Name: Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj uproszczony protokół analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym i hybrydyzacji in situ. Ta metoda umożliwia badaczom identyfikację biomarkerów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Rogerowi Ericksonowi za wsparcie i pomoc w przygotowaniu manuskryptu.
Ta praca była wspierana przez National Cancer Institute w National Institutes of Health
(Numer grantu RO1CA177984; RO1CA138642), projekt programu VA dotyczący raka prostaty (BX001604).

Próbki raka prostaty utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) lub świeżo mrożone próbki raka prostaty zostały uzyskane z SFVAMC. Próbki pochodziły od pacjentów z rakiem prostaty, którzy przeszli radykalną prostatektomię w SFVAMC. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów, a badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Badań na Ludziach UCSF. Alternatywnie, mikromacierze tkanek raka prostaty zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych i wykorzystane do analiz miRNA przez ISH. Zebrano informacje kliniczno-patologiczne i kontrolne dla analizowanych pacjentów z rakiem gruczołu krokowego.
1. Próbki tkanek
<ol>
	<li>Pociąć próbki tkanki raka prostaty na odcinki 10 μm za pomocą mikrotomu i wybarwić H & E zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przegląd barwionych szkiełek w celu identyfikacji ognisk raka gruczołu krokowego, a także sąsiedniego normalnego nabłonka gruczołowego. 
	Uwaga: Certyfikowany patolog powinien przejrzeć szkiełka barwione H & E i zaznaczyć guz i normalne obszary. Użyj zaznaczonych szkiełek jako przewodników w kolejnych sekcjach do analiz miRNA z obszarów guza w porównaniu z normalnymi.</li>
</ol>
2. Analizy ekspresji miRNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym
Uwaga: Ten przepływ pracy obejmuje następujące kroki: mikrodysekcja laserowa, izolacja całkowitego RNA (w tym miRNA i mRNA), oznaczanie dojrzałych miRNA przy użyciu testów ekspresji mikroRNA TaqMan, jak opisano w poniższych sekcjach.
<ol>
	<li>Ekstrakcja RNA
	<ol>
		<li>Izolacja miRNA z tkanek FFPE raka prostaty
		<ol>
			<li>Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) 
			Uwaga: Wykonaj kroki 2.1.1.1.1-2.1.1.1.4 w dygestoriach chemicznych.
			<ol>
				<li>Przygotować szkiełka tkankowe (skrawki 10 μm) dla LCM. Deparrafinizować skrawki tkanek poprzez moczenie w ksylenie (2x) przez 10 minut każda, a następnie ponownie nawodnić tkanki, inkubując szkiełka przez 5 minut każda w sortowanym etanolu (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), a następnie w wodzie destylowanej (5 min).</li>
				<li>Po nawodnieniu zabarwić skrawki hematoksyliną przez 30 sekund, a następnie wodą.</li>
				<li>Umieść tkanki w sortowanym etanolu (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min każda) i ksylenie (5 min).</li>
				<li>Wysuszyć szkiełka w dygestorium, a następnie umieścić w przyrządzie LCM do mikrodysekcji.</li>
				<li>Mikrodykcje za pomocą systemu LCM należy wykonać zgodnie z instrukcją producenta24. Użyj szkiełek oznaczonych przez patologa jako wskazówek do identyfikacji ognisk raka prostaty, a także sąsiednich normalnych tkanek. Za pomocą wiązki laserowej o średnicy 10-20 μm emitowane są impulsy o mocy 70-90 mW.</li>
				<li>Uchwyć obszary zainteresowania za pomocą impulsów laserowych w podczerwieni na czapeczkach LCM. Połącz komórki z 2-5 czapek w celu ekstrakcji miRNA na próbkę. Aby zapewnić integralność wyekstrahowanego RNA, natychmiast przechwycone komórki należy przetworzyć w celu ekstrakcji miRNA.</li>
				<li>Alternatywnie należy lizować komórki w buforze do ekstrakcji miRNA (zgodnie z protokołem producenta) i przechowywać lizaty w temperaturze -80 ºC.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Ekstrakcja i analiza miRNA z mikrowypreparowanych tkanek LCM
			<ol>
				<li>Ekstrahuj całkowite RNA z mikrowypreparowanych tkanek FFPE za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. 
				Uwaga: Wydajność RNA z błędnej sekcji wychwytywania laserowego jest zwykle niska. W związku z tym RNA jest eluowane do małych objętości (20-30 μl) i wykorzystywane do profilowania ekspresji za pomocą testów ekspresji mikroRNA Taqman zgodnie z instrukcjami producenta (opisanymi również w sekcji 2.2). Optymalizacja wejściowego RNA do wykrywania dojrzałych miRNA metodą PCR w czasie rzeczywistym sugeruje, że 5 μl eluowanego RNA jest optymalne dla każdej specyficznej dla miRNA reakcji odwrotnej transkrypcji. Jako kontrolę endogenną stosuje się RNU48/RNU24. W przypadku reakcji kontrolnych 2 μl eluowanego RNA stosuje się do reakcji odwrotnej transkrypcji.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Izolacja miRNA z zamrożonych tkanek raka prostaty
		<ol>
			<li>Homogenizuj zamrożone wycięte tkanki prostaty, mieląc tkanki w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Przenieś homogenizowaną tkankę do probówki mikrowirówkowej za pomocą schłodzonej szpatułki. Utrzymuj moździerz/tłuczek i szpatułkę w tej samej temperaturze, zanurzając w ciekłym azocie, aby można było łatwo przenieść homogenizowaną tkankę.</li>
			<li>Dodać dostępny w handlu odczynnik izotiocyjanianian-fenol guanidyny (1 ml/0,1 g tkanki) do homogenizowanej tkanki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
			Uwaga: Homogenizowane tkanki w dostępnym w handlu odczynniku izotiocyjanianu guanidyny-fenolu mogą być przechowywane w temperaturze -80 ºC przez kilka miesięcy.</li>
			<li>Dodać chloroform do homogenatu (0,2 ml chloroformu/ml) i energicznie wstrząsać przez 30 sekund. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Przenieść górną fazę wodną do świeżej, sterylnej, wolnej od RNaz probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Dodaj równą objętość alkoholu izopropylowego. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia RNA.</li>
			<li>Odessać supernatant i przemyć osad RNA 1 ml 70% etanolu. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Ostrożnie zassać supernatant. Suszyć granulki RNA w temperaturze pokojowej przez 5-10 min. Rozpuść RNA w 50-100 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
			<li>Wykonaj kwantyfikację RNA za pomocą spektrofotometru nanokroplowego i określ integralność RNA za pomocą bioanalizatora. Dostosuj stężenie RNA do 10 ng/μl. Użyj 10-50 ng RNA do reakcji cDNA specyficznej dla miRNA, a następnie analiz PCR w czasie rzeczywistym (sekcja 2.2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym do analiz ekspresji miRNA 
	Uwaga: Oznacz dojrzałe miRNA za pomocą dwuetapowego protokołu RT-PCR, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Odwrotna transkrypcja (RT)
		<ol>
			<li>Odwrotna transkrypcja cDNA z RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji miRNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 10-50 ng całkowitego RNA ze starterem specyficznym dla miRNA z zestawu do testów mikroRNA i RT. Użyj RNU48/RNU24/RNU6B jako kontrolek. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:5 do 1:10 (w zależności od obfitości analizowanego miRNA) i użyć w wykrywaniu PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano w następnym kroku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania dojrzałego miRNA
		<ol>
			<li>Amplifikuj produkty PCR z próbek cDNA za pomocą testów MicroRNA z mieszanką główną Fast Universal zgodnie z instrukcjami producenta. Normalizuj próbki do kontroli RNU48/RNU24/RNU6B. Użyj metody porównawczej Ct (cykl progowy), aby obliczyć względne zmiany w ekspresji genów w systemie Fast Real Time PCR. Przeanalizować każdą próbkę w trzech egzemplarzach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analizy ekspresji miRNA metodą hybrydyzacji in situ (ISH)
<ol>
	<li>Wstępne leczenie tkanek
	<ol>
		<li>Wyciąć skrawki 5 μm z bloków tkanki raka prostaty FFPE za pomocą mikrotomu.</li>
		<li>Utrwalić skrawki tkanki, inkubując szkiełka w temperaturze 56 °C przez 1 godz. 
		Uwaga: Preparaty mogą być przechowywane w RT przez kilka tygodni w celu analizy miRNA.</li>
		<li>Deparrafinizację tkanek należy poprzez namoczenie szkiełek z ksylenem (2x) przez 15 minut każda.</li>
		<li>Ponownie nawodnić tkanki, inkubując szkiełka przez 5 minut w klasyfikowanym etanolu (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), a następnie w wodzie destylowanej (5 min).</li>
		<li>Utrwalić szkiełka z 4% paraformaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Myć szkiełka preparatem PBS (2x) w temperaturze pokojowej przez 5 minut każde.</li>
		<li>Traktować szkiełka 10 μg/ml proteinazy K w temperaturze 37 ºC przez 10 minut we wstępnie podgrzanym buforze proteinazy K (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).</li>
		<li>Po poddaniu działaniu Proteinazy-K należy płukać szkiełka 0,2% glicyną w PBS przez 30 sekund.</li>
		<li>Myć szkiełka w PBS (1x) w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Utrwal szkiełka za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut.</li>
		<li>Płukać szkiełka PBS przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>krzyżowanie
	<ol>
		<li>Wstępnie zhybrydyzować szkiełka roztworem do wstępnej hybrydyzacji przez 3-4 godziny w temperaturze 55 ºC w wilgotnej komorze. Używaj chusteczek laboratoryjnych nasączonych 50% formamidem/50% 5x SSC, aby utrzymać wilgotność komory.</li>
		<li>Użyć sond znakowanych digoksygeniną 5' o stężeniu 20-50 nM w buforze hybrydyzacyjnym. Rozcieńczyć sondę specyficzną dla miRNA (20-50 nM) i małą jądrową sondę kontrolną RNA U6 (20 nM), podgrzać w temperaturze 90 ºC przez 4 minuty, umieścić na lodzie i dodać do lodowatego buforu hybrydyzacyjnego (2-4 ng / μl).</li>
		<li>Usunąć roztwór do hybrydyzacji, dodać roztwór do hybrydyzacji (sonda + bufor hybrydyzacyjny, 100 μl na szkiełko), inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze hybrydyzacji specyficznej dla sondy (temperatura hybrydyzacji = sonda Tm-21 ºC). Hybrydyzacje należy wykonywać w wilgotnej komorze (50% formamidu/50% 5x SSC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kroki mycia
	<ol>
		<li>Myć szkiełka 2x SSC przez 10 minut w temperaturze 45 ºC.</li>
		<li>Myć szkiełka 1,5 x SSC przez 10 minut w temperaturze 45 ºC.</li>
		<li>Myć szkiełka 0,2x SSC (2x) w temperaturze 37 ºC przez 20 min każde.</li>
		<li>Inkubuj szkiełka z 1x roztworem blokującym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wykrywanie
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka z rozcieńczonym w stosunku 1:100 PBS przeciwciałem anty-digoksygeninowym sprzężonym z AP przez 1-4 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Myć szkiełka preparatem PBS (3x) w temperaturze pokojowej przez 10 minut każde.</li>
		<li>Umyj szkiełka (2x) buforem fosfatazy alkalicznej (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) w temperaturze pokojowej przez 5 minut każda.</li>
		<li>Inkubuj szkiełka w podłożu BM Purple AP w ciemności w temperaturze RT przez 1-20 godzin.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka PBS zawierającym 0,1% Tween-20 i umyć (2x) w wodzie.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka za pomocą wodnego medium montażowego i zbadaj pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
<li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635(2013).</li>
<li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li>
<li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li>
<li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li>
<li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microRNAs+are+processed+from+capped%2C+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li>
<li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+prostate+cancer%3A+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer+Prostatic+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li>
<li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastamir%3A+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li>
<li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li>
<li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li>
<li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li>
<li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li>
<li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li>
<li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncog%22%5BJournal%5D)">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li>
<li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li>
<li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968(2012).</li>
<li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Novel+Bicyclo%5B2.2.1%5D+Ribonucleosides%3A+2%27-Amino-+and+2%27-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li>
<li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li>
<li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research%3A+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li>
<li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).</li>
<li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji finansowych.

W tym artykule opisujemy uproszczony przepływ pracy do profilowania ekspresji miRNA w zarchiwizowanych FFPE lub świeżo mrożonych tkankach klinicznych raka prostaty. W przypadku raka prostaty kilka badań sugeruje ważną rolę mikroRNA w inicjacji, progresji i przerzutach raka prostaty. Jednak często uzyskuje się sprzeczne wyniki w odniesieniu do konkretnego miRNA22 , ponieważ metody ekstrakcji i analizy miRNA znacznie się różnią. W świetle pojawiających się dowodów potwierdzających potencjalne zastosowanie miRNA ...

Rak gruczołu krokowego jest powszechnie diagnozowanym męskim nowotworem, który jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności związanej z rakiem wśród mężczyzn. Szacuje się, że w 2015 r. w Stanach Zjednoczonych zgłoszono 220 800 nowych przypadków i 27 540 zgonów.
Rak prostaty jest chorobą niejednorodną o bardzo zmiennym przebiegu - nowotwory mogą być powolne lub bardzo agresywne. Krytycznym wyzwaniem w leczeniu klinicznym raka gruczołu krokowego jest nieadekwatność obecnie stosowanych metod/biomarkerów do badań przesiewowych, diagnostyki, rokowania i leczenia2. Obecne metody badań przesiewowych obejmują badanie swoistego antygenu prostaty (PSA) i cyfrowe badanie odbytnicy (DRE), a następnie biopsje prostaty3. Swoisty antygen swoisty dla prostaty (PSA) jest najczęściej stosowanym biomarkerem raka prostaty, który znacząco zrewolucjonizował postępowanie kliniczne i poprawił wskaźniki przeżycia4. Jednak ze względu na nieodłączne ograniczenia PSA, w tym brak swoistości, badania przesiewowe oparte na PSA doprowadziły do nadmiernej diagnozy i nadmiernego leczenia choroby. W związku z tym prowadzone są intensywne wysiłki w kierunku poszukiwania alternatywnych biomarkerów raka gruczołu krokowego, w szczególności tych, które mogą przewidywać agresywność choroby i podejmować lepsze decyzje dotyczące leczenia4,5. W ciągu ostatnich kilku lat mikroRNA (miRNA) stały się obiecującymi alternatywnymi biomarkerami raka prostaty.
MikroRNA (miRNA) stanowią ewolucyjnie zachowaną klasę małych niekodujących RNA, które hamują ekspresję genów po transkrypcji poprzez specyficzne dla sekwencji interakcje z nieulegającymi translacji regionami 3'- (UTR) pokrewnych celów mRNA. Szacuje się, że >60% mRNA to konserwatywne cele miRNA6. Geny miRNA są zlokalizowane w regionach międzygenowych lub w intronach lub eksonach genów kodujących białka/białka7. Geny te są preferencyjnie transkrybowane przez polimerazę RNA II do pierwotnych miRNA (pri-miRNA o długości kilku kilozasad), które tworzą drugorzędowe struktury pętli macierzystej w kształcie spinki do włosów. Te pri-miRNA są przetwarzane na prekursorowe miRNA (pre-miRNA, o długości 60-75 nukleotydów), które są eksportowane do cytoplazmy i dalej przetwarzane na dojrzałe miRNA (o długości 18-25 nukleotydów)8-10. miRNA regulują kluczowe procesy komórkowe, w tym proliferację, rozwój, różnicowanie i apoptozę11. Badania sugerują powszechne rozregulowanie profili ekspresji miRNA w różnych nowotworach złośliwych u ludzi, w tym w raku prostaty12-15. Doniesiono, że profile ekspresji miRNA są szeroko rozregulowane w pierwotnym i przerzutowym raku gruczołu krokowego. Zmieniona ekspresja miRNA została powiązana z progresją, agresywnością i nawrotami raka prostaty, co podkreśla potencjał prognostyczny miRNA12,14,16-19. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że miRNA odgrywają ważną rolę mechanistyczną w inicjacji, rozwoju, progresji i przerzutach raka prostaty. Ogólnie rzecz biorąc, miRNA stają się obiecującymi alternatywnymi biomarkerami do diagnozowania i rokowania raka prostaty, które mogą odróżnić tkanki normalne od nowotworowych i pomóc w stratyfikacji guzów prostaty12. Ponadto miRNA są ważnymi celami dla rozwoju skutecznych terapii przeciwko rakowi prostaty20.
Ze względu na ich mały rozmiar i odporność na endogenną aktywność RNazy, miRNA są stabilnymi biomarkerami, które można łatwo wykryć w tkankach utrwalonych formaliną21 i w biopsjach prostaty22. Co więcej, profile ekspresji miRNA porównano w tkankach mrożonych i utrwalonych w formalinie i stwierdzono, że są one silnie skorelowane21. Jednak profilowanie ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka prostaty jest często trudne ze względu na niejednorodność guza, błędy w pobieraniu próbek, zanieczyszczenie zrębu itp. Opracowanie miRNA jako skutecznych biomarkerów raka prostaty w dużej mierze zależy od ich dokładnego wykrywania w tkankach klinicznych. W tym miejscu opisujemy uproszczony przepływ pracy stosowany w naszym laboratorium do profilowania ekspresji miRNA w zarchiwizowanych FFPE lub świeżo mrożonych próbkach klinicznych raka prostaty. Stosujemy kombinację ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i hybrydyzacji in situ do analiz miRNA próbek klinicznych, przy czym pierwsza z nich dostarcza więcej informacji ilościowych, a druga do wizualizacji zróżnicowanej ekspresji potencjalnych biomarkerów miRNA w szeregu tkanek. W ramach tego przepływu pracy optymalizujemy istniejące metodologie ekstrakcji miRNA z FFPE i zamrożonych tkanek prostaty, analizy ekspresji za pomocą miRNA RT-PCR opartej na sondzie Taqmana oraz technikę hybrydyzacji miRNA in situ przy użyciu sond opartych na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA)23. Sondy oparte na LNA oferują zwiększoną czułość i swoistość w porównaniu z sondami opartymi na DNA lub RNA i umożliwiają niezawodne wykrywanie wszystkich sekwencji miRNA, niezależnie od ich zawartości GC, a także umożliwiają dyskryminację rodzin miRNA. Nasz zoptymalizowany protokół miRNA ISH może być stosowany do preparatów tkankowych raka prostaty lub mikromacierzy tkankowych raka prostaty (TMA), przy czym te ostatnie oferują potencjał przyspieszenia odkrywania biomarkerów miRNA.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix dla LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatywnie można zastosować system Arcutus Xt firmy Life Technolgies.&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miRNeasy FFPE&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA Taqman&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Sonda LNA z oznaczeniem DIG do podłoża U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP</td><td></td> Roche <td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wstępnej hybrydyzacji&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie hybrydyzacyjne&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie blokujące&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-sprzężone przeciwciało anty-digoksygeninowe</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Wodne podłoże montażowe&nbsp;</td><td>Laboratoria Wektorowe&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (odczynnik izotiocyjanianu guanidyny-fenolu)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoksylina</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

analizy ekspresji mirna w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Krytycznym wyzwaniem w klinicznym leczeniu raka prostaty (PCa) jest nieadekwatność obecnie stosowanych biomarkerów do badań przesiewowych, diagnozy, rokowania i leczenia. W ostatnich latach mikroRNA (miRNA) stały się obiecującymi alternatywnymi biomarkerami w diagnostyce i rokowaniu raka prostaty. Jednak rozwój miRNA jako skutecznych biomarkerów raka prostaty w dużej mierze zależy od ich dokładnego wykrywania w tkankach klinicznych. Analizy miRNA w próbkach klinicznych raka prostaty są często trudne ze względu na niejednorodność guza, błędy w pobieraniu próbek, zanieczyszczenie zrębu itp. Celem tego artykułu jest opisanie uproszczonego przepływu pracy dla analiz miRNA w archiwalnych FFPE lub świeżo mrożonych próbkach klinicznych raka prostaty przy użyciu kombinacji ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) i in situ hybrydyzacja (ISH). W ramach tego przepływu pracy optymalizujemy istniejące metodologie ekstrakcji miRNA z FFPE i zamrożonych tkanek prostaty oraz analizy ekspresji za pomocą miRNA RT-PCR opartego na sondzie Taqmana. Ponadto opisujemy zoptymalizowaną metodę analizy ISH wykrywania formiRNA w tkankach prostaty przy użyciu sond opartych na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA). Nasz zoptymalizowany protokół miRNA ISH może być stosowany do preparatów tkankowych raka prostaty lub mikromacierzy tkankowych raka prostaty (TMA).

Profilowanie ekspresji miR-203 w klinicznych próbkach pierwotnego raka prostaty pobranych metodą LCM za pomocą analiz RT-PCR (Rycina 1)
Analizy RT-PCR względnej ekspresji miR-203 w tkankach pierwotnego raka prostaty pobranych metodą LCM oraz w odpowiadających im sąsiednich obszarach prawidłowych przeprowadzono zgodnie z opisem w pracy Saini et al.15 W charakterze kontroli zastosowano RNU48. Poniższa tabela przedstawia podsumowanie względnej ekspresji miR-20...

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Ogólnym celem tego filmu jest opis uproszczonego schematu analizy mikroRNA w zarchiwizowanych próbkach klinicznych raka prostaty z wykorzystaniem kombinacji ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym oraz hybrydyzacji in situ (ISH) z zastosowaniem sond opartych na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA). Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępną izolację tkanki z sekcji FFPE raka prostaty za pomocą mikrodysekcji laserowej, a następnie ekstrakcję mikroRNA. Następnie wykorzystuje się dwuetapową reakcję RT-PCR do ilościowego oznaczenia mikroRNA w tkance; lokalizacja mikroRNA w analizie hybrydyzacji in situ jest przeprowadzana przy użyciu sond LNA znakowanych digoksygeniną oraz przeciwciała przeciwko digoksygeninie sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (AP), wykrywanego za pomocą BM Purple.Przedstawione wyniki ukazują ekspresję mikro-RNA w tkankach klinicznych raka prostaty. Dzięki zastosowaniu tych technik mikro-RNA stały się ostatnio obiecującymi alternatywnymi biomarkerami choroby w przypadku raka prostaty. Jednak analiza ekspresji mikro-RNA w klinicznych próbkach raka prostaty jest często utrudniona ze względu na czynniki zakłócające, takie jak heterogenność guzów prostaty oraz za

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Ten zmodyfikowany protokół ekstrakcji poprawia wydajność RNA i DNA z bardziej precyzyjnie wybranych obszarów zainteresowania w histopatologicznych blokach tkankowych.

Przygotowanie utrwalonych w formalinie rdzeni tkankowych zatopionych w parafinie do ekstrakcji RNA i DNA

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Niniejszy manuskrypt opisuje optymalizację panelu biomarkerów przy użyciu multipleksowego testu kulek magnetycznych do klasyfikacji raka piersi.

Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj uproszczony protokół analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym i hybrydyzacji in situ. Ta metoda umożliwia badaczom identyfikację biomarkerów nowotworowych.

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Przeglądaj więcej filmów