Name: Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego wrażliwego na hormony. Technika ta pozwala badać wpływ estrogenów, progesteronu i prolaktyny na morfogenezę komórek gruczołu mlekowego oraz rozwój terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo doceniamy wkład redakcyjny Cheryl Schaeberle. Badania te były wspierane przez Avon Grants #02-2009-093 i 02-2011-095 oraz NIEHS/NIH ES 08314 dla AMS. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Rozpuść syntetyczny progestagen promegeston (R5020) i 17-β-estradiol (E2) w etanolu, aby uzyskać 10-3 M roztwory podstawowe. Rozpuścić prolaktynę w destylowanej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Rozpuść antyestrogen ICI 182,780 w DMSO, aby uzyskać 10-2M roztwór podstawowy. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze -20 ° C do 6 miesięcy.</li>
	<li>Surowica pozbawiona dekstranu węglowego (CD) i pożywki CDFBS:
	<ol>
		<li>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 57 °C przez 30 min. 
		Uwaga: Do pozostałej części tego protokołu należy używać wyłącznie naczyń szklanych mytych kwasem.</li>
		<li>Oblicz potrzebną ilość węgla drzewnego. Używając o 10% więcej objętości niż ilość surowicy, aby skompensować przemieszczenie spowodowane przez węgiel drzewny, zważ 5% wag./obj. aktywowanego węgla drzewnego w proszku.</li>
		<li>Umyj węgiel drzewny dwukrotnie zimną dejonizowaną wodą destylowaną, używając tej samej objętości co ilość serum. Dla każdego mycia odwirować przy 50 x g przez 2 minuty, aby granulować węgiel drzewny. Usuń wodę między praniami. Dodaj 0,5% wag./obj. Dekstran T-70 do ostatniej granulki węgla drzewnego. Zawiesić w destylowanej, dejonizowanej wodzie i odwirować przy 100 x g przez 5 minut. Zassać wodę.</li>
		<li>Dodaj odpowiednią objętość surowicy do granulki i ponownie zawiesić granulkę dekstranu z węgla drzewnego w surowicy. Inkubować podczas walcowania (6 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 60 min. Wirować przy 2.000 x g przez 20 min. Jeśli sklarkat wydaje się mętny, powtórzyć wirowanie; Jednak surowica może nie być całkowicie przezroczysta w tym czasie, ale zostanie usunięta podczas filtracji.</li>
		<li>Przefiltruj przez filtr 0,80 mikrona, a następnie ponownie przez filtr 0,45 mikrona, aby usunąć większe cząstki stałe. Na koniec wysterylizuj filtr za pomocą filtra 0,20 mikrona. Przefiltrowane CDFBS należy przechowywać w szklanych probówkach lub kolbach hodowlanych T-25 w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Pożywka zawierająca dekstran węglowy (pożywka CDFBS): zmieszać 375 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej i 125 ml DMEM/F-12. Usunąć 37,5 ml i zastąpić go taką samą objętością surowicy bydlęcej Charcoal Dextran Stripped Fetal Bullal. Dodać 106 U/ml penicyliny i L-glutaminy do końcowego stężenia 2 mM. Otrzymane podłoże to 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Węgiel drzewny pozbawiony dekstranu-FBS, 2 mM L-glutaminy i 106 U / ml penicyliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10X PBS, 1N NaOH i destylowaną wodę dejonizowaną. Przygotuj wystarczającą objętość każdego z nich zgodnie z potrzebną objętością roztworu kolagenu. Wysterylizuj wszystkie roztwory przez filtrowanie. Przechowuj 10x PBS i sterylną destylowaną wodę dejonizowaną w temperaturze 4 ° C przez okres do 1 miesiąca. Nie przechowywać roztworu 1N NaOH.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu o stężeniu końcowym 1 mg/ml zgodnie z protokołem "Alternatywnej procedury żelowania kolagenu I, ogon szczura" dostarczonym przez producenta. Każdy żel składa się z 1,5 ml roztworu kolagenu. Na przykład przygotuj 18,5 ml (0,5 ml w celu uwzględnienia ubytku podczas pipetowania) roztworu kolagenu, aby przygotować 12 żeli. Roztwór kolagenu należy stosować od razu lub trzymać na lodzie do 2-3 godzin.</li>
	<li>Barwnik karminowy ałun:
	<ol>
		<li>Połącz 1 g karminu i 2,5 g siarczanu glinu potasu w 500 ml wody destylowanej. Gotować mieszając przez 20 minut. Obserwuj uważnie, aby uniknąć wykipienia. Dostosuj końcową objętość z powrotem do 500 ml za pomocą dodatkowej wody destylowanej.</li>
		<li>Dodaj kryształ tymolu dla aktywności przeciwdrobnoustrojowej i przykryj butelkę folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Przefiltruj przez papierowy filtr klasy laboratoryjnej przed każdym użyciem. Używaj ponownie roztworu karminu przez okres do trzech miesięcy. Przechowywać w temperaturze RT, chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór kolagenazy: rozpuścić kolagenazę w pożywce DMEM/F12 w stężeniu 0,125% w/v. Nie przechowuj tego roztworu.</li>
</ol>
2. 3D Hodowla komórek T47D w żelach z kolagenem typu 1 ze szczurzego ogona i leczenie hormonalne
Uwaga: sterylne pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową i przeprowadzić zliczanie komórek. Podziel hodowle komórek T47D, zanim osiągną 70% konfluencji. Odwirować objętość zawierającą potrzebną ilość komórek. Weź pod uwagę, że jeden żel powinien zawierać około 75 000 komórek T47D.</li>
	<li>Za pomocą zimnej pipety ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości kolagenu. Weź pod uwagę, że każdy żel składa się z 1,5 ml kolagenu. Delikatnie wymieszaj komórki i kolagen, aby uniknąć wprowadzania bąbelków.</li>
	<li>Aby zapobiec wpływowi elektryczności statycznej na rozkład komórek, po rozpakowaniu płytki należy wyszczotkować krawędzie, górę i spód płytki 12-dołkowej szczoteczką redukującą ładunki elektrostatyczne. Aby uniknąć gromadzenia się ładunków elektrostatycznych podczas kontaktu z powierzchnią roboczą okapu, umieść tę płytkę na innej 12-dołkowej płytce (pustej płytce), która również została wyszczotkowana szczotką redukującą ładunki elektrostatyczne. Delikatnie wlej 1,5 ml mieszanki do każdego dołka płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją z powrotem w kapturze.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej końcówki p200 ostrożnie oderwij żel delikatnymi okrężnymi ruchami od krawędzi studzienki. Żel powinien również oderwać się od dna studni.</li>
	<li>Rozcieńczyć hormony w pożywkach CDFBS, które mają być dodane do studzienek. Stosować E2 i R5020 w stężeniu końcowym 10 -10 M oraz prolaktynę w stężeniu końcowym 10-7 M. Jako kontrolę, należy użyć pożywki CDFBS bez dodatku hormonów, ale nadal zawierającej największą objętość DMSO równą zastosowanym zapasom hormonów. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 1,5 ml pożywki. Umieść kultury 3D w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 100%. Utrzymuj kultury przez 1 lub 2 tygodnie, zmieniając pożywkę co 2 dni.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie żelu dla całych wierzchowców
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 1,5 ml PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Przenieś żel na szkiełko. Przetnij żel na pół za pomocą zakrzywionego ostrza chirurgicznego. Kontynuuj przetwarzanie z jedną połową, a drugą połowę zachowaj do analizy histologicznej.</li>
	<li>Przenieś połówkę żelu na całe mocowanie na szkiełko. Pozostaw żel do wyschnięcia na 5 minut, a następnie przenieś szkiełko do słoika z kopiną zawierającego 10% formaliny. 
	Uwaga: wszystkie inkubacje powinny być wykonywane w RT.</li>
	<li>Utrwal żele w słoiku coplin na shakerze O/N.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy na shakerze. Przenieś szkiełka do 70% EtOH; Inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce. Przenieś szkiełka do karminowego ałunu O/N.</li>
	<li>Następnego dnia odwodnić szkiełka na shakerze w 70% EtOH, 95% EtOH i 100% EtOH przez 1 godzinę każdy. Przenieś szkiełka do ksylenu dwa razy po 1 godzinę i trzymaj na shakerze. Użyj podłoża montażowego na bazie toluenu do montażu żeli i szkiełek nakrywkowych o grubości 1,5 mm.</li>
	<li>Zbadaj całe mocowania w zwykłym świetle (mikroskop lub stereoskop). Do bardziej szczegółowej analizy kształtu i światła należy użyć mikroskopii konfokalnej i uwidocznić barwnik karminowy za pomocą lasera HeNE 633 nm.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie żelu do analizy histologicznej
<ol>
	<li>Przenieść pozostałą połowę żelu do szklanej fiolki o pojemności 20 ml zawierającej 10% formaliny i utrwalić na shakerze O/N.</li>
	<li>Umyj żele dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy na shakerze. Umieść żele w kasetach przetwórczych do zatapiania parafiny.</li>
	<li>Przenieś żele do 70% EtOH, inkubuj przez 1 godzinę, a następnie 95% EtOH przez 1 godzinę, zmień na świeże 95% EtOH na 1 godzinę, 100% EtOH na 1 godzinę i zmień na świeże 100% EtOH przez 1 godzinę. W tym momencie żele mogą być przechowywane w 100% EtOH O/N w temperaturze pokojowej lub inkubowane z ksylenem przez 1 godzinę, a następnie ponownie w świeżym ksylenie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieść kasety do parafiny na 1 godzinę w temperaturze 60 °C w inkubatorze próżniowym, powtórzyć ze świeżą parafiną jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Napełnij plastikowe formy czystą parafiną. Otwórz kasetę, wyjmij żel i umieść go w plastikowej formie zawierającej parafinę. Napełnij parafiną i dodaj górną część kasety zawierającej etykietę na górze i pozwól blokowi ostygnąć.</li>
	<li>Wyjmij plastikową formę i pokrój blok za pomocą mikrotomu. Uzyskać skrawki o grubości 5 μm do barwienia HE i immunocytochemii.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja komórek z komórek z żeli za pomocą leczenia kolagenazą
<ol>
	<li>Usuń żel ze studzienki i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą PBS. Krótko spłucz żel.</li>
	<li>Przenieść żel do 15 ml probówki zawierającej 2 ml 0,125% kolagenazy. Pipetować w górę i w dół 4-5 razy, aby rozbić żel na małe kawałki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut (do momentu rozpuszczenia żelu i uzyskania zawiesiny komórek)</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą. Zebrać komórki przez odwirowanie (1 000 x g, 5 min), odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki i policzyć.</li>
</ol>

<ol><li>Barnes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+tissues%3A+interactions+between+the+matrix+and+human+breast+cells+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time.</a> PLoS ONE. 9, e93325(2014).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen+responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Nat.Acad.Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture.</a> Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogens+stimulate+cell+proliferation+and+induce+secretory+proteins+in+a+human+breast+cancer+cell+line+%28T47D%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D).</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).</li>
<li>Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+collagen+reorganization+on+mammary+epithelial+morphogenesis+in+a+3D+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model.</a> Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).</li>
<li>Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDhimolea%2C+E+%22J.Biomed.Mat.Res.A%22">J.Biomed.Mat.Res.A</a>. 100, 2905-2912 (2012).</li>
<li>Krause, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+breast+tubulogenesis+using+extracellular+matrix+composition+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).</li>
<li>Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+in+vitro.+culture+model+to+study+stromal-epithelial+interactions+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland.</a> Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).</li>
<li>Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+determines+the+breast+cancer+cells%27+phenotype%3A+organization+of+MCF7+cells+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures.</a> BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing-like+immune+program+facilitates+postpartum+mammary+gland+involution+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression.</a> Int.J.Cancer. , (2014).</li>
<li>Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation%3A+evidence+for+negative+control+on+estrogen-sensitive+T47D+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).</li>
<li>Speroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+epithelial+organization+in+a+3D+breast+tissue+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model.</a> Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).</li>
<li>Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiestrogenic+effect+of+R5020%2C+a+synthetic+progestin+in+human+breast+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture.</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy wrażliwy na hormony model hodowli 3D w celu przetestowania działania hormonów na nabłonek piersi. Odpowiedź na hormony można ocenić na poziomie morfologii tkanki, proliferacji komórek i ekspresji genów 12. Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że wizualizacja w okresie hodowli jest ograniczona do mikroskopii świetlnej, ponieważ kultury są hodowane na plastikowej płycie dolnej. System hodowli 3D można dostosować do szklanych płyt dennych, aby umożliwić obrazowanie kultur na żywo...

W przeciwieństwie do standardowych kultur 2D, modele zastępcze hodowli komórkowych 3D pozwalają na badanie zachowania komórek nabłonka w fizjologicznie istotnym kontekście, przypominającym tissue. 3D hodowle gruczołu sutkowego pomogły wyjaśnić wiele aspektów rozwoju gruczołu sutkowego i neoplazji. Jednak większość obecnie dostępnych modeli hodowli 3D nie nadaje się do badania działania hormonów, ponieważ ludzkie linie komórkowe nabłonka używane do tego zadania nie mają ekspresji receptorów hormonalnych 6,7,9.
Tutaj opisujemy model 3D kulturowy ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów 12. Model ten wykorzystuje dostępną na rynku reagującą na hormony linię komórek nabłonka piersi ludzkiej, T47D 3,11,13, która pierwotnie pochodziła z wysięku opłucnowego uzyskanego od 54-letniej pacjentki z naciekającym rakiem przewodowym piersi. Jako matrycę używamy kolagenu typu 1 z ogona szczura. Ten model hodowli 3D jest odpowiedni do badania działania trzech głównych hormonów mammotropowych (estradiolu, promegestonu (analogu progesteronu) i prolaktyny) na ludzkie komórki nabłonka piersi. Morfologię nabłonka indukowaną hormonami można ocenić ilościowo w czasie za pomocą analizy morfometrycznej12.
Odpowiednia gęstość wysiewu pozwala na przechowywanie tych kultur 3D przez 2 tygodnie. Do tego czasu rozwój struktur jest wystarczający do solidnej oceny ilościowej działania hormonów na morfologię nabłonka. Żele mogą być również zbierane we wcześniejszych punktach czasowych w celu analizy proliferacji komórek i ekspresji genów. Dodatkowo model ten nadaje się do testowania efektów sekwencyjnego leczenia hormonalnego; Na przykład po leczeniu estradiolem w pierwszym tygodniu i zastąpieniu go innym hormonem/kombinacją hormonów w następnym tygodniu. Wpływ związków estrogenowych i antyestrogenów, takich jak ICI 182,780, można również badać za pomocą tego modelu hodowli 3D 12.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polistyrenowe probówki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel aktywowany</td><td>Sigma</td><td>C-5510</td><td></td></tr><tr><td>Karminowy ałun</td><td>Sigma</td><td>C1022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ 3</td><td>Worthington</td><td>S0C11784</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Wyposażony w laser HeNe 633nm</td></tr><tr><td>Dextran T-70</td><td>Abersham/Pharmacia</td><td>17-0280-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11339-021</td><td>Pożywka bez czerwieni fenolowej do stosowania hormonalnego</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Life Technologies</td><td>11054-020</td><td>Pożywka bez czerwieni fenolowej do stosowania hormonalnego</td></tr><tr><td>17-&beta;-estradiol</td><td>EMD Millipore</td><td>3301</td><td>rozpuszczony w etanolu</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Hykon</td> <td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>SH30070.03</td><td>Do stosowania z hormonami musi być usunięty dekstran z węgla drzewnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtry (115 ml)</td><td>Nalgene</td><td>380-0080, 245-0045, 120-0020</td><td>odpowiednio 0,88, 0,45, 0,20 mikrona&nbsp;</td></tr><tr><td>Formalina, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93-20</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780 (fulwestrant)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4409-25MG</td><td>rozpuszczona w</td></tr><tr><td>mikrotomie DMSO&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do zatapiania tkanek</td><td>McCormick Scientific</td><td>39502004</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma</td><td>7794-10MU</td><td>Rozpuszczona w 10 ml destylowanej wody dejonizowanej</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Prolaktyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4021-50UG</td><td>Rozpuszczony w destylowanej wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Promegeston</td><td>Perkin Elmer</td><td>NLP004005MG</td><td>Rozpuszczony w etanolu</td></tr><tr><td>Kolagen ze szczurzego ogona&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>Partie mogą zawierać różne stężenia, należy na to zwrócić uwagę Skalpel</td></tr><tr><td></td><td>Miltex</td><td>4311</td><td></td></tr><tr><td>Półzamknięty stacjonarny procesor tkanek</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Przygotuj zapas 1N NaOH</td></tr><tr><td>Szczotka antystatyczna StaticMaster&nbsp;</td><td>Pipety</td> serologiczne Amstat <td>C3500</td><td></td></tr><tr><td>stripette&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T-25</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430168</tr><tr><td>Kasety na tkanki</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-403E</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki pszeniczne, szkło, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95057-822</td><td></td></tr></tbody></table>

reagujący na hormony model hodowli 3d nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Proces morfogenezy nabłonka sutka jest pod wpływem hormonów. Badanie działania hormonów na nabłonek piersi przy użyciu kultur 2D ogranicza się do punktów końcowych proliferacji komórek i ekspresji genów. Jednak w organizmie morfogeneza sutka zachodzi w środowisku 3D. Systemy hodowli 3D pomagają wypełnić lukę między jednowarstwową hodowlą komórkową (2D) a złożonością organizmu. W tym artykule opisujemy model hodowli 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów. Wykorzystuje dostępną na rynku reagującą na hormony ludzką linię komórkową nabłonka piersi, T47D i kolagen typu 1 ze szczurzego ogona jako matrycę. Ten model hodowli 3D reaguje na główne hormony mammotropowe: estradiol, progestageny i prolaktynę. Wpływ tych hormonów na morfogenezę nabłonka można zaobserwować po 1- lub 2-tygodniowym leczeniu w zależności od punktu końcowego. Kultury 3D można pobrać w celu analizy morfogenezy nabłonka, proliferacji komórek i ekspresji genów.

Rysunek 1 podsumowuje procedurę przygotowania hormonowo-wrażliwych kultur 3D. Struktury nabłonkowe obserwuje się w całych preparatach żeli hodowanych przez 2 tygodnie w obecności samego E2 oraz w połączeniu z innymi hormonami. Jedynie pojedyncze komórki lub grupy 2-3 komórek występują w przypadku, gdy do pożywki hodowlanej (pożywka CDFBS) nie dodano hormonów (Rysunek 2). Stan ten służy jako kontrola negatywna.
Komórki w hodowli 3D tworzą struktury różniące się...

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Ogólnym celem tej fizjologicznie istotnej metody hodowli 3D jest przetestowanie działania głównych hormonów mammogennych na morfogenezę nabłonka gruczołu mlekowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu endokrynologii i biologii gruczołu mlekowego, takie jak wpływ estrogenu, progesteronu i prolaktyny na morfogenezę nabłonka gruczołu mlekowego. Główną zaletą tej zestandaryzowanej metody jest to, że wrażliwe na hormony komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą struktury 3D w odpowiedzi na hormony w sposób podobny do obserwowanego in vivo.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie raka piersi, ponieważ stanowi ona fizjologicznie istotny system hodowli złożonego nabłonka piersi człowieka. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas początkowo z powodu zauważonego braku standaryzowanych modeli in vitro do badania wpływu hormonów na morfogenezę piersi u ludzi. Rozpocznij od zliczenia liczby komórek w zawiesinie pojedynczych komórek linii T47D.Sposób utrzymania komórek ma krytyczne znaczenie dla zachowania fenotypów reagujących na hormony. Zalecamy częste sprawdzanie reaktywności komórek T47D – przy czwartym pasażu po rozmrożeniu nowej fiolki oraz co dziesięć p

a-hormone-responsive-3d-culture-model-human-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Opracowaliśmy nowatorski model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Opiera się na mikrostrukturach tkankowych wyizolowanych z chirurgicznych próbek tkanki piersi, które zachowują architekturę tkanki, interakcje międzykomórkowe i sygnalizację parakrynną.

Model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Opisujemy techniki indukcji różnicowania dwóch linii nabłonka piersi, HC11 i EpH4. Podczas gdy obie wymagają płodowej surowicy cielęcej, insuliny i prolaktyny do produkcji białek mleka, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w mammosfery w trójwymiarowej hodowli. Te uzupełniające się modele są przydatne do badań transdukcji sygnału różnicowania i nowotworu.

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Poznaj metodę hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego wrażliwego na hormony. Technika ta pozwala badać wpływ estrogenów, progesteronu i prolaktyny na morfogenezę komórek gruczołu mlekowego oraz rozwój terapii przeciwnowotworowych.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Przeglądaj więcej filmów