiertelnioną ludzką linię komórkową nabłonka oskrzeli, która zachowuje zróżnicowaną morfologię i funkcję normalnego ludzkiego nabłonka dróg oddechowych (był to prezent od dr Dietera Gruenerta, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA 10). Hodować komórki 16HBE w kolbach pokrytych fibronektyną/kolagenem i utrzymywać komórki w pełnym MEM w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 5x DMEM
	<ol>
		<li>Przygotuj 5x DMEM, rozpuszczając 13,4 g proszku DMEM i 3,7 g wodorowęglanu sodu w 150 ml sterylnej wody destylowanej. Doprowadzić pH pożywki do 7,3, uzupełnić objętość do 200 ml i przefiltrować za pomocą filtra membranowego 0,22 μm. Przefiltrowaną pożywkę należy zebrać w sterylnym pojemniku i przechowywać do momentu użycia w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie fibroblastów osadzonych w kolagenie
<ol>
	<li>Zamrożone porcje FBS i L-glutaminy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu próbki należy przechowywać na lodzie. Umieścić wodorowęglan sodu (71,2 mg/ml) i gentamycynę (50 mg/ml) w temperaturze 4 °C. Wstępnie schłodzić 50 ml probówek wirówkowych i 10 ml sterylnych pipet do temperatury 4 °C. 
	Uwaga: Wszystkie użyte materiały (z wyjątkiem 5x DMEM) są schładzane na lodzie przed użyciem, a wszystkie kroki są wykonywane na lodzie. Kolagen bydlęcy typu I (1,1 mg/ml) musi być przechowywany w niskiej temperaturze, ponieważ zapobiega to krzepnięciu kolagenu.</li>
	<li>Przygotuj komórki fibroblastów:
	<ol>
		<li>Rozprzać trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować wystarczającą ilość z komórkami fibroblastów płuc (MRC-5) przez 10 minut w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę, dodając 1x DMEM complete. Odessać zawiesinę komórkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,3 x 105 komórek/ml w DMEM kompletnym. Umieść komórki na lodzie, aż będą gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj premiks:
	<ol>
		<li>Do probówki z napisem "pre-mix" dodać 395 μl 5x DMEM, 40 μl L-glutaminy, 120 μl NaHCO3 (71,2 mg/ml), 440 μl FBS, 5 μl gentamycyny (50 mg/ml), całkowita objętość 1,000 μl, następnie dobrze zamieszać i umieścić na lodzie. 
		Uwaga: Podane objętości dotyczą jednej 6-dołkowej wkładki hodowlanej 24 mm. Oblicz konkretne ilości wymagane dla całkowitej liczby wkładek, ale dodaj jeszcze jedną, aby mieć pewność, że przygotowana jest wystarczająca ilość mieszanki wstępnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bezkomórkową mieszaninę kolagenu:
	<ol>
		<li>Do każdej kultury dodaj 1 ml bezkomórkowej mieszanki kolagenu. Do 50-mililitrowej stożkowej probówki na lodzie dodać następujące składniki w podanej kolejności: 686 μl kolagenu 1,1 mg/ml, 250 μl Pre-mix i 64 μl 1x kompletny DMEM do całkowitej objętości 1,000 μl. Dobrze wymieszaj roztwór, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Pracuj szybko i dodaj kolagen na ściance tuby, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Dodać 1 ml mieszaniny warstwy bezkomórkowej do wkładki umieszczonej na płytce 6-dołkowej. Nie dodawaj żadnego podłoża do studzienki na zewnątrz wkładu. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że bezkomórkowa mieszanina pokrywa całą wkładkę bez pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę kolagenu komórkowego:
	<ol>
		<li>Wymieszaj składniki warstwy komórkowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml trzymanej na lodzie w następującej kolejności: 2 ml kolagenu, 615 μl premiksu, 58 μl 1x kompletnego DMEM i 327 μl zawiesiny komórek Fibroblasty płuc (MRC-5), aby uzupełnić całkowitą objętość do 3,000 μl. Każda kultura wymaga 3 ml mieszanki kolagenu komórkowego. 
		KRYTYCZNY KROK: Upewnij się, że dokładnie wymieszałeś kolagen i premiks przed dodaniem zawiesiny komórkowej. To zneutralizuje pH kolagenu, aby uniknąć toksycznego wpływu na fibroblasty.</li>
		<li>Dodać warstwę komórkową (3 ml) na warstwę kolagenu bezkomórkowego i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Pracuj szybko i dodaj kolagen na ściance tuby, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Po polimeryzacji dodać 2 ml DMEM complete na dno płytki 6-dołkowej (pod wkładką) i inkubować przez 24 godziny. 
		UWAGA: Jeśli polimeryzacja nie nastąpiła, wyrzuć wkładki płytki zawierające macierz fibroblast-kolagen i zacznij od nowa. Najbardziej prawdopodobną przyczyną jest błąd w dodawaniu lub nieprawidłowa objętość jednego z wyżej wymienionych odczynników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ciągła hodowla macierzy fibroblast-kolagen
<ol>
	<li>Ostrożnie podnieś wkładkę za pomocą czystych kleszczy i zassaj pożywkę hodowlaną z dna studzienki. Dodać 2 ml kompletnego DMEM na dno dołka, a następnie 2 ml kompletnego DMEM we wkładce. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza pod wkład, ponieważ zapobiegnie to dyfuzji składników odżywczych między komorą zewnętrzną i wewnętrzną. Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki do mikropipety.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną (wewnątrz i pod wkładką) co drugi dzień i hoduj przez około 5-7 dni. Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania nośnika z wkładki. Aby uniknąć kontaktu z macierzą fibroblast-kolagen, należy lekko przechylić wkładkę za pomocą czystych kleszczy i odessać pożywkę ze ścianek wkładu. 
	KROK KRYTYCZNY: Fibroblasty w macierzy kolagenowej powinny uzyskać wydłużony fenotyp i przebudować kolagen, który następnie się kurczy. W ciągu około 5-7 dni matryca skurczyła się, tworząc platformę (o średnicy 10-14 mm) w środku wkładki. Zakontraktowana matryca jest gotowa do użycia w kolejnym kroku. Aby uzyskać równomierny skurcz macierzy, ważne jest, aby fibroblasty były dobrze wymieszane z kolagenem przed wysiewem (krok 2.6.1).</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek odpornościowych (zakażona/niezakażona mieszanina monocytów i makrofagów)
Uwaga: Następujące etapy eksperymentalne obejmują zjadliwe prątki i dlatego muszą być przeprowadzone w obiekcie BSL-3.
<ol>
	<li>Otrzymywanie pierwotnych monocytów i makrofagów:
	<ol>
		<li>Wyizolować monocyty krwi obwodowej od krwi dawcy przy użyciu ustalonego protokołu. Wyizolować monocyty w tym samym dniu, w którym skonfigurowano model tkankowy i hodowlę, a następnie różnicować je w makrofagi przez około 7 dni przed zakażeniem M. tuberculosis. 
		UWAGA: Dzięki temu zarówno makrofagi, jak i zakontraktowana macierz fibroblast-kolagen będą dostępne po 7 dniach. Wyizoluj również świeże monocyty, które zostaną dodane razem z zakażonymi makrofagami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie makrofagów zakażonych M. tuberculosis
	<ol>
		<li>Zbierz wyhodowane bakterie, przemyj 1x PBS zawierającym 0,05% Tween-80, ponownie zawieś w kompletnym DMEM bez antybiotyków, przepuść przez ściętą sterylną igłę 27 G w celu rozproszenia grudek bakteryjnych i zmierz gęstość optyczną. 
		Uwaga: Wstępnie określ w laboratorium ekwiwalenty jednostek tworzących kolonie M. tuberculosis dla gęstości optycznej. Pozwoli to oszacować liczbę bakterii, które zostaną wykorzystane do infekcji.</li>
		<li>Inkubować makrofagi przez 4 godziny z M. tuberculosis przy wielokrotności infekcji (MOI) 10). Po infekcji przemyć 3x 1x PBS, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Używaj niezakażonych makrofagów hodowanych w ten sam sposób, ale bez M. tuberculosis, jako kontroli.</li>
		<li>Odłączyć makrofagi od płytki hodowlanej przez traktowanie 2 mM EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C i ponownie zawiesić komórki w kompletnym DMEM wolnym od antybiotyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie monocytów 
	Uwaga: Izolację i znakowanie monocytów można przeprowadzić na stanowisku BSL-2, a następnie przenieść do zakładu BSL-3 w celu dalszego przetwarzania.
	<ol>
		<li>Świeżo przygotowane monocyty (2 x 107 komórek) barwić końcowym stężeniem 2 μM czerwonego barwnika PKH26 przez 5 minut, zgodnie z instrukcją producenta. Przemyć 3x i ponownie zawiesić komórki kompletnym DMEM bez antybiotyków o gęstości 1 x 107 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie komórek odpornościowych do macierzy fibroblast-kolagen
	<ol>
		<li>Po 5-7 dniach hodowli macierzy fibroblast-kolagen należy odessać pożywkę hodowlaną z komory zewnętrznej i wewnętrznej i dodać 1,5 ml świeżego DMEM bez antybiotyków do komory zewnętrznej.</li>
		<li>Przygotować znakowaną mieszaninę monocytów-makrofagów (niezakażonych/zakażonych) w stosunku MO:MQ (5:1) w 50 μl DMEM. Na 50 000 makrofagów weź 250 000 znakowanych monocytów.</li>
		<li>Dodać 50 μl mieszaniny MO:MQ do matrycy fibroblast-kolagen i inkubować przez 1 godzinę w 5 % CO2 w temperaturze 37 °C. Po inkubacji delikatnie dodać 2 ml pożywki hodowlanej do wkładki i inkubować przez dodatkowe 24 godziny w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Ponieważ dodawane komórki są luźno połączone, dodawanie pożywki powinno być powolne, delikatnie dodając na ściankach wkładki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wysiewanie komórek nabłonka płuc (16HBE)
Uwaga: Następujące kroki muszą być wykonane w obiekcie BSL-3.
<ol>
	<li>Nasiona komórek nabłonka płuc (16HBE) na wierzchu warstwy MO:MQ-fibroblast-kolagen. Aby to zrobić, najpierw oddzielić komórki 16HBE od kolby przez traktowanie trypsyną (jak w 2.2.1.) i ponownie zawiesić przy 4 x 106 komórek/ml w DMEM wolnym od antybiotyków.</li>
	<li>Zassać pożywkę hodowlaną wewnątrz i na zewnątrz wkładu. Następnie dodać 1,5 ml kompletnego DMEM bez antybiotyków na dnie studzienki na zewnątrz wkładki.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 16HBE na wierzch macierzy kolagenowej fibroblastów komórek odpornościowych. Pozostawić na 2 minuty w kapturze i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po inkubacji dodać delikatnie 2 ml kompletnego DMEM bez antybiotyków do wkładki i hodować w temperaturze 37 °C przez 3 dni. Etap hodowli ułatwia proliferację komórek nabłonkowych w modelu tkankowym. 
	Uwaga: Ponieważ dodawane komórki są luźno połączone, dodawanie mediów powinno być powolne i delikatne, przesuwając się przez ścianki wkładu.</li>
</ol>
6. Ekspozycja na powietrze modelu 3D płuc
Uwaga: Po 5 dniu od dodania zakażonych makrofagów, modele tkanek są wystawiane na działanie powietrza i następujące kroki muszą być wykonane w placówce BSL-3.
<ol>
	<li>Zassać pożywkę hodowlaną wewnątrz i na zewnątrz wkładki. 
	Uwaga: Na tym etapie można pobrać supernatanty w celu wykrycia wydzielanych czynników. Odwirować, sterylnie przefiltrować i przechowywać supernatanty w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Dodać 1,8 ml kompletnego DMEM bez antybiotyków do komory zewnętrznej i inkubować w 5% CO2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 2 dni. Nie dodawaj pożywki hodowlanej do insertu. 
	UWAGA: Unoszenie modelu tkankowego drogą powietrzną ułatwia tworzenie się warstwowego nabłonka i wydzielanie śluzu, co zapewnia wytrzymałość tkance i fizjologiczne podobieństwo do ludzkiej tkanki płucnej.</li>
</ol>
7. Pobieranie i montaż trójwymiarowego modelu tkanki płucnej
 
Uwaga: Następujące kroki należy wykonać w obiekcie BSL-3.
<ol>
	<li>W 7 dniu po implantacji zakażonych makrofagów modele tkanek są gotowe do pobrania. Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną z modelu tkankowego. Utrwal model tkankowy za pomocą 4% paraformaldehydu przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Ten krok zabija bakterie i ustala morfologię tkanki/komórki do dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Za pomocą skalpela oddziel membranę od wkładu studziennego. Przenieś błonę zawierającą tkankę do studzienki zawierającej 1x PBS.</li>
	<li>Wytnij i usuń boki modelu tkankowego za pomocą czystego skalpela. Następnie pokrój model tkankowy na 4 w przybliżeniu równe kwadratowe kawałki. Przenieś kawałek chusteczki na szkiełko superfrost. Przechowywać kawałki tkanek w 1x PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Suszyć chusteczkę przez 5 minut i mocować za pomocą ProLong Gold antifade z DAPI i szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka bez przeszkadzania w ciemności w temperaturze RT do wyschnięcia. 
	Uwaga: Grubość tkanki może się różnić między środkiem a obrzeżem, powodując lekkie przechylenie szkiełka nakrywkowego. Aby tego uniknąć, w rogu szkiełka nakrywkowego można umieścić przekładkę (na przykład parafilm).</li>
	<li>Nałóż lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia. Zanurz szkiełka w 70% etanolu, aby można je było bezpiecznie wynieść z obiektu BSL-3.</li>
</ol>
8. Wizualizacja, akwizycja i ilościowa analiza 3D
<ol>
	<li>Wizualizacja preparatów tkankowych za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z laserami emitującymi odpowiednio 488 nm w celu wzbudzenia GFP (kanał zielony), 420 nm w przypadku DAPI (niebieski) i 555 nm w przypadku monocytów znakowanych PKH26 (czerwony).</li>
	<li>Uzyskuj obrazy 3D w rozdzielczości 512x512 ze stosami Z o grubości co najmniej 20 μm i odstępem między stosami 1–1,5 μm. Zdobądź 5-10 różnych pól pokrywających cały kawałek tkanki. 
	Uwaga: Użyj konfiguracji, takiej jak Nyqvist, aby uzyskać optymalne ustawienia rozdzielczości optycznej (długość fali, moc/ekspozycja lasera, rozmiar piksela i powiększenie). Unikaj niedostatecznego lub nadmiernego nasycenia pikseli.</li>
	<li>Analizuj obrazy konfokalne za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D. W przypadku kwantyfikacji 3D klastrów komórkowych zaleca się wykonanie następujących kroków w celu uzyskania optymalnej analizy.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu 3D i załaduj obraz. Zmierz wymiary obiektów, które mają być analizowane na obrazie, na przykład wielkość jądra, pojedynczego monocytu i pojedynczej bakterii. Te obserwacje są przydatne do definiowania lub filtrowania obiektów.</li>
	<li>Korzystając z narzędzia do regulacji wyświetlania, zoptymalizuj renderowanie głośności, dostosowując każdy kanał pod kątem kontrastu, jasności i krycia mieszania. Ten krok ma na celu zminimalizowanie zakłóceń powodowanych przez szumy w renderowaniu objętościowym. 
	Uwaga: Korekcja gamma może prowadzić do manipulacji obrazami i dlatego należy jej unikać.</li>
	<li>Utwórz powierzchnie, wybierając kanał czerwony (monocyty) i ustaw próg (wybór automatyczny lub ręczny). W razie potrzeby użyj filtrów, aby ograniczyć wybór czerwonych monocytów lub wykluczyć tło. Podobnie utwórz powierzchnie dla kanałów zielonych (M. tuberculosis) i niebieskich (jądra), jak opisano powyżej.</li>
	<li>Eksportuj dane do plików Ms-Excel. Możliwy jest eksport określonego parametru lub wszystkich danych. Parametry, które są istotne dla analizy grupowania komórek, to objętość, intensywność, liczba obiektów, liczba wokseli i sferyczność.</li>
	<li>Zapisz i wyeksportuj obrazy w odpowiednim formacie obrazu, najlepiej TIFF. 
	UWAGA: Animacje można również tworzyć za pomocą menu animacji i zapisywać jako plik multimedialny.</li>
	<li>Zapisz ustawienia analizy każdego kanału za pomocą opcji Dodaj parametry i można je później odzyskać za pomocą funkcji Przebuduj. Jednoczesna analiza większej liczby plików za pomocą narzędzia do przetwarzania wsadowego. 
	Uwaga: Wszystkie obrazy, które mają być porównywane, muszą być pozyskiwane, przetwarzane i analizowane w ten sam sposób. Na przykład obraz 8-bitowy (256 liczb całkowitych) nie powinien być porównywany z obrazem 12-bitowym (4096 liczb całkowitych).</li>
</ol>

<ol><li>Sakamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+pathology%22%5BJournal%5D)">The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).</li>
<li>Saunders, B. M., Britton, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+and+death+in+the+granuloma%3A+immunopathology+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis.</a> Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+issues+in+tuberculosis.+Ann+Rheum+Dis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis.</a> Ann Rheum Dis. 63, Suppl 2. ii50-ii56 (2004).</li>
<li>Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+and+latent+tuberculosis+infection+in+close+contacts+of+people+with+pulmonary+tuberculosis+in+low-income+and+middle-income+countries%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).</li>
<li>Barry 3rd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+latent+tuberculosis%3A+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li>
<li>Puissegur, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+dual+model+of+mycobacterial+granulomas+to+investigate+the+molecular+interactions+between+mycobacteria+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells.</a> Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).</li>
<li>Kapoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Granuloma+In+Vitro+Model%2C+for+TB+Dormancy+and+Resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation.</a> PLoS One. 8, e53657(2013).</li>
<li>Nguyen Hoang,, T, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+functional+properties+in+a+three-dimensional+tissue+model+of+human+lung+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).</li>
<li>Parasa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Mycobacterium+tuberculosis+early+granuloma+formation+in+experimental+human+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue.</a> Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).</li>
<li>Cozens, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+chloride+secretion+in+polarized+immortal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).</li>
<li>Brighenti, S., Andersson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+responses+in+human+tuberculosis%3A+learning+from+the+site+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection.</a> J Infect Dis. 205, Suppl 2. S316-S324 (2012).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136, 37-49 (2009).</li>
<li>Gupta, U. D., Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Animal models of tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).</li>
<li>Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guinea+pig+model+of+Mycobacterium+tuberculosis+latent%2Fdormant+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection.</a> Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).</li>
<li>Singhal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+tuberculosis+in+the+Wistar+rat%3A+a+model+for+protective+immunity+and+control+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection.</a> PLoS One. 6, e18632(2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase-4+inhibition+alters+gene+expression+and+improves+isoniazid-mediated+clearance+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+rabbit+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs.</a> PLoS Pathog. 7, e1002262(2011).</li>
<li>Lin, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li>
<li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis%3A+few+CD8%2B+effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3%2B+regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zdolność do rekrutacji i tworzenia zorganizowanych klastrów komórkowych w miejscu zakażenia jest cechą charakterystyczną ludzkiej gruźlicy 11. Te dynamiczne struktury znane jako ziarniniaki gruźlicy składają się głównie z komórek odpornościowych (makrofagów, monocytów, limfocytów T i komórek B) oraz wielojądrzastych komórek olbrzymich otaczających M. tuberculosis. Od dawna uważa się, że rola ziarniniaka w odgradzaniu infekcji zapobiega miejscowemu rozprzestrzenianiu się bakterii. Jednak nowsze badania pokazują, że tworzenie ziarniniaka ma kluczowe znaczenie dla wczesnego przeżycia, wzrostu i rozprzestrzeniania się bakterii 12. Strategia nowych badań polega na zidentyfikowaniu cząsteczek lub szlaków, które mogłyby być skutecznie ukierunkowane w celu zahamowania migracji komórkowej w tworzeniu ziarniniaka i/lub rozprzestrzenianiu się gruźlicy. 
Zastrzeżeniem dla nowatorskich badań nad gruźlicą jest brak modeli, które podsumowują gruźlicę u ludzi. Najczęściej wykorzystywane zwierzęta doświadczalne nie tworzą prawdziwego ziarniniaka po zakażeniu M. tuberculosis i dlatego nie są odpowiednim wyborem do badań nad gruźlicą 13-16. Zwierzęta naczelne są najbardziej podobne do ludzkiej gruźlicy typu 17, ale nie są preferowanym wyborem ze względu na wysokie koszty operacyjne i kwestie etyczne. Gruźlica u ludzi jest złożonym procesem immunologicznym i jest trudna do modelowania in vitro. Hodowle komórkowe monowarstwowe lub kokulturowe nie mają środowiska 3D i odpowiedzi tkankowych. W związku z tym opracowaliśmy innowacyjny model tkanki płucnej oparty na ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych i liniach komórkowych specyficznych dla płuc 8,9. Model wykazuje charakterystyczne cechy ludzkiej tkanki płucnej, m.in. nabłonek z równomiernie zintegrowanymi makrofagami, tworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej, nabłonek warstwowy i wydzielanie śluzu 9. 
Model 3D ludzkiej tkanki płucnej ma kilka zalet w porównaniu z pojedynczymi lub kokulturami in vitro wysiewanymi na płytkach do hodowli tkankowych lub wkładkach transwell. Po pierwsze, ludzkie komórki specyficzne dla płuc (fibroblasty i komórki nabłonkowe) nie są powszechnie włączane do pojedynczych lub kokultur in vitro . Po drugie, komórki odpornościowe i komórki specyficzne dla płuc są osadzone w kontekście fizjologicznym 3D (produkty macierzy zewnątrzkomórkowej bogate w kolagen). Reakcja komórek na bodziec/infekcję i zachowanie migracyjne komórek, na przykład tworzenie ziarniniaka, różnią się znacznie między środowiskiem 2D i 3D. Co więcej, opisana metoda umożliwia wizualizację 3D i solidną analizę ilościową 3D, która dostarcza kluczowych informacji na temat rozmieszczenia przestrzennego i skomplikowanych interakcji komórkowych. 
Eksperymentalne zakażenie M. tuberculosis w tkance modelowej spowodowało skupienie makrofagów w miejscu zakażenia, przypominające wczesny ziarniniak gruźlicy (ryc. 2 i 3). Niedawno wykazaliśmy, że zmutowane szczepy z wadliwą zdolnością do wydzielania czynnika wirulencji ESAT-6 lub Mycobacterium bovis BCG, które nie mają ESAT-6, nie indukowały grupowania monocytów (brak wczesnego ziarniniaka), w przeciwieństwie do zjadliwego M. tuberculosis 9. Dane te są zgodne z obserwacjami poczynionymi na zarodkach danio pręgowanego zakażonych Mycobacterium marinum, których przezroczystość pozwala na eleganckie obrazowanie na żywo powstawania ziarniniaka 12. Ponieważ nie ma złotego standardu dla gruźlicy, do walidacji metody 9 wykorzystaliśmy chirurgicznie wycięte biopsje tkanek od pacjentów z gruźlicą. Nasz model tkankowy in vitro ma kilka cech wspólnych z biopsjami płuc i węzłów chłonnych od pacjentów z gruźlicą, w tym agregację makrofagów w ziarniniaku, obecność bakterii zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych 18 oraz indukcję martwicy 11. 
Chociaż opisany model ma fizjologiczne znaczenie dla gruźlicy u ludzi i ma kilka zalet w porównaniu z innymi modelami in vitro , ma pewne ograniczenia. Na przykład spośród ponad 20 białek kolagenowych zidentyfikowanych u ludzi, tylko typ I jest uwzględniony w modelu, aby naśladować macierz zewnątrzkomórkową. Jednak kolagen typu I jest złożoną mieszaniną produktów macierzy zewnątrzkomórkowej i jest najobficiej występującym kolagenem w organizmie człowieka. Ponadto wykazaliśmy obecność kolagenu IV i kilku białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak tropoelastyna, wimentyna i laminina, które są wytwarzane przez komórki nabłonkowe i fibroblasty w modelu tkankowym, co wskazuje na syntezę nowego kolagenu 8. Obecnie model tkanki płucnej zawiera tylko monocyty i makrofagi, oprócz komórek specyficznych dla płuc. Brakuje w nim neutrofili i limfocytów, o których wiadomo również, że są obecne w ziarniniaku. Co ciekawe, model ten nie ogranicza się do wprowadzenia dodatkowych komórek odpornościowych i jest interesujący w celu zbadania, w jaki sposób przyczyniają się one do złożonych interakcji komórkowych w ludzkiej gruźlicy. Implantacja pierwotnych makrofagów pęcherzykowych, komórek specyficznych dla skóry i komórek raka płuc została już przetestowana w modelu. Ponieważ naszym celem było użycie modelu, który bardzo przypomina ludzką gruźlicę, nie podjęto prób wprowadzenia komórek mysich.
Podsumowując, model tkanki płucnej ma implikacje zarówno dla podstawowych badań mechanistycznych, jak i stosowanych. Potencjalne zastosowania modelu płuc obejmują badanie odporności wrodzonej, badanie mechanistycznych aspektów obrony gospodarza, takich jak dojrzewanie fagosomalne, autofagia, produkcja cytokin, chemokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz charakterystyka funkcjonalna poszczególnych typów komórek. Uderzające jest to, że model tkankowy in vitro umożliwia manipulowanie jednym lub kilkoma typami komórek i zapewnia odpowiednie mikrośrodowisko tkankowe, nie tylko dla badań nad gruźlicą, ale także dla różnych chorób zakaźnych i niezakaźnych, które wpływają na płuca.

U ludzi reakcje na infekcję, zapalenie tkanek, rekrutację komórkową, przebudowę tkanek oraz regulację homeostazy tkankowej są złożonymi zdarzeniami z udziałem różnych typów komórek. Dlatego procesy te najlepiej badać w lokalnym środowisku tkankowym. Wcześniej było to możliwe głównie dzięki zastosowaniu eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Jednak powszechnie stosowane zwierzęta doświadczalne mają wiele ograniczeń, ponieważ często reagują na patogeny w inny sposób niż ludzie i wykazują inny przebieg choroby 1. Model ludzkiej tkanki płucnej in vitro stwarza możliwości badania specyficznych odpowiedzi immunologicznych w ludzkich płucach.
Ludzka gruźlica (TB) jest przede wszystkim chorobą atakującą płuca. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), czynnik etiologiczny gruźlicy, przedostaje się do płuc za pośrednictwem kropelek aerozolu, które są transportowane do przestrzeni pęcherzyków płucnych, gdzie bakterie są pochłaniane przez komórki dendrytyczne płuc i makrofagi pęcherzykowe w ramach wrodzonej odpowiedzi odpornościowej na infekcję 2,3. Fagocytoza patogenu prowadzi do zamknięcia drobnoustroju w fagosomie i w idealnych warunkach skutkuje neutralizacją oraz zabiciem patogenu przez fagocyt. Przyjmuje się, że do 50% osób narażonych na M. tuberculosis jest w stanie zwalczyć infekcję dzięki wrodzonej odpowiedzi odpornościowej 4. Innymi skutkami infekcji są eliminacja patogenu przez adaptacyjny układ odpornościowy na późniejszym etapie, infekcja utajona lub w najgorszych przypadkach chroniczna postać aktywna choroby 5.
Wcześniej nie opracowano modeli tkankowych in vitro do badań nad gruźlicą u ludzi. Często stosowano monokultury makrofagów ludzkich lub innych komórek krwi obwodowej 6,7. Wadą tego podejścia jest to, że nie odzwierciedlają one dynamiki różnych typów komórek współpracujących w tkance płucnej narażonej na M. tuberculosis. W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia modelu in vitro, który umożliwiałby prowadzenie funkcjonalnych i mechanistycznych badań nad gruźlicą. Opisany tutaj komórkowy model tkanki płucnej człowieka in vitro został pierwotnie opracowany przez nasz zespół na potrzeby badań nad funkcjami komórek dendrytycznych 8. Metodę tę zaadaptowaliśmy do badania gruźlicy.
Przedstawiony tutaj model ludzkiej tkanki płucnej składa się z tkankowo specyficznych komórek nabłonkowych oraz fibroblastów 8. Komórki te są hodowane w macierzy kolagenowej na porowatej membranie w insertach typu transwell, tworząc struktury przypominające prawidłową tkankę płucną człowieka (Rysunek 1). Po wystawieniu na działanie powietrza komórki zaczynają wydzielać śluz po stronie apikalnej 8. Poprzez implantację do modelu ludzkich makrofagów pierwotnych zainfekowanych M. tuberculosis, zaobserwowaliśmy, w jaki sposób komórki odpornościowe migrują w tkance i tworzą wczesne stadia ziarniniaków gruźliczych 9. Jest to pierwszy opisany model ludzkiej tkanki dla gruźlicy, który stanowi obiecujące narzędzie do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na gruźlicę oraz inne choroby płuc. Do tej pory w modelu jako komórki odpornościowe wykorzystywano wyłącznie monocyty i makrofagi, jednak poziom złożoności można zwiększyć poprzez włączenie dodatkowych, odpowiednich typów komórek.
<img alt="Schemat tworzenia tkanki nabłonkowej z macierzą kolagenową i integracją zainfekowanych makrofagów." src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczna budowa modelu tkanki płucnej. (A) Model składa się z ludzkich komórek nabłonkowych specyficznych dla płuc, pierwotnych makrofagów zainfekowanych M. tuberculosis oraz monocytów znakowanych czerwonym barwnikiem, wysianych na fibroblasty zatopione w kolagenie, przygotowane na filtrze transwell. Ekspozycja modelu tkankowego na powietrze inicjuje produkcję białek macierzy pozakomórkowej, wydzielanie śluzu oraz stratyfikację nabłonka. Tak opracowany model tkanki 3D jest użytecznym narzędziem do badania infekcji M. tuberculosis w środowisku ściśle przypominającym ludzkie płuco. (B) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe poszczególnych etapów przygotowania modelu tkankowego. (C) Pełna struktura przekroju tkanki modelu płucnego. Skala – 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych</td><td>BD Falcon</td><td>353092</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MRC-5, fibroblasty</td><td></td><td></td> płuc <td>ATCC#CCL-171</td></tr><tr><td>Komórki 16HBE, komórki</td><td></td><td></td> nabłonka płuc <td>Prezent od dr Dietera Gruenerta, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>5 x Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (5 x DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Wykonane z proszku, ale dodaj 5 razy mniej wody. Dostosuj pH do 7,3 i przefiltruj go za pomocą 0,2 i mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka z glukozą (DMEM) 1x</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x z Earle' s sole</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (71,2 mg / ml)</td><td></td><td></td><td>Przygotowane w domu</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Ciepło dezaktywowane przez 30 min, 56 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg / ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Hepes 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (Pen Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy poddany działaniu PA (500 ml)</td><td>Organogeneza</td><td>200-055</td><td></td></tr><tr><td>Czysty roztwór kolagenu bydlęcego oczyszczony z kolu (100 ml)</td><td>Zaawansowany biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Białko macierzy zewnątrzkomórkowej, Fibronektyna (1 mg)</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie monocyty/makrofagi</td><td></td><td></td><td>Wyizolowane z ludzkiej krwi pełnej lub kożuchówki.</td></tr><tr><td>PKH26 Łącznik komórek czerwonej fluorescencji</td><td>Sigma</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv eksprymujący białko zielonej fluorescencji</td><td></td><td></td><td>M. tuberculosis H37Rv typu dzikiego został przekształcony w plazmid pFPV2 konstytutywnie eksprymujący GFP.</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 średni&nbsp;</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook ADC Wzbogacanie</td><td>BBL</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>siarczan kanamycyny B (20 &mikro; g / ml)</td> <td>Sigma</td><td>B5264</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold odczynnik przeciw=-blaknięcie z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin -EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td></td><td></td><td></td>surowicy bydlęcej</tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D/4D iMaris Scientific, wersja 7.6.8</td><td>Bitplane AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model 3d ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem mycobacterium tuberculosis

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Gruźlica (TB) nadal stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi na całym świecie i istnieje zapotrzebowanie na opłacalne, ale wiarygodne modele, które pomogą nam zrozumieć mechanizmy choroby i przyspieszyć odkrycia nowych opcji leczenia. Hodowle komórkowe in vitro monowarstw lub kokultur nie mają trójwymiarowego (3D) środowiska i odpowiedzi tkankowych. W niniejszym artykule opisano innowacyjny model in vitro ludzkiej tkanki płucnej, który może być skutecznym narzędziem do badania złożonych zdarzeń zachodzących podczas zakażenia Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Model tkanki 3D składa się z komórek nabłonka i fibroblastów specyficznych dla tkanki, które są hodowane w matrycy kolagenu na porowatej błonie. Pod wpływem powietrza komórki nabłonkowe rozwarstwiają się i wydzielają śluz po stronie wierzchołkowej. Wprowadzając do modelu tkankowego ludzkie pierwotne makrofagi zakażone M. tuberculosis, wykazaliśmy, że komórki odpornościowe migrują do zakażonej tkanki i tworzą wczesne stadia ziarniniaka gruźlicy. Struktury te podsumowują odrębną cechę ludzkiej gruźlicy, ziarniniaka, która jest zasadniczo inna lub nie jest powszechnie obserwowana w szeroko stosowanych eksperymentalnych modelach zwierzęcych. Ta metoda hodowli organotypowej umożliwia wizualizację 3D i solidną analizę ilościową, która dostarcza kluczowych informacji na temat przestrzennych i czasowych cech interakcji komórka-patogen gospodarza. Reasumując, model tkanki płucnej zapewnia fizjologicznie istotne mikrośrodowisko tkankowe dla badań nad gruźlicą. W związku z tym model tkanki płucnej ma potencjalne implikacje zarówno dla podstawowych badań mechanistycznych, jak i stosowanych. Co ważne, model ten umożliwia dodawanie lub manipulowanie poszczególnymi typami komórek, co tym samym rozszerza jego zastosowanie do modelowania różnych chorób zakaźnych, które wpływają na płuca.

Trójwymiarowy (3D) model tkanki płucnej dla ludzkiej gruźlicy może być skutecznie wykorzystany do badania interakcji między gospodarzem a patogenem w infekcji M. tuberculosis. Podstawowe etapy tej metody, reprezentatywne obrazy mikroskopowe poszczególnych kroków oraz ogólna struktura mikroskopowa przekroju tkankowego zostały przedstawione na Rysunku 1. Model zawiera kilka komponentów ludzkiej tkanki płucnej, w tym fibroblasty płucne, komórki nabłonka oskrzelowego oraz pierwotne monocyty/makrofagi osadzone w trójwymiarowym środowisku tkankowym. Oprócz włączenia elementów ludzkiej tkanki płucnej, model ten odwzorowuje warunki fizjologiczne, takie jak warstwowość nabłonka oraz wydzielanie śluzu.
Przykład zastosowania modelu tkanki płucnej w monitorowaniu infekcji gruźlicą przedstawiono na Rysunku 2. W celu wizualizacji migracji i interakcji między M. tuberculosis a komórkami odpornościowymi, do modelu tkankowego (kolor niebieski, jądra barwione DAPI) wprowadzono makrofagi zakażone M. tuberculosis wykazujące ekspresję GFP (kolor zielony) wraz ze świeżo wyizolowanymi monocytami znakowanymi PKH26 (kolor czerwony). W 7. dniu po dodaniu zakażonych M. tuberculosis komórek do modelu tkankowego, mikroskopia konfokalna ujawniła skupiska czerwonych monocytów w miejscu infekcji (kolor zielony) (Rysunek 2), co naśladuje charakterystyczne zmiany chorobowe występujące w gruźlicy u ludzi 9.
Seria reprezentatywnych obrazów do wizualizacji 3D czego: M. tuberculosismodel tkanki zakażonej oraz kwantyfikacja skupisk komórkowych przedstawione są w Rysunek 3Wizualizacja 3D zapewnia użytkownikowi możliwość interakcji, badania i ilościowego określania wielu cech w obrazie 3D. Przestrzenne rozmieszczenie zielonych bakterii i czerwonych skupisk monocytów można obserwować w rzucie apikalnym, rotacyjnym i bocznym, jak pokazano na Rysunek 3B, co ujawnia gromadzenie się monocytów w miejscu *M. tuberculosis*. Klastry nie zaobserwowano w tkankach niezainfekowanych (Rysunek 3A). Ilościowo określono wielkość i liczbę skupisk monocytów i stwierdzono, że wielkość (objętość) skupisk komórkowych ulega zwiększeniu (p&lt;0,001), podczas gdy liczba poszczególnych monocytów spadła (p&lt;0,01) w *M. tuberculosis* tkanki zainfekowane w porównaniu z modelami tkanek niezainfekowanych (Rycina 3C i 3D). Dane te potwierdzają nasze wcześniejsze ustalenia dotyczące wczesnego tworzenia się ziarniniaków w M. tuberculosis infekcja zaobserwowana w modelach tkanki płucnej analizowanych w 2D w przekrojach tkankowych 9.
Nasze dane sugerują, że model tkankowy zapewnia naturalne środowisko 3D do badania złożonej sieci komunikacyjnej między komórkami gospodarza a M. tuberculosis. Stwierdziliśmy również, że wizualizacja 3D i analiza ilościowa są lepszymi narzędziami do badania cech w modelu tkankowym (Rysunek 3). Ilościowa analiza skupiska komórek (na przykład ziarniniaka) często obejmuje kilka warstw komórkowych i może zostać w pełni uchwycona dzięki ilościowej analizie 3D. Ponadto wizualizacja dokładnych cech przestrzennych i czasowych poszczególnych komórek lub bakterii w modelu umożliwia prowadzenie badań z obrazowaniem na żywo, migracji oraz śledzenia w wyznaczonym laboratorium.

<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca bakterie GFP, monocyty PKH26, jądra DAPI wraz z obrazami scalonymi." src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Monocyt w modelu tkankowym skupiony wokół zjadliwej M. tuberculosis. Przedstawiono reprezentatywne obrazy konfokalne niezinfekowanego oraz zainfekowanego M. tuberculosis modelu tkankowego. Panele z kanałów zielonego (M. tuberculosis-GFP), czerwonego (monocyty znakowane PKH26), niebieskiego (jądra barwione DAPI) oraz scalone wykazują rekrutację monocytów w zainfekowanej tkance w porównaniu z tkankami niezinfekowanymi. Skala - 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig2large.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza rozkładu monocytów; mikroskopia 3D; sekcjonowanie optyczne; widoki apikalny, rotacyjny i boczny." src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja 3D i analiza ilościowa modelu tkankowego dostarczają przydatnych informacji. Reprezentatywne obrazy wizualizacji 3D całego modelu tkankowego (A) tkanki niezakażonej, (B) zakażonej M. tuberculosis, uzyskane poprzez sekcjonowanie optyczne przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM700 oraz analizę ilościową z wykorzystaniem oprogramowania do przetwarzania obrazów Imaris (wersja 7.6.8). Obrazy te wykonano przy powiększeniu 20X, stosując 14 stosów z (z-stacks) obejmujących grubość tkanki 19.5 µm z interwałem 1.5 µm, co umożliwiło wizualizację w widoku apikalnym, rotacyjnym poziomym, rotacyjnym pionowym oraz bocznym (A i B). (C) Analiza ilościowa skupisk komórek monocytów wykazuje zwiększony (p&lt;0.0001) rozmiar wczesnych skupisk ziarniniaków po zakażeniu M. tuberculosis w porównaniu do braku zakażenia. (D) Ilościowe oznaczenie liczby monocytów wykazało spadek (p&lt;0.01) w tkance zakażonej w porównaniu do tkanki niezakażonej, co potwierdza obecność większej liczby skupisk w tkance zakażonej. Zielony – M. tuberculosis-GFP, Czerwony – monocyty znakowane PKH26, Niebieski – jądra komórkowe, skala – 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Zakażenie gruźlicą u ludzi jest złożonym procesem, który jest trudny do modelowania in vitro. W tym miejscu opisujemy nowatorski model 3D ludzkiej tkanki płucnej, który podsumowuje dynamikę zachodzącą podczas infekcji, w tym migrację komórek odpornościowych i wczesne tworzenie ziarniniaka w środowisku fizjologicznym.

Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie in vitro modelu tkanki płucnej do badań nad zakażeniem M tuberculosis. Jest to realizowane poprzez najpierw nałożenie kolagenowej macierzy fibroblastów na filtr wkładki do płytki hodowlanej. W drugim kroku zakażone komórki odpornościowe oraz nabłonkowe komórki płuc są osadzane na warstwie kolagenu fibroblastów.Otrzymany trójwymiarowy model tkanki poddaje się następnie ekspozycji na powietrze, aby ułatwić sekrecję śluzu i stratyfikację nabłonka. W ostatnim kroku tkanka jest pobierana i montowana. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną do analizy tworzenia wczesnych ziarniniaków indukowanych przez M tuberculosis.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak monowarstwy komórek in vitro, jest fakt, że komórki w tym systemie znajdują się w mikrośrodowisku 3D, co umożliwia tworzenie ziarniniaków po zakażeniu zjadliwymi mikrobakteriami, przypominającymi ludzką gruźlicę. Aby przygotować fibroblasty zatopione w kolagenie, należy rozpocząć od potraktowania komórek fibroblastów płuc trypsyną przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Gdy komórki odkleją się, reakcję należy zatrzymać za pomocą 8 ml kompletnego DMEM, a następnie odwirować komórki. Osad należy resuspender w świeżym DMEM do stężenia 230 000 komórek/ml i umieścić komórki na lodzie. Następnie do każdej studni płytki sześciodołkowej należy włożyć jeden insert.Płytkę wielodołkową i dozować jeden mililitr świeżo przygotowanej mieszaniny warstwy acelularnej do każdego wkładu, upewniając się, że mieszanina pokrywa cały wkład i nie ma w niej pęcherzyków powietrza. Następnie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po zakończeniu inkubacji zmieszać dwa mililitry kolagenu z 615 µl premiksu w sterylnej probówce stożkowej na lodzie, aby zneutralizować pH kolagenu na jeden wkład.Następnie do mieszaniny kolagenu dodać 58 µL kompletnego medium DMEM oraz 327 µL fibroblastów płucnych na każdy insert. Pipetować w górę i w dół, aby równomiernie rozdzielić komórki w mieszaninie. Teraz szybko nanieść 3 mL warstwy komórkowej po ściance każdego insertu na każdą acellularną warstwę kolagenu.Należy zadbać o to, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na kolejne dwie godziny. Po polimeryzacji kolagenu dodać dwa mililitry kompletnej pożywki dmem na dno każdej studni i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny. Następnego dnia, używając czystej pęsety, ostrożnie podnosić wkładki jedna po drugiej i odessać pożywkę hodowlaną z dna każdej z nich.Następnie należy dodać 2 mL kompletnego pożywki DMM do dna każdej studni oraz 2 mL kompletnej pożywki DMM do każdego wkładu. Obie objętości medium należy wymieniać co drugi dzień przez okres od pięciu do siedmiu dni. Aby przygotować zainfekowane makrofagi, należy rozpocząć od inkubacji hodowli makrofagów przez cztery godziny z wirulentnymi szczepami M tuberculosis przy multiplicity of infection wynoszącej 10.Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki trzy razy roztworem PBS, aby usunąć bakterie pozakomórkowe, a następnie potraktować makrofagi 2 mM DTPA przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po odklejeniu się komórek zawiesić je w pełnej pożywce DMM bez antybiotyków. Następnie odessać całą pożywkę z płytki z macierzą kolagenową fibroblastów i dodać 1,5 ml świeżej pełnej pożywki DMM bez antybiotyków do komór zewnętrznych.Następnie wymieszaj monocyty znakowane fluorescencyjnie z zainfekowanymi makrofagami w stosunku pięć do jednego w 50 µL kompletnego medium DMEM bez antybiotyków na każdy insert. Następnie dodaj 50 µL mieszaniny monocytów i makrofagów do wnętrza każdego insertu i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Po godzinie powoli dodaj dwa ml pożywki hodowlanej, spływając po ściankach insertów, aby uniknąć odrywania komórek, i inkubuj hodowle przez kolejne 24 godziny.Aby zasiać hodowle komórkami nabłonkowymi płuc, dodaj 4 miliony komórek nabłonkowych na mililitr w 50 µL kompletnego dmm na wierzch macierzy kolagenowych fibroblastów i komórek odpornościowych. Inkubuj komórki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie dodaj do insertów dwa mililitry kompletnego DMM bez antybiotyków, tak jak właśnie pokazano, i hoduj komórki przez kolejne trzy dni.Pięć dni po wysianiu zainfekowanych makrofagów należy odessać całą pożywkę hodowlaną z płytki i dodać 1,8 mililitrów kompletnego DMM bez antybiotyków do komór zewnętrznych. Następnie, w siódmym dniu po wysianiu, modele tkanek 3D należy wystawić na działanie powietrza w inkubatorze przez dwa dni, nie dodając pożywki do insertu.Całkowicie usuń pożywkę z płytki i inkubuj modele tkankowe w 4%paraldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie, używając skalpela, oddziel błony od wkładów do studzienek. W kolejnym kroku, za pomocą czystego skalpela, ostrożnie odetnij boki modeli tkankowych i podziel każdą tkankę na cztery kwadratowe fragmenty o w przybliżeniu jednakowej wielkości.Przenieś fragmenty na szkiełka podstawowe super frost i pozostaw je do wyschnięcia na pięć minut. Następnie, używając fluorescencyjnego medium montażowego zawierającego antyfade i DPI, zamocuj tkanki i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności do czasu ich wyschnięcia, a następnie zabezpiecz brzegi szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci.Po wyschnięciu lakieru zanurz preparaty w 70% etanolu w celu ich przetransportowania poza obszarem BSL 3. Aby zwizualizować tkanki, wykonaj obrazy 3D od pięciu do 10 różnych pól obejmujących cały fragment tkanki w rozdzielczości 512 na 512 przy zachowaniu grubości tzw. z-stack na poziomie co najmniej 20 µm z odstępem od 1 do 1,5 µm między przekrojami na fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym w celu ilościowej analizy 3D skupisk komórek. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D i wczytaj wybrany obraz.Następnie, korzystając z narzędzia do regulacji wyświetlania, dostosuj każdy kanał pod kątem obrazu, kontrastu, jasności oraz nieprzezroczystości mieszania, aby zoptymalizować renderowanie wolumetryczne i zminimalizować zakłócenia szumem. Następnie, aby zwizualizować powierzchnię tkanki, wybierz czerwony kanał monocytów i za pomocą filtrów ustaw odpowiednie progi, aby ograniczyć wybór czerwonych monocytów lub wykluczyć tło w razie potrzeby. Na koniec wyeksportuj dane do odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia dalszych analiz.Siódmego dnia po wysianiu zakażonych M tuberculosis komórek, mikroskopia konfokalna wykazuje gromadzenie się czerwonych monocytów w miejscu zakażenia, co potwierdza obecność zielonych bakterii, naśladując zmiany w przebiegu ludzkiej gruźlicy znane jako ziarniaki 3D. Wizualizacja zapewnia możliwość interakcji, badania i ilościowego określania wielu cech. Przykładowo, obraz 3D przedstawia na tych zdjęciach skupisko monocytów w miejscu zakażenia M tuberculosis.Przestrzenny układ zielonych bakterii i czerwonych skupisk monocytów można zaobserwować w rzucie apikalnym, rotacyjnym i bocznym. Zgodnie z oczekiwaniami, skupiska te nie były obserwowane w tkankach nieinfected. Ilościowa analiza rozmiaru i liczby monocytów, skupisk komórkowych oraz tkanek zainfekowanych M tuberculosis wykazała, że rozmiar skupisk komórkowych ulega zwiększeniu, podczas gdy liczba pojedynczych monocytów ulega zmniejszeniu w porównaniu do modeli tkanek nieinfected.Potencjalne zastosowania tego modelu tkanki płuc obejmują badanie roli różnych komórek odpornościowych i odporności tkankowej w gruźlicy, badanie fenotypów prątków oraz testowanie kandydatów na leki eliminujących prątki w obrębie ziarniniaka.

a-3d-human-lung-tissue-model-for-functional-studies-on-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Mueller, A. i in. Model eksperymentalny do badania współzakażenia gruźlicą i malarią przy naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)Ten film demonstruje aerozolowe dostarczanie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) do myszy za pomocą systemu komor opartych na nebulizatorze, aby wywołać infekcję płuc, dostarczając kontrolowany i powtarzalny model do badania transmisji gruźlicy drogą powietrzną oraz interakcji gospodarza z patogenem in vivo.

Dostarczanie w aerozoli Mycobacterium tuberculosis w leczeniu infekcji płuc w modelu mysim

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Modele płuc na chipie przewyższają tradycyjne hodowle 2D, naśladując granicę powietrze-ciecz i perfuzję komórek śródbłonka, symulując przepływ krwi i wymianę składników odżywczych, co jest kluczowe dla badań nad fizjologią płuc. Zwiększa to znaczenie badań nad płucami, oferując dynamiczne, fizjologicznie dokładne środowisko, które pomaga w lepszym zrozumieniu i leczeniu infekcji dróg oddechowych.

Immunokompetentny model pęcherzyka płucnego na chipie do badania odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej pęcherzyków płucnych

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj metodę budowy 3D modelu tkanki płucnej do badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis. Technika umożliwia obserwację migracji komórek odpornościowych i formowania się wczesnych granulomów w warunkach in vitro.

Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis

Przeglądaj więcej filmów