Name: Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj syntezę superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza do znakowania komórek i celowania magnetycznego. Metoda obejmuje powlekanie PLGA oraz wizualizację fluorescencyjną w zastosowaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za dofinansowanie z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego - FNUSA-ICRC (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N) oraz National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

1. Synteza żelu magnetytowego
<ol>
	<li>Umyj wszystkie szklane naczynia stężonym kwasem solnym, a następnie wodą dejonizowaną, a następnie alkoholem etylowym. Pozostawić do wyschnięcia O/N, najlepiej w suszarce. 
	OSTROŻNOŚĆ! kwas solny jest szkodliwy – nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem; Alkohol etylowy jest szkodliwy – należy stosować środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Za pomocą butelki Dreschel odgazować 500 ml dejonizowanegoH2O, delikatnie bulgocząc gazemN2 przez 30 minut.</li>
	<li>Ustawić aparat do syntezy magnetytu w dygestoriach chemicznych.
	<ol>
		<li>Umieścić kolbę okrągłodenną o pojemności 500 ml z trzema szyjkami w podgrzewaczu isomantle i zabezpieczyć środkową szyjkę za pomocą clamp i podstawka.</li>
		<li>Zamontować gumową przegrodę w jednej z bocznych szyjek kolby okrągłodennej, a kondensator zwrotny z gumową przegrodą w pozostałej szyjce bocznej. Przez skraplacz zwrotny przepływa zimną wodę w sposób ciągły.</li>
		<li>Przebić gumową przegrodę kolby okrągłodennej igłą podłączoną do przewodu gazowegoN2 i przebić gumową przegrodę chłodnicy zwrotnej igłą podłączoną do przewodu gazowego biegnącego do bełkotki (tj. kolby z wodą) w celu uwidocznienia wypływu gazu.</li>
		<li>Zamontuj łopatkę z ostrzem w środkowej szyjce kolby okrągłodennej za pomocą adaptera łopatkowego. Przymocuj trzpień łopatki ostrza do mieszadła górnego zamontowanego na stojaku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przedmuchnąć kolbę okrągłodenną gazemN2 i pozostawić gazN2 płynący z niską, ale wykrywalną szybkością.</li>
	<li>Wyjąć chłodnicę zwrotną z kolby okrągłodennej i dodać 1.000 g chlorku żelaza(III), 0.6125 g czterowodnego chlorku żelaza(II) i 50 ml odgazowanegoH2O. 
	OSTROŻNOŚĆ! chlorek żelaza(III) i czterowodny chlorek żelaza(II) są szkodliwe – należy stosować środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Wymień chłodnicę zwrotną i mieszaj z prędkością 1 000 obr./min, podgrzewając do 50 °C. Mieszanie w tych warunkach wytwarza nanocząstki magnetytu o średnicy 10 nm.</li>
	<li>Po osiągnięciu temperatury 50 °C dodać 10 ml 28% roztworu wodorotlenku amonu, wstrzykując przez gumową przegrodę do kolby okrągłodennej, wciąż mieszając. 
	OSTROŻNOŚĆ! Wodorotlenek amonu jest szkodliwy – stosować środki ochrony osobistej. 
	UWAGA: Roztwór wodorotlenku amonu służy do wytrącania magnetytu, a roztwór powinien zmienić kolor na.</li>
	<li>Usunąć gumową przegrodę i przewód gazowy N2 z kolby okrągłodennej i podgrzać do 90 °C, aby odgotować gazowy amoniak, nadal mieszając. 
	UWAGA: Utrzymanie przepływu N2 do kolby okrągłodennej poprzez przebicie gumowej przegrody skraplacza refluksowego jest opcjonalne, jednak utlenianie magnetytu do maghemitu jest na tym etapie znikome.</li>
	<li>Po osiągnięciu temperatury 90 °C dodać 1 ml kwasu oleinowego do kolby okrągłodennej, nadal mieszając. Kwas oleinowy służy do powlekania nanocząstek magnetytu w celu utworzenia żelu magnetytowego. 
	OSTROŻNOŚĆ! Kwas oleinowy jest szkodliwy – należy stosować środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Wymienić gumową przegrodę i przewód gazowyN2 na kolbie okrągłodennej i wyjąć skraplacz zwrotny.</li>
	<li>Wyłącz ogień i mieszaj z prędkością 500 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Wyjmij kolbę okrągłodenną z grzałki isomantle i zdekantuj pozostałą ciecz, używając silnego magnesu przyciśniętego do dna kolby, aby zatrzymać żel magnetytowy. 
	OSTROŻNOŚĆ! Z silnym magnesem należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć uszkodzeń lub obrażeń.</li>
	<li>Pozostaw żel magnetytowy do wyschnięcia na powietrzu O/N (opcjonalnie).</li>
</ol>
2. Oczyszczanie żelu magnetytowego
<ol>
	<li>Dodać 40 ml heksanu do kolby okrągłodennej, aby rozpuścić żel magnetytowy 
	OSTROŻNOŚĆ! Heksan jest szkodliwy – należy nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Użyć rozdzielacza z 40 ml odgazowanegoH2O, aby usunąć pozostałościH2Oz roztworu magnetytu.
	<ol>
		<li>Powoli wlać roztwór magnetytu naH2Ow rozdzielaczu i delikatnie mieszać dwufazową ciecz przez 5 minut.</li>
		<li>Odcedź i wyrzuć dolną frakcję wodną.</li>
		<li>Powoli dodać 40 ml odgazowanegoH2Odo rozdzielacza tak, aby osiadł pod roztworem magnetytu, a następnie delikatnie zawirować i odsączyć jak poprzednio.</li>
		<li>Powtórz pranie po raz trzeci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść roztwór magnetytu do kolby Erlenmeyera, dodać kilka szpatułek bezwodnego siarczanu sodu i zawirować, aby usunąć pozostałościH2Oz roztworu magnetytu.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór magnetytu przez bibułę filtracyjną o grubości 1 μm w lejku filtracyjnym w celu usunięcia siarczanu sodu i pozostałościH2O. 
	UWAGA: Zalecane jest wspomaganie odkurzania.</li>
	<li>Przenieść roztwór magnetytu do kolby parownika o pojemności 50 ml i użyć wyparki obrotowej do odparowania heksanu przez 2 godziny w następujących warunkach: umiarkowana prędkość obrotowa, zastosowanie podciśnienia, kolba parownika w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C i woda o temperaturze 24 °C krążąca w skraplaczu. 
	UWAGA: Opcjonalnie należy przechowywać żel magnetytowy przed pokryciem PLGA.</li>
</ol>
3. Powlekanie nanocząstek magnetytu powłoką PLGA
<ol>
	<li>Rozpuścić 3,60 g PLGA (mieszanina 75/25) w 240 ml octanu etylu, aby uzyskać 1,5% (m/v) roztwór. UWAGA: octan etylu jest szkodliwy – nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Rozpuścić 25,00 g Pluronic F-127 w 500 ml odgazowanegoH2Oza pomocą mieszadła magnetycznego, aby uzyskać 5,0% (m/v) roztwór. 
	UWAGA: Pluronic F-127 to niejonowy amfifilowy kopolimer blokowy, który działa jako biokompatybilny środek powierzchniowo czynny. Pomaga ustabilizować emulsję typu olej w wodzie w kroku 3.3.2.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki zebrać żel magnetytowy do sześciu porcji po 0,040 g w ważonych szklanych fiolkach. Przeprowadzić następujący proces powlekania i mycia dla każdej podwielokrotności. 
	UWAGA: Podwielokrotności są niezbędne, aby zapewnić wydajną obsługę i dekantację magnetyczną, co zmaksymalizuje czystość i wydajność, jednocześnie minimalizując degradację przed liofilacją w kroku 4.
	<ol>
		<li>Dodać 0,040 g porcji żelu magnetytowego i 40 ml roztworu PLGA do plastikowej zlewki i sonikować w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 80 ml roztworu Pluronic do plastikowej zlewki i natychmiast emulgować mikserem laboratoryjnym na najwyższym ustawieniu przez 7 minut, aby utworzyć powłokę PLGA na nanocząstkach magnetytu w postaci emulsji typu olej w wodzie.</li>
		<li>Natychmiast rozcieńczyć roztwór SPION w 1 l dejonizowanegoH2Oi sonikować przez 1 godzinę w dygestorium chemicznym w celu odparowania octanu etylu.</li>
		<li>Umieść silny magnes obok roztworu SPION i delikatnie wymieszaj, aby zebrać brązowawe SPION-y na magnesie. 
		UWAGA: Może być konieczne przerywane mieszanie przez kilka godzin, zanim roztwór zmieni kolor na białawy, co oznacza, że większość SPION-ów została zebrana.</li>
		<li>Zdekantować roztwór wodny, zatrzymując SPION-y w zlewce za pomocą magnesu.</li>
		<li>Umyj SPION-y trzy razy w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Zawiesić SPION-y w 1 l dejonizowanegoH2O.</li>
			<li>Sonikować roztwór SPION przez 20 minut.</li>
			<li>Umieść silny magnes obok roztworu SPION i delikatnie wymieszaj, aby zebrać brązowawe SPION-y na magnesie. Może być konieczne przerywane mieszanie przez kilka godzin, zanim roztwór stanie się klarowny, co oznacza, że większość SPION-ów została zebrana.</li>
			<li>Zdekantować roztwór wodny, zatrzymując SPION-y w zlewce za pomocą magnesu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać SPION-y zsyntetyzowane z każdej z sześciu porcji żelu magnetytowego do jednej ważonej szklanej fiolki w postaci zawiesiny wodnej. Opcjonalnie w razie potrzeby zdekantować nadmiar wody magnetycznie.</li>
</ol>
4. Liofilizacja SPION-ów
<ol>
	<li>Zamrozić roztwór SPION.</li>
	<li>Liofilizować roztwór SPION O/N w liofilizatorze.</li>
	<li>Zważyć liofilizowane SPION. Liofilizowane SPION-y mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania do etykietowania komórek. 
	UWAGA: Przechowywanie w temperaturze -20 °C znacznie zmniejsza kinetykę degradacji i wydłuża okres przydatności do spożycia.</li>
</ol>
5. Etykietowanie komórek za pomocą SPION-ów
<ol>
	<li>Zawiesić podwielokrotność SPION-ów w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o stężeniu 40 mg/ml i dokonywać sonikacji przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać roztwór SPION do prawie zlewającej się kolby komórek o stężeniu 5 μl/ml pożywki do hodowli komórkowych. Zapewnić równomierne rozprowadzenie, delikatnie kołysząc kolbą.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Zbieraj komórki znakowane magnetycznie i używaj ich do eksperymentów.</li>
	<li>Niewykorzystany roztwór SPION może być przechowywany w temperaturze 4 °C i powinien zostać zużyty w ciągu kilku miesięcy. Sonikuj przez 30 minut przed każdym użyciem.</li>
</ol>

<ol><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+neural+stem+cells+to+the+brain+using+MRI-guided+focused+ultrasound+to+disrupt+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier.</a> PLoS One. 6 (11), e27877(2011).</li>
<li>Nguyen, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+as+Targeted+Cell+Vehicles+to+Deliver+Drug-loaded+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanomed+Nanotechol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells as Targeted Cell Vehicles to Deliver Drug-loaded Nanoparticles for Cancer Therapy.</a> J Nanomed Nanotechol. 4 (1), e128(2013).</li>
<li>Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Delivery+Routes+and+Engraftment%2C+Cell-Targeting+Strategies%2C+and+Immune+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation.</a> Stem Cells Int. , 732742(2013).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+delivery+into+infarcted+rat+hearts+by+retrograde+intracoronary+infusion%3A+distribution%2C+dynamics%2C+and+influence+on+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function.</a> Circulation. 110 (11 Suppl 1), II225-II230 (2004).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Duckers, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+vascular+repair+following+percutaneous+coronary+intervention+by+capture+of+endothelial+progenitor+cells+promotes+regression+of+neointimal+growth+at+long+term+follow-up%3A+final+results+of+the+Healing+II+trial+using+an+endothelial+progenitor+cell+capturing+stent+%28Genous+R+stent%29%5BTitle%5D)+AND+%22EuroIntervention%22%5BJournal%5D)">Accelerated vascular repair following percutaneous coronary intervention by capture of endothelial progenitor cells promotes regression of neointimal growth at long term follow-up: final results of the Healing II trial using an endothelial progenitor cell capturing stent (Genous R stent).</a> EuroIntervention. 3 (3), 350-358 (2007).</li>
<li>Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles+for+the+manipulation+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells.</a> Chem Soc Rev. 41 (7), 2912-2942 (2012).</li>
<li>Huang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+magnetic+capture+of+magnetically+loaded+cells+for+spatially+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deep magnetic capture of magnetically loaded cells for spatially targeted therapeutics.</a> Biomaterials. 31 (8), 2130-2140 (2010).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Magnetic+Intensities+for+Mesenchymal+Stem+Cell+Targeting+Therapy+on+Ischemic+Myocardial+Repair%3A+High+Magnetic+Intensity+Improves+Cell+Retention+but+Has+No+Additional+Functional+Benefit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparison of Magnetic Intensities for Mesenchymal Stem Cell Targeting Therapy on Ischemic Myocardial Repair: High Magnetic Intensity Improves Cell Retention but Has No Additional Functional Benefit.</a> Cell Transplant. , (2014).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+antibody-linked+nanomatchmakers+for+therapeutic+cell+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Magnetic antibody-linked nanomatchmakers for therapeutic cell targeting.</a> Nat Commun. 5, 4880(2014).</li>
<li>Vandergriff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+of+cardiosphere-derived+stem+cells+with+ferumoxytol+nanoparticles+for+treating+rats+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+enhances+retrograde+cell+retention+in+a+rat+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction.</a> Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149(2013).</li>
<li>Chaudeurge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+magnetic+targeting+of+magnetically+labeled+circulating+cells+optimize+intramyocardial+cell+retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Can magnetic targeting of magnetically labeled circulating cells optimize intramyocardial cell retention.</a> Cell Transplant. 21 (4), 679-691 (2012).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+enhances+engraftment+and+functional+benefit+of+iron-labeled+cardiosphere-derived+cells+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction.</a> Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).</li>
<li>Yanai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+magnetic+stem+cell+targeting+to+the+retina+using+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1137-1148 (2012).</li>
<li>Ordidge, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+cellular+therapy+and+magnetic+targeting+for+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Coupled cellular therapy and magnetic targeting for airway regeneration.</a> Biochem Soc Trans. 42 (3), 657-661 (2014).</li>
<li>El Haj, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+mesenchymal+stem+cell+targeting+using+magnetic+particle+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of mesenchymal stem cell targeting using magnetic particle labelling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2012).</li>
<li>Vanecek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+magnetic+targeting+of+mesenchymal+stem+cells+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Highly efficient magnetic targeting of mesenchymal stem cells in spinal cord injury.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3719-3730 (2012).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+with+magnetic+targeting+of+bone+marrow+stromal+cells+in+a+rat+spinal+cord+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects with magnetic targeting of bone marrow stromal cells in a rat spinal cord injury model.</a> Spine (Phila Pa 1976). 36 (12), 933-938 (2011).</li>
<li>Oshima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+bone+formation+in+an+experimental+bony+defect+using+ferumoxide-labelled+mesenchymal+stromal+cells+and+a+magnetic+targeting+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Enhancement of bone formation in an experimental bony defect using ferumoxide-labelled mesenchymal stromal cells and a magnetic targeting system.</a> J Bone Joint Surg Br. 92 (11), 1606-1613 (2010).</li>
<li>Luciani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+of+iron-oxide-labeled+fluorescent+hepatoma+cells+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting of iron-oxide-labeled fluorescent hepatoma cells to the liver.</a> Eur Radiol. 19 (5), 1087-1096 (2009).</li>
<li>Oshima, S., Kamei, N., Nakasa, T., Yasunaga, Y., Ochi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+muscle+repair+using+human+mesenchymal+stem+cells+with+a+magnetic+targeting+system+in+a+subchronic+muscle+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of muscle repair using human mesenchymal stem cells with a magnetic targeting system in a subchronic muscle injury model.</a> J Orthop Sci. 19 (3), 478-488 (2014).</li>
<li>Ohkawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+of+human+peripheral+blood+CD133%2B+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting of human peripheral blood CD133+ cells for skeletal muscle regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (8), 631-641 (2013).</li>
<li>Tefft, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetizable+Duplex+Steel+Stents+Enable+Endothelial+Cell+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T+Magn%22%5BJournal%5D)">Magnetizable Duplex Steel Stents Enable Endothelial Cell Capture.</a> Ieee T Magn. 49 (1), 463-466 (2013).</li>
<li>Uthamaraj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+novel+ferromagnetic+bare+metal+stent+capable+of+capturing+and+retaining+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ABME%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a novel ferromagnetic bare metal stent capable of capturing and retaining endothelial cells.</a> ABME. 42 (12), 2416-2424 (2014).</li>
<li>Polyak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+field+gradient+targeting+of+magnetic+nanoparticle-loaded+endothelial+cells+to+the+surfaces+of+steel+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High field gradient targeting of magnetic nanoparticle-loaded endothelial cells to the surfaces of steel stents.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (2), 698-703 (2008).</li>
<li>Pislaru, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+targeted+endothelial+cell+localization+in+stented+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Magnetically targeted endothelial cell localization in stented vessels.</a> J Am Coll Cardiol. 48 (9), 1839-1845 (2006).</li>
<li>Pislaru, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1 Suppl), 314-318 (2006).</li>
<li>Wang, Y. X., Xuan, S., Port, M., Idee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+cellular+imaging+and+targeted+therapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Recent advances in superparamagnetic iron oxide nanoparticles for cellular imaging and targeted therapy research.</a> Curr Pharm Des. 19 (37), 6575-6593 (2013).</li>
<li>Yellen, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+to+magnetic+implants+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Magn+Mater%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery to magnetic implants for therapeutic applications.</a> J Magn Magn Mater. 293 (1), 647-654 (2005).</li>
<li>Granot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+viable+magnetic+poly%28lactide-co-glycolide%29+particles+for+MRI-based+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Clinically viable magnetic poly(lactide-co-glycolide) particles for MRI-based cell tracking.</a> Magn Reson Med. , (2013).</li>
<li>Levy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+in+vivo+biotransformation+of+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).</li>
<li>Mirshafiee, V., Mahmoudi, M., Lou, K., Cheng, J., Kraft, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona+significantly+reduces+active+targeting+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Protein corona significantly reduces active targeting yield.</a> Chem Commun (Camb). 49 (25), 2557-2559 (2013).</li>
<li>Salvati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin-functionalized+nanoparticles+lose+their+targeting+capabilities+when+a+biomolecule+corona+adsorbs+on+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Transferrin-functionalized nanoparticles lose their targeting capabilities when a biomolecule corona adsorbs on the surface.</a> Nat Nanotechnol. 8 (2), 137-143 (2013).</li>
<li>Landazuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeting+of+human+mesenchymal+stem+cells+with+internalized+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).</li>
<li>Sun, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+labeling+of+endothelial+progenitor+cells+isolated+from+peripheral+blood+with+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro labeling of endothelial progenitor cells isolated from peripheral blood with superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Mol Med Rep. 6 (2), 282-286 (2012).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viability+of+transplanted+beta+cells+labeled+with+a+novel+contrast+agent+-+polyvinylpyrrolidone-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection of viability of transplanted beta cells labeled with a novel contrast agent - polyvinylpyrrolidone-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by magnetic resonance imaging.</a> Contrast Media Mol Imaging. 7 (1), 35-44 (2012).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+efficacy+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+to+human+neural+stem+cells%3A+comparison+of+ferumoxides%2C+monocrystalline+iron+oxide%2C+cross-linked+iron+oxide+%28CLIO%29-NH2+and+tat-CLIO%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Labeling efficacy of superparamagnetic iron oxide nanoparticles to human neural stem cells: comparison of ferumoxides, monocrystalline iron oxide, cross-linked iron oxide (CLIO)-NH2 and tat-CLIO.</a> Korean J Radiol. 8 (5), 365-371 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podobnie jak w przypadku każdego protokołu syntezy nanocząstek, czystość reagentów chemicznych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości SPION, które będą miały minimalne efekty cytotoksyczne. Dlatego ważne jest, aby kupować bardzo czyste odczynniki, w tym kwas oleinowy (≥99%), czterowodny chlorek żelaza(II) (≥99,99%), chlorek żelaza(III) (≥99,99%), octan etylu (klasa HPLC, ≥99,9%), heksan (klasa HPLC, ≥97,0%), wodorotlenek amonu (≥99,99%) i siarczan sodu (≥99,0%). Szczególnie ważne jest, aby kupować bardzo cz...

Ukierunkowane dostarczanie i przechwytywanie komórek do określonych miejsc w ciele jest pożądane dla różnych zastosowań biomedycznych. Dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu za pomocą zogniskowanych ultradźwięków pod kontrolą rezonansu magnetycznego zostało zaproponowane jako możliwa opcja leczenia chorób neurodegeneracyjnych, urazowego uszkodzenia mózgu i udarumózgu 1. Mezenchymalne komórki macierzyste są badane pod kątem ich zdolności do dostarczania leków przeciwnowotworowych do nowotworów ze względu na ich naturalne właściwości tropikalne2,3. Sercowe komórki macierzyste zostały dostarczone do serca jako możliwe leczenie zawału mięśnia sercowego4,5. Stanty naczyniowe zostały opracowane z przeciwciałami CD34 w celu wychwytywania krążących komórek progenitorowych6. Chociaż są obiecujące, te podejścia do celowania w komórki mają wady, takie jak brak swoistości komórek, niespójna retencja komórek i dostarczanie komórek poza celem.
Ogólnym celem obecnej metody jest umożliwienie magnetycznego kierowania komórek do różnych zastosowań związanych z dostarczaniem i sortowaniem komórek. Celowanie magnetyczne pozwala na kontrolowane dostarczanie określonych komórek do określonego miejsca docelowego przy minimalnych efektach poza celem7. Pola magnetyczne mogą być generowane przez wszczepione lub zewnętrzne urządzenia, aby bezpiecznie kierować ruchem znakowanych magnetycznie komórek w ciele8. Liczne wysiłki badawcze koncentrowały się na magnetycznym kierowaniu komórek macierzystych do uszkodzonych tkanek, takich jak serce9-14, siatkówka15, płuca16, skóra17, rdzeń kręgowy18,19, kość20, wątroba21 i mięśnie22,23 w celu poprawy wyników regeneracji.
Magnetyczne celowanie w komórki było również szeroko badane jako sposób na endotelializację wszczepialnych urządzeń sercowo-naczyniowych. Jednolity i kompletny śródbłonek stanowi barierę między urządzeniem a krążącymi elementami krwi w celu złagodzenia zakrzepicy i stanu zapalnego. Komórki śródbłonka mogą być dostarczane do urządzenia przed implantacją lub przez układ naczyniowy po implantacji. W obu przypadkach pola magnetyczne są wykorzystywane do wychwytywania komórek na powierzchni urządzenia i zatrzymywania komórek pod wpływem naprężeń ścinających generowanych przez krążącą krew. W tym celu wyprodukowano i przetestowano zarówno magnetyczne stenty naczyniowe24-27, jak i przeszczepy naczyniowe28.
Magnetyczne celowanie w komórki wymaga strategii oznaczania komórek cząstkami nośnika magnetycznego. Cząstki te mogą być wiązane z powierzchnią komórek za pomocą przeciwciał lub par ligand/receptor lub mogą być endocytozowane do komórek. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPION) są biodegradowalne, biokompatybilne i łatwo endocytozowane przez różne typykomórek29. Cząstki te skutecznie sprawiają, że komórka reaguje na pola magnetyczne i z czasem ulega naturalnej degradacji. SPION-y zapewniają prosty i bezpieczny sposób magnetycznego znakowania komórek w hodowli do różnych zastosowań związanych z magnetycznym celowaniem i sortowaniem. Podano metodę syntezy SPION-ów z rdzeniem magnetytowym (Fe3O4) i powłoką poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Ponadto przedstawiono metodę znakowania komórek w hodowli za pomocą SPION.

<table><tbody><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu, 28% NH3 w H2O, &ge; 99,99% na bazie metali śladowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>Szkodliwy odczynnik - nosić środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Butelka Dreschel, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu, CHROMASOLVR Plus, do HPLC, 99.9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>Szkodliwy odczynnik - nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Szkodliwy odczynnik - nosić środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Kolba parownika, 50 ml, złącze 24/40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>Do użytku z parownikiem rotacyjnym</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, średnica 3 cm, klasa 1</td><td>Fisher</td><td>09-805P</td><td>Do użytku ze szklanym lejkiem filtrującym</td></tr><tr><td>Szklane zlewki, 1 L</td><td>Fisher</td><td>FB-101-1000</td><td>Do mycia SPIONs</td></tr><tr><td>Szklany lejek filtrujący, adapter węża próżniowego, pasuje do 24/40, 30 mL</td><td>Fisher</td><td>K954100-0344&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szklane nakrętki na fiolki</td><td>Fisher</td><td>03-391-46</td><td>Do stosowania ze szklanymi fiolkami</td></tr><tr><td>Fiolki szklane, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>03-391-44</td><td>Do zbierania żelu magnetytowego i SPIONs</td></tr><tr><td>Hexane, CHROMASOLVR, do HPLC, &ge; 97.0% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>Szkodliwy odczynnik - nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Szkodliwy odczynnik - stosować środki ochrony osobistej i pracować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek żelaza(II), &ge; 99,99% na bazie metali śladowych&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>Szkodliwy odczynnik - nosić środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(III) bezwodny, proszek, &ge; 99,99% na bazie metali śladowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>Szkodliwy odczynnik - stosować środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Grzałka Isomantle, 500 ml</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>Mikser laboratoryjny</td><td>Silverson</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułki</td><td>Fisher</td><td>21-401-25A</td><td>Do przenoszenia magnetytu żelowy</td></tr><tr><td>magnes NdFeB, 1 w x 1 w x 1 w</td><td>Niesamowite magnesy</td><td>C1000H-M</td><td>Bardzo silny magnes, obchodź się z</td></tr><tr><td>nim ostrożnie Kwas oleinowy, &ge; 99% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>Przechowywać w zamrażarce; Szkodliwy odczynnik - stosować środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Mieszadło górne</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk mieszadła górnego</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>Do użytku z mieszadłem górnym</td></tr><tr><td>Mieszadło górne H-stand</td><td>IKA</td><td>1412000</td><td>Do użytku z mieszadłem górnym</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki plastikowe, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG (mieszanka 75/25)</td>Można również stosować <td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502A; Przechowywać w zamrażarce</td></tr><tr><td>proszek Pluronic F-127, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Łopatka z rozszerzanym ostrzem z PTFE, średnica 8 mm</td><td>SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>Adapter naczynia z PTFE, pasuje do wiosła o średnicy 24/40, 8 mm</td> Adapter naczynia <td>Monmouth Scientific</td><td>PTFE A480</td><td>Do użytku z łopatką rozprężną PTFE</td></tr><tr><td>Agregat chłodniczy recyrkulacyjny</td><td>Clarkson</td><td>696613</td><td>Do użytku z parownikiem rotacyjnym</td></tr><tr><td>Skraplacz zwrotny, pasuje do 24/40, 250 mm</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td></td></tr><tr><td>Parownik rotacyjny</td><td>Clarkson</td><td>216949</td><td></td></tr><tr><td>Przegroda gumowa pasuje do 24/40</td><td>Ace Glass</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>Lejek separacyjny z korkiem, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>10-438E</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik ACS z siarczanem sodu, &ge; 99,0%, bezwodny, granulowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna z trzema szyjkami, kątowa, 24/40 złączy, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa perforowana patelnia</td><td>Fisher</td><td>15-335-20A</td><td>Do użytku z myjką ultradźwiękową</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa, 2,8 L</td><td>Fisher</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>Regulator podciśnienia</td><td>Clarkson</td><td>216639</td><td>Do użytku z parownikiem rotacyjnym (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Próżnia pompa</td><td>Clarkson</td><td>219959</td><td>Do użytku z parownikiem rotacyjnym</td></tr></tbody></table>

znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Ukierunkowane dostarczanie komórek i środków terapeutycznych przyniosłoby korzyści szerokiemu zakresowi zastosowań biomedycznych, koncentrując efekt terapeutyczny w miejscu docelowym, jednocześnie minimalizując szkodliwe skutki w miejscach poza celem. Celowanie w komórki magnetyczne jest wydajną, bezpieczną i prostą techniką dostarczania. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPION) są biodegradowalne, biokompatybilne i mogą być endocytozowane do komórek, aby reagowały na pola magnetyczne. Proces syntezy polega na wytworzeniu nanocząstek magnetytu (Fe,3, O, 4), a następnie emulgowaniu z dużą prędkością w celu utworzenia powłoki z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). PLGA-magnetytowe SPION-Ion mają średnicę około 120 nm, w tym rdzeń magnetytowy o średnicy około 10 nm. Po umieszczeniu w pożywce hodowlanej, SPION-y są naturalnie endocytozowane przez komórki i przechowywane jako małe skupiska w endosomachach cytoplazmatycznych. Cząstki te nadają komórkom wystarczającą masę magnetyczną, aby umożliwić celowanie w pola magnetyczne. Liczne aplikacje do sortowania i celowania w komórki są możliwe dzięki renderowaniu różnych typów komórek reagujących na pola magnetyczne. SPION-y mają wiele innych zastosowań biomedycznych, w tym jako środek kontrastowy do obrazowania medycznego, celowane dostarczanie leków lub genów, testy diagnostyczne i generowanie miejscowej hipertermii do terapii nowotworów lub tkanek.

Nanocząstki magnetytu mają średnicę około 10 nm, co jest wynikiem mieszania wodnego roztworu chlorku żelaza(III) i tetrahydratu chlorku żelaza(II) w temperaturze 50 °C przy 1 000 rpm (Rysunek 1). Wyniki te świadczą o pomyślnej syntezie nanocząstek magnetytu. Przy pierwszej próbie przeprowadzenia syntezy ważne jest zweryfikowanie rozmiaru i kształtu nanocząstek magnetytu pobranych z niewielkiej próbki partii. Preferowaną metodą wizualizacji tych cząstek jest transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Jeś...

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych. Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza superparamagnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza oraz wykorzystanie tych cząsteczek do znakowania komórek w zastosowaniach związanych z celowaniem magnetycznym i sortowaniem. Cel ten osiąga się poprzez syntezę nanocząsteczek magnetytu o średnicy 10 nanometrów. Drugim krokiem jest powlekanie nanocząsteczek magnetytu otoczką z kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego (PLGA) o grubości 50 nanometrów.Następnie nanocząstki magnetyczne są płukane i liofilizowane. Ostatnim krokiem jest znakowanie komórek nanocząstkami magnetycznymi do zastosowań w celowaniu i sortowaniu komórek. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, aby wykazać celowanie komórek znakowanych nanocząstkami magnetycznymi w obrębie pól magnetycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak celowanie komórkowe za pomocą przeciwciał, jest wysoka specyficzność i kontrolowalność magnetycznego celowania komórkowego. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię wielu schorzeń medycznych, ponieważ komórki terapeutyczne mogą być dostarczone do miejsca docelowego, przy jednoczesnym oszczędzeniu miejsc poza obszarem celu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ uzyskanie czystych i wysokiej jakości nanocząsteczek wymaga zachowania szczególnej dbałości o szczegóły.Pragnęliśmy usprawnić celowanie i lokalizację żywych komórek w organizmie. Należy rozpocząć od odgazowania 500 ml wody dejonizowanej za pomocą butelki Dressela, delikatnie przepuszczając azot przez 30 minut. Aby przygotować aparat reakcyjny, należy umieścić kolbę trójszyjną o dnie okrągłym o pojemności 500 ml w grzałce płaszczowej ISO.Następnie jedno z gardeł kolby zakryć septem gumowym, a w drugim zamontować chłodnicę zwrotną. Przez chłodnicę należy stale przepływać zimną wodę, aby stworzyć atmosferę obojętną dla reakcji. W pierwszej kolejności przebić septum gumowe kolby igłą podłączoną do linii z azotem.Następnie przebij septę kondensatora igłą połączoną z bulgotaczem, aby umożliwić wizualizację odpływu gazu. Dalej, zamontuj łopatkowe mieszadło w środkowej szyi za pomocą adaptera. Aby zapewnić stałe mieszanie mieszaniny reakcyjnej, podłącz trzpień mieszadła do mieszadła mechanicznego zamontowanego na statywie.Przepłucz kolbę azotem i pozostaw azot płynący do kolby z niską, lecz wykrywalną prędkością. Następnie zdejmij chłodnicę zwrotną i dodaj jeden gram trójchlorku żelaza, 612,5 miligramów tetrachlorku żelaza(II) oraz 50 mililitrów odgazowanej wody. Ponownie zamocuj chłodnicę i mieszaj mieszaninę reakcyjną z prędkością 1000 RPM, podgrzewając do 50 °C.W ten sposób powstaną cząsteczki magnetytu o średnicy 10 nanometrów. Po osiągnięciu przez reakcję temperatury 50 °C, należy za pomocą strzykawki wstrzyknąć 10 ml 28% wodorotlenku amonu przez septę kolby. W miarę wytrącania się magnetytu, roztwór powinien stać się czarny.Zdejmij gumową septę oraz przewód gazowy i podgrzej mieszaninę reakcyjną do 90 °C. Następnie dodaj do kolby 1 ml kwasu oleinowego, aby pokryć nanocząstki i utworzyć żel magnetytu. Następnie ponownie zamocuj septę i przewód gazowy w kolbie, a chłodnicę zdejmij.Wyłączone źródło ciepła i mieszaj mieszaninę reakcyjną przy 500 RPM przez dwie godziny. Po mieszaniu zlej nadmiar cieczy, przytrzymując nanocząsteczki na dnie kolby za pomocą silnego magnesu. Aby rozpocząć oczyszczanie, najpierw rozpuść żel magnetytowy w 40 mililitrach heksanów.Powoli wlej ten roztwór do rozdzielacza zawierającego 40 mililitrów wody Degas i delikatnie obracaj rozdzielaczem przez pięć minut. Po wymieszaniu zlej dolną frakcję wodną, a następnie dwukrotnie przemyj roztwór magnetytu wodą Degas w podobny sposób. Następnie przenieś roztwór magnetytu do kolby Erlenmeyera.Osusz roztwór, dodając kilka szpatułek siarczanu sodu i mieszając zawiesinę przez obracanie naczynia. Następnie przefiltruj mieszaninę pod próżnią, używając papieru filtrującego o wielkości porów 1 µm.Ustaw temperaturę kąpieli wodnej rotacyjnego odparowacza na 50 °C, przy zachowaniu cyrkulacji wody o temperaturze 24 °C w chłodnicy. Następnie przenieś filtrat do kolby odparowującej o pojemności 50 ml i odparowuj heksany przez dwie godziny przy umiarkowanej prędkości obrotowej w warunkach próżni. W szklanych fiolkach podziel żel magnetytowy na sześć aliquotów po 40 mg; powlekanie i płukanie każdego aliquotu zostanie wykonane oddzielnie. Przenieś jeden aliquot żelu wraz z 40 ml PLGA w octanie etylu do plastikowego zlewki i poddaj mieszaninę sonikacji przez 10 minut.Następnie do zlewki należy dodać 80 mililitrów onic F1 27 i natychmiast zemulgować mieszadłem na wysokim ustawieniu przez siedem minut. Powstałe nanocząsteczki to superparamagnetyczne nanocząsteczki tlenku żelaza (SPION). Roztwór należy rozcieńczyć jednym litrem wody dejonizowanej i poddać sonikacji w dygestorium przez godzinę. Następnie należy umieścić silny magnes obok roztworu i delikatnie go wymieszać, aby zebrać SPION na magnesie.Zlej roztwór wodny, pozostawiając szczepki S w zlewce. Przemyj szczepki S trzykrotnie wodą, powtarzając czynność za każdym razem. Po pokryciu i przemyciu wszystkich sześciu alikwotów.Zebrać szczepy S do jednej szklanej fiolki. Liofilizować roztwór spyy przez noc w liofilizatorze w celu przygotowania do znakowania komórek. Najpierw zawiesić pyon w PBS w stężeniu 40 mg/ml i poddać sonikacji przez 30 minut.Następnie dodaj roztwór do kolby z niemal konfluencyjnymi komórkami w stężeniu 5 µL na 1 mL pożywki hodowli komórkowej. Delikatnie kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić roztwór. Inkubuj komórki przez 16 godzin.W temperaturze 37°C. Delikatnie odessać pożywkę hodowlaną, a następnie dwukrotnie przemyć komórki. Po przemyciu PBS, komórki znakowane magnetycznie mogą zostać wykorzystane do dalszych doświadczeń.Nanocząstki magnetytu o średnicy 10 nanometrów można powtarzalnie otrzymywać poprzez mieszanie wodnego roztworu chlorku żelaza(III) i czterowodnego chlorku żelaza(II) w temperaturze 50 °C przy 1000 RPM. Preferowaną metodą określania wielkości cząstek jest transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Powlekanie nanocząstek magnetytu PLGA przy użyciu szybkoobrotowego emulsyfikatora pozwala na powtarzalne otrzymywanie sferycznych struktur PLGA-magnetyt o średnicy 120 nanometrów. Do wizualizacji tych cząstek wykorzystuje się skaningową mikroskopię elektronową (SEM). Inkubacja komórek śródbłonka wywodzących się z krwi z pyonem przez 16 godzin prowadzi do endocytozy nanocząstek, co potwierdzono w TEM. Nanocząstki PLGA-magnetyt można zlokalizować wewnątrz komórek, gdzie są one magazynowane w endosomach cytoplazmatycznych.Poziom obciążenia komórek żelazem jest wystarczająco wysoki, aby umożliwić magnetyczne wychwytywanie żywych komórek przez ferromagnetyczne implantowalne wyroby medyczne. Magnetycznie znakowane komórki śródbłonka są przyciągane do stentu ferromagnetycznego z większą częstotliwością niż do stentu niemagnetycznego. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o dokładnym umyciu całej szklanej aparatury i sprzętu, aby zmaksymalizować czystość i bezpieczeństwo nanocząstek po wykonaniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które terapie medyczne mogą zyskać dzięki specyficznemu i kontrolowanemu dostarczaniu komórek, można zastosować inne metody, np. magnetyczne celowanie komórek. Technologia magnetycznego celowania powinna umożliwić opracowanie ukierunkowanego dostarczania komórek w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat syntezy superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza oraz wykorzystania tych cząstek do znakowania komórek w zastosowaniach związanych z magnetycznym celowaniem.

cell-labeling-targeting-with-superparamagnetic-iron-oxide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Aby ulepszyć serologiczne testy diagnostyczne dla antygenów Mycobacterium tuberculosis, opracowaliśmy superparamagnetyczne nanosondy tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej.

Synteza, charakterystyka i zastosowanie superparamagnetycznych nanosond tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj syntezę superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza do znakowania komórek i celowania magnetycznego. Metoda obejmuje powlekanie PLGA oraz wizualizację fluorescencyjną w zastosowaniach biomedycznych.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Przeglądaj więcej filmów