Name: Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę izolacji lipoprotein z komórek Caco-2 w celu badania transportu lipidów przez jelito. Technika ta pozwala analizować wielkość cząstek i zrozumieć mechanizmy wchłaniania składników odżywczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Seed Grant Award od California Northstate University College of Pharmacy (dla AMN). Autorzy pragną podziękować California Northstate University College of Pharmacy za pokrycie kosztów publikacji tego artykułu oraz George'owi Talbottowi za pomoc w edycji tego manuskryptu.

1. Konserwacja komórek Caco-2
<ol>
	<li>Korzystanie ze zwykłych naczyń do hodowli tkankowych
	<ol>
		<li>Rozmrozić komórki Caco-2 z zamrożonej fiolki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i natychmiast dodać je do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowych zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco).
		<ol>
			<li>Gdy komórki Caco-2 osiągną 50-70% konfluencji, podziel je 1:6, inkubując komórki z 3 ml 0,05% trypsyny / 0,53 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C, aż do odłączenia (15 min). Aby uniknąć zlepiania się komórek, należy je kilkakrotnie wymieszać, delikatnie pipetując. Dodać 0,5 ml trypsynizowanych komórek do 10 cm naczynia do hodowli tkankowych zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo. Unikaj wirowania naczyń, ponieważ może to spowodować nierównomierne rozproszenie komórek.</li>
		<li>Umieść naczynia na płaskiej powierzchni w inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5% CO2 . Pochyłe powierzchnie mogą również powodować nierównomierne rozproszenie komórek.</li>
		<li>Zmień pożywkę wzrostową dzień po rozpoczęciu inkubacji.</li>
		<li>Monitoruj komórki i rejestruj dzień, w którym osiągną zbieg. Komórki osiągną zbieg komórek w ciągu około 1 tygodnia od dnia ich podziału.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę wzrostową dwa razy w tygodniu, zanim komórki osiągną zbieg. Gdy komórki osiągną zbieg, zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień. Po tym, jak komórki są 7 dni po zlaniu, codziennie zmieniaj pożywkę wzrostową. 
		Uwaga: Komórki są gotowe do eksperymentów, gdy są 13 dni po zlewaniu się (ryc. 1). Ponieważ komórki w końcu staną się mniej efektywne w wytwarzaniu lipoprotein, używaj komórek, które są od 13 do 17 dni po zlaniu 8. Przejdź do kroku 3, aby dowiedzieć się, jak przeprowadzić eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie systemu membran przepuszczalnych
	<ol>
		<li>Zasiać komórki Caco-2 w przepuszczalnym wkładzie membranowym, jak opisano w kroku 1.1.1.1. powyżej. Należy unikać używania komórek z zamrożonej fiolki, ponieważ ich wzrost komórek jest zwykle wolniejszy (okres rekonwalescencji). Na krótko dodać 0,5 ml trypsynizowanych komórek do komory wierzchołkowej (górna komora), która zawiera 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej. Dodać również 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej do komory podstawno-bocznej (dolna komora). 
		Uwaga: Aby uzyskać najlepszą praktykę, najpierw dodaj pożywkę wzrostową do komory wierzchołkowej, a następnie do komory podstawno-bocznej. Podczas usuwania starego podłoża należy usunąć podłoże podstawno-boczne przed podłożem wierzchołkowym. Unikaj szturchania membrany poliwęglanowej, ponieważ może to spowodować pęknięcie membrany.</li>
		<li>Ze względu na słabą widoczność komórek przez membranę poliwęglanową, umieść komórki Caco-2 w zwykłym naczyniu do hodowli tkankowej o podobnej gęstości i użyj tego naczynia do oceny zbiegu komórek.</li>
		<li>Wykonaj kroki 1.1.2-1.1.6 powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Nadekspresja genów
<ol>
	<li>Stosowanie metody regularnej transfekcji
	<ol>
		<li>Wysiewać komórki Caco-2 na szalce do hodowli tkankowej, jak opisano w 1.1.1.1.-1.1.4 powyżej. 
		Uwaga: Gdy komórki są w około 40-50% zlewne, są gotowe do transfekcji.</li>
		<li>Dodać 67 μl odczynnika do transfekcji do 472 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce do mikrowirówki. Unikać kontaktu nierozcieńczonego odczynnika do transfekcji ze ścianką probówki.</li>
		<li>Dodać 23 μg wzmocnionego białka zielonej fluorescencji pLL3,7 (eGFP) 9 do mieszaniny odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp pożywkę wzrostową komórek Caco-2 8 ml 10% FBS w DMEM.</li>
		<li>Dodawać kroplami do naczynia mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo.</li>
		<li>Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zastąp pożywkę w naczyniu 10 ml pożywki wzrostowej dziennie po rozpoczęciu inkubacji.</li>
		<li>Monitoruj ekspresję genów.
		<ol>
			<li>Monitoruj ekspresję genu bez barwienia 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego określ procent komórek, które są zielone. Wartość procentowa reprezentuje wydajność transfekcji.</li>
			<li>Monitoruj ekspresję genów za pomocą barwienia DAPI.
			<ol>
				<li>Umyj komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
				<li>Utrwalić komórki, dodając 10 ml 4% formaldehydu do PBS (10 min inkubacji w temperaturze pokojowej).</li>
				<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
				<li>Inkubować komórki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 8 ml PBS zawierającego 1:500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitoniny.</li>
				<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
				<li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego określ liczbę komórek, które są zielone/niebieskie w stosunku do tych, które są niebieskie (rysunek 2 górny panel). Obliczona wartość procentowa reprezentuje wydajność transfekcji.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystanie z systemu nadekspresji lentiwirusa 10
	<ol>
		<li>Wysiewaj ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK)293T w 15 cm naczyniu do hodowli tkankowej (10% FBS w DMEM jako pożywka wzrostowa). 
		Uwaga: Gdy komórki są w około 60-70% zlewane, są gotowe do transfekcji.</li>
		<li>Dodać 162 μl odczynnika do transfekcji do 1,133 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce do mikrowirówki 11. Unikać kontaktu nierozcieńczonego odczynnika do transfekcji ze ścianką probówki.</li>
		<li>Dodać 24 μg pLL3,7 eGFP (lub innego konstruktu), 15,6 μg elementu odpowiedzi Rev (RRE), 6,0 μg REV i 8,4 μg glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSVG) do mieszaniny odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp pożywkę wzrostową 16 ml 10% FBS w DMEM.</li>
		<li>Dodawać kroplami do naczynia mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo. To normalne, że w tym momencie niektóre z HEK293T komórek są odłączone.</li>
		<li>Umieść naczynie w inkubatorze.</li>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji zastąp pożywkę w naczyniu 25 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Następnego dnia należy zebrać pożywkę wzrostową zawierającą lentiwirusa (pierwsza kolekcja).</li>
		<li>Powtórz krok 2.2.10, aby zebrać więcej lentiwirusa (druga kolekcja).</li>
		<li>Połączyć pierwszą i drugą kolekcję i usunąć resztki komórek przez odwirowanie (2 500 x g przez 5 minut).</li>
		<li>Przefiltrować kolekcję za pomocą jednorazowego filtra butelkowego (por 0,45 μm) i zagęścić wirusa, odwirowując kolekcję przy 31 400 x g przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (wirnik JA-20). Zaznacz spód probówki wirówki, w której znajduje się osad. Zdekantować supernatant i pozostawić probówkę odwróconą do góry dnem w temperaturze pokojowej na około 15 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad zawierający wirusa w 100 μl 1X PBS. Unikaj bąbelków.</li>
		<li>Skoncentrowany wirus należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Określ optymalną ilość wirusa potrzebną do transdukcji komórek Caco-2 przez miareczkowanie. Aby obniżyć koszty, do miareczkowania należy użyć 24-dołkowej płytki (0,3 ml pożywki wzrostowej/dołka) zamiast 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej.
		<ol>
			<li>Dodawać coraz większe ilości skoncentrowanego wirusa (0, 1, 2, 5, 10, 25 i 50 μl/studzienkę) uzupełnionego polibrenem (stężenie końcowe = 5 μg/ml) do 40-70% zlewających się komórek Caco-2. Delikatnie wstrząsnąć płytką 24-dołkową zgodnie z opisem w ppkt 1.1.2.</li>
			<li>Monitoruj ich ekspresję genów (Krok 2.1.10.) (Rysunek 2, 4 dolne panele).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ponieważ ekspresja transgenu jest na ogół utrzymywana, należy zachować transdukowane komórki do przyszłych eksperymentów i stale monitorować ich ekspresję genów (Krok 2.1.10.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stymulacja wydzielania lipoprotein
<ol>
	<li>Korzystanie ze zwykłego naczynia do hodowli tkankowej
	<ol>
		<li>Przygotuj 100-krotną mieszaninę lipidów, mieszając 50 mg kwasu oleinowego, 40 mg lecytyny i 48 mg taurocholanu sodu. Doprowadzić objętość do 900 μl za pomocą PBS (wystarcza na 8 potraw). Energicznie zmieszaj mieszaninę lipidów.</li>
		<li>Dodać 900 μl mieszaniny lipidów 100X do 89,1 ml pożywki wzrostowej. Wymieszać i przefiltrować pożywki zawierające lipidy. Końcowe stężenia (1X) kwasu oleinowego, lecytyny i taurocholanu sodu wynoszą odpowiednio 2,0 mM, 1,36 mM i 1,0 mM.</li>
		<li>Dodać do komórek 10 ml pożywki zawierającej lipidy.</li>
		<li>Inkubować komórki z pożywką zawierającą lipidy przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej do komórek, aby zebrać wydzielinę lipoprotein.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zbierz pożywkę zawierającą lipoproteiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie systemu membran przepuszczalnych
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 3.1.1-3.1.2, aby przygotować mieszaninę lipidów.</li>
		<li>Dodać 10 ml pożywki zawierającej lipidy do komory wierzchołkowej i 10 ml pożywki wzrostowej do komory podstawno-bocznej.</li>
		<li>Inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Zbierz pożywkę zawierającą lipoproteiny w komorze podstawno-bocznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja lipoprotein (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Usunąć resztki komórek z pożywki zawierającej lipoproteiny przez odwirowanie (2 000 x g przez 5 minut).</li>
	<li>Przelać pożywkę do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 5,95 g chlorku sodu do pożywki.</li>
	<li>Jeśli próbka będzie analizowana przez TEM, dodaj 1 tabletkę koktajlową inhibitora proteazy, aby zachować integralność lipoprotein.</li>
	<li>Doprowadzić objętość do 23 ml wodą (1,2 g/ml roztworu o gęstości NaCl).</li>
	<li>Całkowicie rozpuść substancje rozpuszczone.</li>
	<li>Przelać cały roztwór do probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć roztwór o gęstości 1,2 g/ml na 0,5 ml wody (o gęstości 1,0 g/ml).</li>
	<li>Zrównoważ rurkę wagowo, a nie objętościowo.</li>
	<li>Delikatnie załaduj rurki do wirnika T865.</li>
	<li>Wirować próbki w ultrawirówce o wymiarach 429,460 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Natychmiast odizolować górną ilość 0,5 ml roztworu, delikatnie pipetując. Trzymaj rurkę tak nieruchomo, jak to możliwe.</li>
</ol>
5. Analiza TEM
<ol>
	<li>Przygotować 5 ml 2% kwasu fosfowolframowego (w/v) i dostosować pH do 6,0.</li>
	<li>Przefiltrować 2% kwas fosfowolframowy za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów: 0,2 μm).</li>
	<li>Upuść 20 μl próbki lipoprotein na sterylne naczynie.</li>
	<li>Upuść 20 μl przefiltrowanego 2% kwasu fosfowolframowego obok próbki na tym samym naczyniu.</li>
	<li>Delikatnie upuść siatkę EM stroną spoczywającą na próbce.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w bok siatki EM o bibułę filtracyjną, aby usunąć próbkę z siatki.</li>
	<li>Delikatnie upuść siatkę EM stroną spoczywającą na 2% kwasie fosfowolframowym.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w bok siatki EM w bibułę filtracyjną, aby usunąć kwas fosfowolframowy z siatki.</li>
	<li>Za pomocą TEM uchwyć obrazy lipoprotein (ryc. 4).</li>
</ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W artykule opisano dwa systemy, które można wykorzystać do utrzymania komórek Caco-2, a mianowicie zwykłe naczynie do hodowli tkankowej i przepuszczalną błonę. Korzyści płynące z zastosowania systemu błon przepuszczalnych obejmują oddzielenie przedziału wierzchołkowego i podstawno-bocznego oraz możliwość jednoczesnej inkubacji mieszaniny lipidów i zbierania wydzieliny lipoprotein. Jednak przepuszczalne wkłady membranowe są drogie, a ich membrana poliwęglanowa nie pozwala na dobrą widoczność komórek. Jedną z zalet tego mo...

Badania wchłaniania jelitowego tłuszczu w diecie oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków i witamin mogą być prowadzone in vivo przy użyciu modelu przetoki limfatycznej 1–4. Jednak stosowane techniki chirurgiczne są nie tylko trudne, ale także kosztowne. Chociaż można stosować podejścia in vivo oparte na analizie kału, stosuje się je głównie do określenia procentowego wychwytu przez przewód pokarmowy 2,5. Model in vitro opisany w tym artykule jest bardziej opłacalny, a stosowane techniki są prawdopodobnie mniej wymagające. Badania nad modyfikacją genetyczną są również bardziej ekonomiczne i mniej czasochłonne, gdy są prowadzone przy użyciu tego modelu in vitro.
Ponieważ rozpuszczalne w tłuszczach materiały pobierane przez enterocyty są pakowane w lipoproteiny 6,7, skuteczność tego modelu in vitro do produkcji lipoprotein jest kluczowa. Dwie główne lipoproteiny jelitowe to chylomikrony i lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Chylomikrony, zdefiniowane jako lipoproteiny o średnicy 80 nm lub większej, są wytwarzane wyłącznie przez jelito cienkie, gdy lipidy są obficie obecne w świetle przewodu pokarmowego. Ponieważ są to największe lipoproteiny, chylomikrony są prawdopodobnie najbardziej wydajnymi transporterami lipidów. Ten model in vitro, który jest zdolny do wytwarzania chylomikronów 8, może być wykorzystany do badania wchłaniania tłuszczu w diecie, wchłaniania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach przez jelita oraz biodostępności doustnych leków lipofilowych. Obecność cząsteczek rozpuszczalnych w tłuszczach, witamin lub leków we frakcji lipoprotein jest wskaźnikiem ich wchłaniania przez jelito cienkie. Jak omówiono wcześniej, model ten może być wykorzystany do poprawy biodostępności doustnych leków lipofilowych 6.
Ten artykuł opisuje, jak komórki Caco-2 powinny być utrzymywane w przepuszczalnej błonie lub zwykłych naczyniach do hodowli tkankowych, jak powinna być przygotowana mieszanina lipidów do stymulowania produkcji lipoprotein, jak można wykorzystać system ekspresji lentiwirusa do osiągnięcia efektywnej nadekspresji i jak powinny być analizowane izolowane lipoproteiny.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Przed dodaniem komórek należy wstępnie podgrzać pożywkę wzrostową w indywidualnym naczyniu do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>Nie podgrzewamy dezaktywacji naszej surowicy</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Komórki można myć PBS przed leczeniem trypsyną&nbsp;</td></tr><tr><td>System membran przepuszczalnych</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>10-centymetrowa płytka, porów 3 mm, membrana poliwęglanowa</td></tr><tr><td>10 cm Fisher</td><td></td><td>08-772-E</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Naczynie 15 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Płytka do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Może być zastąpiony innym odczynnikiem do transfekcji</td></tr><tr><td>Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>0,45 mm por</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Zapobiegaj cyklowi zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Lecytyna&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Lecytyna jajeczna&nbsp;</td></tr><tr><td>Taulocholan sodu</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Produkt wycofany z produkcji; Alternatywny numer katalogowy: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy (bez EDTA)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Stosowany głównie do próbek, które wymagają analizy TEM</td></tr><tr><td>Probówka do ultrawirówki z poliwęglanu</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Wielokrotne użycie spowoduje zapadnięcie się rurki</td></tr><tr><td>Pokrywka do probówki do ultrawirówki</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>Do wyjęcia rurki/pokrywy z wirnika potrzebne jest narzędzie</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Jednorazowy</td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Wielkość porów = 0,2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Kwas fosfowolframowy</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>Do przygotowania 2% kwasu fosfowolframowego, pH 6,0</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Bardzo drobne i mocne końcówki</td></tr><tr><td>Formvar/siatka węglowa</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/siatka kwadratowa z folii węglowej 400 Miedź</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie komórek caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Badania nad wchłanianiem tłuszczu w diecie są zazwyczaj prowadzone przy użyciu modelu zwierzęcego wyposażonego w kaniulę limfatyczną. Chociaż ten model zwierzęcy jest powszechnie akceptowany jako model wchłaniania tłuszczu w diecie in vivo, stosowane techniki chirurgiczne są trudne i kosztowne. Manipulacja genetyczna modelu zwierzęcego jest również kosztowna i czasochłonna. Alternatywny model in vitro jest prawdopodobnie bardziej przystępny cenowo, oszczędza czas i jest mniej wymagający. Co ważne, model in vitro pozwala badaczom badać enterocyty jako wyizolowany system, zmniejszając złożoność nieodłącznie związaną z modelem całego organizmu. W artykule opisano, w jaki sposób ludzkie komórki raka jelita grubego (Caco-2) mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków i witamin. Wyjaśnia prawidłowe utrzymanie komórek Caco-2 i przygotowanie ich mieszaniny lipidowej; Dalej omówiono cenną opcję zastosowania systemu membran przepuszczalnych. Ponieważ zróżnicowane komórki Caco-2 są spolaryzowane, główną zaletą stosowania przepuszczalnego systemu błonowego jest to, że oddziela on przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego. W związku z tym mieszaninę lipidów można dodać do przedziału wierzchołkowego, podczas gdy lipoproteiny można pobrać z przedziału podstawno-bocznego. Ponadto omówiono skuteczność systemu ekspresji lentiwirusa w zwiększaniu ekspresji genów w komórkach Caco-2. Wreszcie, w artykule opisano, w jaki sposób potwierdzić pomyślną izolację lipoprotein jelitowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Rysunek 1 przedstawia prawidłowe komórki Caco-2 w 13. dniu po osiągnięciu konfluencji. Pojawienie się struktur w kształcie kopuł oraz wewnątrzkomórkowych kropel lipidowych jest charakterystyczne dla zróżnicowanych komórek Caco-2. Jeśli komórki Caco-2 nie zostaną równomiernie rozproszone podczas siewu, będą one tworzyć skupiska i nadmiernie rozrastać się w niektórych obszarach naczynia, podczas gdy w innych obszarach nie będzie żadnych komórek. Należy unikać wirowania oraz kładzenia naczynia na nachylonej...

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie transportu cząsteczek rozpuszczalnych w tłuszczach przez jelito. Jest to realizowane poprzez umieszczenie zróżnicowanych komórek Caco 2 w wkłady typu Transwell. Następnie komórki Caco 2 inkubuje się z mieszaniną lipidów i stymuluje wydzielanie lipoprotein.Następnie lipoproteiny izoluje się za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku sodu. Na koniec wyizolowane lipoproteiny barwi się negatywnie kwasem fosfotungstowym. Ostatecznie analiza wielkości cząstek służy do wykazania względnej zawartości chylomikronów w stosunku do lipoprotein o bardzo niskiej gęstości.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu lipidów dietetycznych przez jelito, można ją również zastosować w innych układach, np. do określania biodostępności doustnych leków lipidowych. Po przeprowadzeniu nadekspresji genów i monitorowaniu zgodnie z protokołem tekstowym, należy utrzymać dwie linie komórek KCO wykazujących nadekspresję genów. Wykorzystując komórki, które osiągnęły 50 do 70% konfluencji, należy przeprowadzić pasaż komórek w stosunku 1:6, dodając 3 mL 0,05% trypsyny oraz 0,53 mM EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C; gdy komórki odkleją się, należy je delikatnie pipetować kilka razy, aby uniknąć tworzenia agregatów.Następnie, po przeniesieniu 0,5 mililitra komórek do górnej komory wkładu z przepuszczalną membraną zawierającego 10 mililitrów podgrzanego medium wzrostowego, dodaj 10 mililitrów ciepłego medium wzrostowego do dolnej komory bocznej. Delikatnie potrząśnij szalkami kilka razy w ruchu przód-tył.Należy unikać wirowania naczyń, ponieważ może to doprowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia komórek. Naczynia należy umieścić na płaskiej powierzchni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. Następnego dnia należy wymienić pożywkę wzrostową i kontynuować jej wymianę zgodnie z protokołem tekstowym.Przygotuj 100-krotną mieszaninę lipidową, dodając 900 µL PBS do 50 mg kwasu oleinowego. Wymieszaj zawartość za pomocą wirówki vortex. Przenieś całą mieszaninę kwasu oleinowego do probówki zawierającej 40 mg HAN i 48 mg taurotaranu sodu. Rozpuść mieszaninę lipidową poprzez intensywne mieszanie w wirówce vortex.Dodaj 900 µL mieszaniny lipidów do 89,1 ml pożywki wzrostowej i przefiltruj roztwór, aby uzyskać końcowe stężenia w pożywce przedstawione tutaj. Wykorzystując komórki Caco-2 w 13. dniu po osiągnięciu konfluencji, hodowane na wkładkach z przepuszczalnej membrany, dodaj 10 ml pożywki zawierającej lipidy do komory apikalnej oraz 10 ml pożywki wzrostowej do komory bazolateralnej.Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 °C przed zebraniem pożywki zawierającej lipoproteiny z komory bazolateralnej. Aby wyizolować lipoproteiny, usunąć pozostałości komórkowe z pożywki zawierającej lipoproteiny poprzez wirowanie przy 2000 ×g przez pięć minut. Przelać pożywkę do probówki o pojemności 50 ml, następnie dodać 5,95 g chlorku sodu, a w przypadku analizy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) dodać jedną tabletkę inhibitora proteaz.Dopełnić objętość do 23 mililitrów wodą i całkowicie rozpuścić substancje rozpuszczone. Następnie przelać roztwór do poliwęglanowej probówki do ultrawirówki. Nalać ostrożnie 0,5 mililitra wody na powierzchnię roztworu o gęstości 1,2 grama na mililitr.Następnie zrównoważyć probówki pod względem masy. Umieścić probówki w rotorze T 8 65 i przeprowadzić ultrawirowanie przy 429 460 ×g w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Następnie, starając się nie poruszać probówką, niezwłocznie pobrać górne 0,5 ml roztworu.Aby przeprowadzić analizę TEM, należy przygotować pięć mililitrów 2% kwasu fosforowego i dostosować pH do wartości 6,0. Roztwór należy przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze oczek 0,2 µm. Na sterylną płytkę należy nanieść 20 µl próbki lipoprotein.Następnie nanieś 20 µL przefiltrowanego kwasu fosfotungowego obok próbki na tę samą płytkę, kierując matową stroną w stronę próbki. Delikatnie nałóż siatkę EM na kroplę lipoprotein i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie delikatnie dotknij krawędzi siatki papierem filtrującym, aby usunąć nadmiar próbki z siatki.Następnie ostrożnie opuść siatkę tą samą stroną na kroplę kwasu fosforycznego i inkubuj przez jedną minutę, a następnie delikatnie otrzep siatkę o papier filtracyjny, aby usunąć nadmiar roztworu. Na koniec wykonaj TEM, aby uzyskać obrazy lipoprotein. Przedstawione tutaj prawidłowe komórki Caco-2 w 13. dniu po osiągnięciu konfluencji wykazują struktury w kształcie kopuł oraz wewnątrzkomórkowe kropelki lipidowe, które są charakterystyczne dla zróżnicowanych komórek Caco-2.Na tym etapie należy delikatnie dodać nową pożywkę, ponieważ komórki są bardziej podatne na odrywanie się. Przy użyciu metody ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku sodu wyizolowano lipoproteiny wydzielane przez komórki Caco-2, a następnie poddano je analizie TEM. Przedstawiono tutaj niektóre chylomikrony, czyli lipoproteiny o średnicy większej niż 80 nm.Obecne są również mniejsze cząsteczki v LDL. Wysoki odsetek cząsteczek chylomikronów w stosunku do całkowitej liczby cząsteczek lipoprotein wskazuje na wydajny transport lipidów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu nauk farmaceutycznych do szerszego zbadania biodostępności doustnych leków lipofilnych.

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę in vitro do oceny biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności. Technika ta łączy symulację trawienia człowieka wraz z wychwytem żelaza przez zróżnicowane komórki Caco-2. Wewnątrzkomórkowe tworzenie ferrytyny działa jako marker komórkowego wychwytu żelaza.

Test biologiczny komórek Caco-2: metoda in vitro do pomiaru biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Ten protokół opisuje izolację i hodowlę mieszanych mysich komórek jelita cienkiego. Te pierwotne hodowle jelitowe umożliwiają badanie szlaków sygnałowych leżących u podstaw wydzielania peptydów jelitowych przy użyciu wielu technik.

Mieszane pierwotne hodowle mysiego jelita cienkiego przeznaczone do badania wydzielania hormonów jelitowych i obrazowania żywych komórek enteroendokrynnych

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Test biologiczny komórek Caco-2 na biodostępność żelaza (Fe) stanowi opłacalne i wszechstronne podejście do oceny biodostępności Fe z żywności, produktów spożywczych, suplementów, posiłków, a nawet schematów dietetycznych. Dokładnie zwalidowany w badaniach na ludziach, reprezentuje stan wiedzy w zakresie badań nad biodostępnością Fe.

Test biologiczny komórek Caco-2 do pomiaru biodostępności żelaza w żywności

Poznaj metodę izolacji lipoprotein z komórek Caco-2 w celu badania transportu lipidów przez jelito. Technika ta pozwala analizować wielkość cząstek i zrozumieć mechanizmy wchłaniania składników odżywczych.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Przeglądaj więcej filmów