Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie modelu uszkodzenia ucha wewnętrznego poprzez strategiczne podanie czynników ototoksycznych bezpośrednio do niszy okna owalnego ślimaka myszy. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie podskórnej warstwy tłuszczowej i delikatne odsuniecie masy mięśniowej w celu odsłonięcia okostnej bąbelka słuchowego. Drugim krokiem jest otwarcie bąbelka poprzez stopniowe usuwanie fragmentów kości aż do odsłonięcia niszy okna owalnego.

Następnie widoczną ciecz z ucha środkowego i niszy okna owalnego osusza się całkowicie, co pozwala na optymalną wizualizację niszy okna owalnego. Ostatnim krokiem jest wypełnienie niszy okna owalnego wybranym czynnikiem ototoksycznym, nie naruszając przy tym tętnicy STA, a następnie przeprowadzenie odpowiedniej liczby powtórzeń zgodnie ze specyfikacją danego czynnika. W końcowej fazie stosuje się procedury funkcjonalne, w tym badanie słuchanego potencjału wywołanego pnia mózgu oraz ocenę morfologiczną, aby wykazać selektywną preserwację lub degenerację mikroarchitektury ślimaka.

Główną zaletą tej techniki, będącej naszą obecną metodą pomiarową, jest to, że procedura ta umożliwia doskonałą ekspozycję niszy okna okrągłego, co pozwala na bezpośrednie zastosowanie selektywnego starzenia autotoksycznego. Do zalet tej techniki należą: zachowanie mikroarchitektury ucha wewnętrznego, uniknięcie toksyczności ogólnoustrojowej, szybkie wystąpienie efektu, selektywna degeneracja określonych typów komórek ślimaka oraz powtarzalne wyniki. Technikę tę można zastosować z niewielkimi modyfikacjami u innych gatunków gryzoni, w tym u szczurów, świnkach morskich i gerbołach.

Teraz zademonstruję tę procedurę w moim laboratorium. Wszystkie aspekty badań na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt. Wszystkie opisane tutaj eksperymentalne procedury na kręgach zostały zatwierdzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Karolinie Południowej.

Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, podaj przedoperacyjny lek przeciwbólowy w dawce 0,1 mg/kg. W tym przypadku stosuje się buprenorfinę. Upewnij się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną głębokość znieczulenia.

Nie powinno wystąpić reakcji na uciśnięcie palca u stopy, a odruch pisania u myszy powinien być nieobecny, co widać tutaj. Pobierz 0,2 ml roztworu wodnego zawierającego wybrany środek ototoksyczny do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml z zaokrągloną igłą o rozmiarze 28G i długości pół cala; usuń wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki, ponieważ mogą one uniemożliwić prawidłową aplikację środka. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć futro w obszarze rozciągającym się od fałdy podszyjnej aż po obręcz barkową.

Rozszerzyć obszar usuwania owłosienia od pośrodkowej linii strzałkowej grzbietu bocznie aż do kąta żuchwy. Użyć jednorazowej brzytwy, aby zapewnić dokładne ogolenie preparatu. Zdezynfekować skórę w przygotowanym obszarze zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.

W tym kroku Betadine na przemian z etanolem nanosi się miejscowo, wykonując okrężne ruchy przez dwie minuty. Pod ciało zwierzęcia należy umieścić małą podkładkę grzewczą, aby utrzymać jego temperaturę ciała. Przy temperaturze od 36 do 38 °C należy unieruchomić głowę zwierzęcia za pomocą uchwytu do głowy.

Delikatnie zaciśnij mały zacisk na grzbiecie pyska zwierzęcia, aby unieruchomić je w pozycji. Upewnij się, że uchwyt głowy jest sztywno połączony z centrum przegubowego ramienia w kształcie litery U. Przymocuj pręt o szerokości 1 cm do lewego ramienia litery U, aby służył jako lewy podgłownik, umożliwiając dostęp do prawej strony.

Po stabilnym zamocowaniu w uchwycie do głowy, obróć mysz do pozycji bocznej lewej. Ostrożnie ułóż ciało zwierzęcia na płaskiej powierzchni operacyjnej, aby zapewnić jego stabilność przez cały czas trwania procedury i uniknąć nadmiernego naprężenia skrętnego kręgów szyjnych. Nad polem operacyjnym ustaw mikroskop operacyjny z możliwością 10-krotnego i 20-krotnego powiększenia.

Należy upewnić się, że mikroskop utrzymuje swoją pozycję bez konieczności ręcznego wspomagania, tak aby podczas pracy pod powiększeniem mikroskopowym obie ręce mogły być wykorzystywane do przeprowadzenia operacji. Za pomocą ostrych nożyczek lub ostrza skalpela należy wykonać nacięcie zauszne o długości od 1 do 1,5 cm, w odległości około 6 do 8 mm od fałdy cephalicznej małżowiny usznej. Należy unikać zbyt głębokiego cięcia, aby nie uszkodzić leżących głębiej struktur naczyniowych.

Wykonaj rozcięcie tępym sposobem przez warstwę tkanki tłuszczowej podskórnej. Podczas preparowania w kierunku od brzusznej do przyśrodkowej należy uważać, aby nie uszkodzić żyły szyjnej zewnętrznej. W przypadku wystąpienia krwawienia należy zastosować wchłanialną żelatynę, gąbki lub kulki bawełniane w celu zahamowania przepływu krwi.

Po prawidłowym rozdzieleniu warstwy tłuszczowej odsłania się mięśnie szyjne. Ważnym punktem orientacyjnym jest mała gałąź nerwu czaszkowego XI, która owija się wokół tylnej krawędzi wyrostka sutkowatego. Aby rozszerzyć pole widzenia w kierunku małżowiny usznej, należy użyć retraktora samopodtrzymującego, aby delikatnie odsunąć brzusiec mięśnia wyrostka sutkowatego w kierunku tylnym.

Ostrożnie rozdziel przezroczystą powięź otaczającą brzusiec mięśnia. Delikatnie odsunąć również gruczoł ślinowy przyuszny oraz żyłę szyjną zewnętrzną w przeciwnym kierunku. Przy odpowiednim odsunięciu brzuszca mięśnia CTO Masto, w bocznej części bąbla słuchowego widoczna jest lśniąca kopuła okostnej bąbla słuchowego, miejsce przyczepu głębszego mięśnia szyjnego.

W polu widzenia pojawi się obszar łodygi sutkowatej. Należy założyć rozieracz samo utrzymujący, aby rozsunąć strukturę sutkowatej, stosując technikę dwuręczną, a następnie delikatnie użyć koagulacji bipolarnej w celu nacięcia okostnej torbieli i odsłonięcia leżącej pod nią kości. Następnie za pomocą pęsety lub kurety otologicznej należy delikatnie unieść i odsunąć okostną w kierunku obwodowym, aby w pełni odsłonić kopułę torbieli.

Następnie należy użyć stomatologicznego wiertła napędzanego paskiem z jednomiligramowym lub dwumiligramowym zwężonym końcem, aby ostrożnie wywiercić otwór prowadzący o średnicy 2 mm w kości bąbla. Wiercić należy pomiędzy krawędzią grzbietową kopuły a widoczną nieprzezroczystą linią przebiegającą przez przednią część bąbla. Następnie, w pobliżu, należy ostrożnie wywiercić drugi otwór prowadzący. Aby ułatwić otwarcie kości bąbla, należy ją usunąć w kierunku grzbietowym i boczny, używając pęsety jubilerskiej.

Należy uważać, aby nie przebić tętnicy EDL, która znajduje się bezpośrednio pod wypustką kostną (bullock cap). Należy zminimalizować ilość usuniętej kości, aby zapobiec nadmiernemu przedostaniu się płynu do ucha środkowego przed zastosowaniem preparatu. Do usunięcia całego widocznego płynu z ucha środkowego oraz niszy okna owalnego należy użyć knotka papierowego, aż do momentu, gdy widoczna będzie sucha kość.

Ten krok jest kluczowy dla powodzenia protokołu. Obserwując obszar przy maksymalnym powiększeniu, należy użyć igły o małym kalibrze w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml, aby nanieść jedną kroplę czynnika ototoksycznego bezpośrednio do niszy okna owalnego, wypełniając ją całkowicie. Pozostawić czynnik w niszy okna owalnego na 10 minut.

W początkowych etapach należy uważnie obserwować, czy niewielkie odbicie światła u podstawy suchej niszy zostaje zastąpione matowym i zamglonym meniskiem cieczy. Wskazuje to na prawidłowe wypełnianie się niszy. Po upływie pełnych 10 minut należy całkowicie usunąć odczynnik i nanieść nową porcję tego samego preparatu.

Liczba aplikacji zależy od użytego środka. Czas ekspozycji wynosi zazwyczaj od 30 do 60 minut. Po ostatniej aplikacji pozostawić bullę niezakrytą i za pomocą pęsety zamknąć tkankę miękką nad miejscem operacyjnym.

Do zamknięcia skóry nad miejscem operacyjnym należy użyć niewchłanialnej nici monofilamentowej 4-0. Zwierzę powinno dojść do siebie po znieczuleniu w czystej klatce domowej, wyposażonej w ściółkę i miękką karmę. Zwierzęta należy monitorować codziennie aż do momentu uśmiercenia i pobrania tkanki ślimaka u dorosłych osobników C-B-A-C-A-J.

Myszy obu płci poddano działaniu ototoksycznegotgo czynnika Hept ethanol. Dyfuzja odbywała się przez okno okrągłe. U myszy traktowanych preparatem hept zaobserwowano istotne wzrosty progów BR od pierwszego do 14. dnia po operacji w porównaniu do zwierząt kontrolnych, u których przeprowadzono operację pozorowaną z podaniem soli fizjologicznej zamiast hept.

Etanol nie wykazał istotnych przesunięć progu słyszenia przy żadnej z badanych częstotliwości. Barwienie immunohistochemiczne przeciwko wewnątrzsterownym kanałom potasowym, zaznaczone kolorem zielonym, posłużyło jako pośrednia metoda wizualizacji uszkodzeń i regeneracji struktur ślimaka. Intensywność barwienia była wyraźnie zmniejszona w obrębie theria vais.

W pierwszym dniu po operacji, w przeciwbarwieniu jąder komórkowych (zaznaczonym na czerwono), zaobserwowano również oznaki zaburzenia integralności jądra i kondensacji chromosomów, typowe dla apoptozy komórkowej. Po ilościowym określeniu intensywności barwienia kanałów potasowych w obszarach uszu leczonych stratisem, wykazano początkowy spadek, po którym nastąpiło znaczne przesunięcie z powrotem w stronę intensywności grupy kontrolnej siedem dni po ekspozycji na hept, a regeneracja trwała nadal. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 30 do 60 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.

Ważne jest, aby pamiętać, że dodatkowa ekspozycja lub uzupełnianie mogą pomóc uniknąć niepożądanego rozcieńczenia czynnika autotoksycznego przez kondensację krwi lub płyn śródmiąższowy. Należy jednak zachować ostrożność przy stosowaniu tej metody, ponieważ zwiększa ona ryzyko przypadkowego uszkodzenia tętnicy ślimakowej lub wprowadzenia płynu śródmiąższowego do niszy okna owalnego. Ta małoinwazyjna technika umożliwia szczegółowe badanie delikatnych procesów biochemicznych i odegrała kluczową rolę w rozwoju naszych badań mających na celu zrozumienie potencjału regeneracyjnego ślimaka in vivo.