Name: Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii FRET do pomiaru kinetyki wiązania TCR-pMHC in situ w synapsie immunologicznej. Technika ta umożliwia ilościową analizę powinowactwa i stałych kinetycznych na poziomie pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.A. był wspierany przez stypendium Schrödingera Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF, J3086-B11) i dziękuje Towarzystwu Maxa Plancka za wsparcie finansowe i administracyjne. G.S. i J.H. byli wspierani przez Wiedeński Fundusz Nauki i Technologii (WWTF, LS13-030).

<ol><li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol.%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology.%22%5BJournal%5D)">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li>
<li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vizualized+Experiments+J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li>
<li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li>
<li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li>
<li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li>
<li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+repeat+proteins%3A+well-expressed%2C+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Pomiar interakcji białko-białko in situ jest wysoce pożądany, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z interakcjami o niskim powinowactwie, takimi jak wiązanie TCR-pMHC 11. Dzieje się tak dlatego, że na szybkość i stabilność takich interakcji znaczący wpływ mają szczególne okoliczności, w których odbywa się wiązanie. Minimalnie inwazyjne metody obrazowania oparte na FRET są zatem w zasadzie doskonale przystosowane do takich zadań, ale wiążą się z szeregiem przeszkód, które należy najpierw pokonać. Szum generowany przez autofluorescencję komórkową ogranicza czułość pomiarów i dlatego powinien być utrzymywany na minimalnym poziomie. Mikroskopia TIRF bardzo dobrze zaspokaja tę potrzebę 12 , ale wymaga funkcjonalizacji szkiełek, najlepiej w postaci płaskiej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym, ozdobionej białkami z wyboru 13-15. Kolejną zaletą podejścia częściowo rekonstytutywnego jest to, że rekombinowani partnerzy FRET rezydujący w dwóch warstwach mogą być znacznie łatwiej znakowani w ilościowy, specyficzny dla miejsca i racjonalny sposób za pomocą mniejszych i jaśniejszych fluoroforów niż byłoby to możliwe w przypadku białek ulegających ekspresji na powierzchni komórki. TCR są znakowane rekombinowanymi scFVs, które nie wpływają na rozpoznawanie limfocytów T, jak to było testowane wcześniej 2. Co więcej, skład białkowy SLB, na przykład gęstość pMHC i wybór czynników dodatkowych, można dostosować do konkretnych potrzeb. Wcześniej przeprowadziliśmy eksperymenty z różnymi gęstościami stymulujących pMHC, ale nie wykryliśmy istotnych różnic w 2D-koff i 2D-KD2.
Do tej pory rozpoznawanie cząsteczek MHC klasy II zajmowało się tylko tym, głównie ze względu na charakter ich szczeliny wiążącej peptydy, która jest otwarta na obu końcach, a zatem mieści większe peptydy, w tym łącznik do przyłączania fluoroforu. W niektórych przypadkach takie podejście może również sprawdzić się w przypadku znakowania cząsteczek MHC klasy I 16 , ale należy zachować dużą ostrożność w celu sprawdzenia ich zastosowania w eksperymentach. Dodanie łącznika i fluoroforu do peptydu nie powinno mieć wpływu na wrażliwość limfocytów T na antygeny, które można zmierzyć za pomocą testów proliferacji komórek T, jak również kinetykę wiązania pMHC-TCR mierzoną in vitro za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Alternatywnie, same cząsteczki MHC klasy I mogą być znakowane w sposób specyficzny dla miejsca z wprowadzeniem niesparowanej cysteiny w sekwencji łańcucha ciężkiego (niepublikowane obserwacje).
Za pomocą odpowiednich sond molekularnych każde oddziaływanie białko-białko synaptyczne może być w zasadzie badane w sposób opisany w niniejszym dokumencie. Takie sondy, np. scFVs lub Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins)17, powinny być monowalentne i powinny stabilnie wiązać swój cel bez wpływu na interakcję będącą przedmiotem zainteresowania. Oczywiście, informacje strukturalne są wysoce pożądane dla racjonalnego projektowania sondy, ale nie są absolutnie wymagane. Podczas ustanawiania nowej pary partnerów FRET zaleca się, aby najpierw zbiorczo rejestrować i analizować FRET. Miejsca mocowania etykiet mogą się znacznie różnić, aby zmaksymalizować sygnał FRET, a także sprawdzić, czy zmierzona wydajność FRET różni się w zależności od odległości między barwnikami. Po zoptymalizowaniu systemu sygnały FRET z pojedynczą cząsteczką mogą być rejestrowane poprzez ograniczenie znakowania partnera FRET o wysokiej obfitości do 10-30% i wybielanie partnera FRET o niskiej obfitości, aż pojedyncze cząsteczki będą rozdzielalne w dziedzinie oświetlenia.
Na koniec należy zauważyć, że SLB przybliżają niektóre, ale nie wszystkie aspekty fizjologicznej błony plazmatycznej. Cechy takie jak krzywizna i elastyczność błony, podział domeny, przegrupowania cytoszkieletu i ruchliwość komórek, a także duża różnorodność białek błonowych o ekspresji powierzchniowej nie są reprezentowane przez SLB, ale mogą wpływać na badany proces. Konieczne będzie podjęcie wielu wysiłków w celu ustanowienia metod obrazowania, które umożliwią monitorowanie interakcji białko-białko z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki w synapsach fizjologicznych, które są niedostępne dla obrazowania TIRF.

Głębsze zrozumienie mechanizmów rozpoznawania antygenów przez limfocyty T wymaga analizy odpowiedniego obszaru, a mianowicie synapsy immunologicznej tworzącej się między limfocytem T a APC. W tym miejscu kinetyka wiązania molekularnego nie jest określana wyłącznie przez immanentne właściwości biochemiczne zaangażowanych partnerów oddziaływania, lecz w dużym stopniu zależy od parametrów komórkowych, do których należą siły komórkowe, architektura błony i oddziaływania lateralne między białkami błonowymi, a także specyficzne dla synapsy ograniczenia geometryczne 3. Podejścia biochemiczne mają ograniczoną rozdzielczość, ponieważ wymagają one naruszenia co najmniej jednej z zaangażowanych błon synaptycznych. Z tego powodu opracowano metodologię obrazowania opartą na FRET, aby monitorować wiązanie TCR z antygenowymi pMHC 2. W tej metodzie limfocyty T są znakowane rekombinowanym i specyficznie w danym miejscu znakowanym fragmentem przeciwciała jednowątkowego (scFV) reaktywnego z TCRβ i konfrontowane z płaskimi, wspartymi na szkle dwuwarstwami lipidowymi (SLB), które zawierają cząsteczki MHC klasy II obciążone fluorescencyjnie znakowanym peptydem antygenowym, cząsteczki kostymulujące oraz białka adhezyjne. Wiązanie synaptyczne między znakowanym barwnikiem TCR a znakowanym barwnikiem pMHC skutkuje wystąpieniem FRET, co można monitorować w skali zbiorczej oraz pojedynczych cząsteczek za pomocą mikroskopii TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence).
W niniejszym artykule szczegółowo wyjaśniono, jak wykorzystać SLB do badania synaps limfocytów T, weryfikować ich integralność za pomocą funkcjonalnego testu napływu jonów wapnia w limfocytach T, przeprowadzać pomiary FRET w skali masowej oraz z czułością na poziomie pojedynczych cząsteczek, a także analizować pozyskane dane. Przedstawiono zalecenia dotyczące otrzymywania białek o prawidłowej konformacji, niezbędnych do funkcjonalizacji dwuwarstwy. Po bardziej szczegółowe informacje dotyczące formowania dwuwarstwy oraz konfiguracji odpowiedniego mikroskopu TIRF należy odnieść się do dodatkowej publikacji JoVE z otwartym dostępem, wydanej równolegle 4.
Charakterystyka SLB
Funkcjonalizowalne SLB można łatwo wytworzyć z pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs) zawierających dwa lipidy: 1-palmitoylo-2-oleoylo-sn-glicero-3-fosfocholinę (skrót: POPC, 90-99%) oraz 1,2-dioleoylo-sn-glicero-3-{[N(5-amino-1-karboksypentylo) iminodiacetowy kwas] succynylowy} (skrót: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs rozprzestrzeniają się na czystych szkiełkach przedmiotowych, tworząc ciągłą płaską dwuwarstwę 4. DGS-NTA-Ni służy do kotwiczenia białek z tagiem polihistydynowym poprzez tworzenie kompleksów z syntetyczną grupą głowową zawierającą NTA-Ni (Rycina 1A). W celu uzyskania stabilnego powiązania zazwyczaj zastępuje się natywną domenę transbłonową i ogon cytoplazmatyczny białka adhezyjnego ICAM-1 oraz cząsteczki kostymulującej B7-1 tagiem zawierającym dwanaście histydyn (ICAM-1-12H, B7-1-12H) (Rycina 1B). Załadowana peptydem cząsteczka klasy II I-Ek składa się z dwóch osadzonych w błonie (α i β) łańcuchów polipeptydowych. Domeny transbłonowe/cytoplazmatyczne obu łańcuchów muszą zostać zastąpione tagiem zawierającym po sześć histydyn (I-Ekα6H β6H lub I-Ek-2x6H). Alternatywnie, przedłużenie łańcucha α dwunastoma histydynami i pozostawienie domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha β bez tagu (co daje I-Ekα12H β0H lub I-Ek-12H) przynosi satysfakcjonujące wyniki (Rycina 1B).
Specyficzne dla miejsca znakowanie pMHC
Ważne jest, aby pMHC znakować stechiometrycznie i specyficznie w odniesieniu do miejsca wiązania, aby móc przeliczyć zmierzone wydajności FRET na istotne stałe wiązania równowagowego. Można to osiągnąć poprzez chemiczne znakowanie syntetycznego peptydu, który jest wprowadzany do szczeliny wiążącej peptyd rekombinowanych cząsteczek MHC klasy II z oznakowaniem histydynowym 2,5. Peptyd zawiera wszystkie reszty epitopu limfocytów T oraz krótki linker C-terminalny (GGS), po którym następuje cysteina (np. w peptydzie cytochromu c ćmy (MCC) ANERADLIAYLKQATK-GGSC linker zaznaczono pogrubieniem). Cysteina ta służy do stechiometrycznego znakowania peptydu przy użyciu pochodnych maleimidu z barwnikiem. Na tym etapie szczególną uwagę należy poświęcić weryfikacji ilościowego sprzężenia barwnika z peptydem zawierającym cysteinę. Zaleca się oczyszczanie adduktu peptyd-barwnik metodą HPLC, po której powinno nastąpić badanie spektrometrią mas z jonizacją elektrospray. Wszelkie zarejestrowane masy odpowiadające substratowi peptydowemu (bez barwnika) świadczą o niepełnym znakowaniu. W takim przypadku oczyszczony metodą HPLC peptyd należy poddać kolejnym rundom znakowania barwnikiem, aż do momentu, gdy znakowanie zostanie uznane za ilościowe. Należy pamiętać, że należy unikać spektrometrii mas MALDI-TOF, ponieważ metoda ta wykorzystuje promieniowanie laserowe do jonizacji próbki. Zabieg ten rozkłada przyłączone wrażliwe fluorofory przed odczytem masy peptydu, co prowadzi do niedoszacowania stopnia koniugacji z barwnikiem.
Pośrednie, lecz specyficzne dla miejsca znakowanie receptorów TCR związanych z komórkami przy użyciu monowalentnych fragmentów jednoprzestronowych FV
Specyficzne miejscowo przyłączanie barwników do białek związanych z powierzchnią żywych komórek wciąż stanowi wyzwanie. Aby pokonać tę trudność w przypadku eksponowanych na powierzchni TCR, skonstruowano monowalentną wersję jednopodziałową (scFV) na podstawie genów przeciwciała monoklonalnego H57-197 reaktywnego wobec TCRβ 2. Struktura krystaliczna tego przeciwciała w kompleksie z TCR pozwala na racjonalne zaprojektowanie wersji, w której reszta seryny w bliskim sąsiedztwie C-końca peptydu związanego z MHC (gdzie przyłączony jest odpowiadający mu barwnik partner FRET) zostaje zastąpiona resztą cysteiny. Ta zmutowana cysteina służy następnie jako akceptor do koniugacji z barwnikiem (Rysunek 2).
Metody rejestracji FRET
Wartości FRET w pomiarach zbiorczych najlepiej nadają się do weryfikacji zależności między wybranymi odległościami między barwnikami a wydajnością FRET zmierzoną w tym układzie wiązania TCR-pMHC 2. Ponadto pomiary FRET w skali zbiorczej ujawniają jakościowe i ilościowe różnice w powinowactwach TCR-pMHC w obrębie synapsy (patrz poniżej oraz sekcja 3.2 protokołu). W literaturze opisano różne podejścia do kwantyfikacji wydajności FRET 6. W niniejszym artykule FRET jest rejestrowany za pomocą
(a) powrót fluorescencji donora po wybieleniu akceptora, oraz poprzez
(b) uwrażliwiona emisja akceptora FRET.
Pierwsza metoda (a) wymaga użycia akceptora FRET, który ulega łatwemu fotobleachingowi, oraz donora, który jest stosunkowo fotostabilny. Dodatkowo ważne jest zapewnienie, aby fotowybealony akceptor nie był już zdolny do wygaszania fluorescencji donora. Ponieważ do kwantyfikacji wykorzystuje się ten sam kanał detekcji (donora), nie trzeba brać pod uwagę czynników korekcyjnych ani aberracji chromatycznych, co czyni tę metodologię prostą i niezawodną. Jednakże pomiary ilościowe nie mogą być powtarzane w tym samym punkcie preparatu, a zmiany FRET nie mogą być rejestrowane w czasie. Aby uniknąć efektów spowodowanych dyfuzją molekularną lub ruchliwością komórkową, należy dążyć do szybkiego etapu bleachingu, co zminimalizuje czas upływający między akwizycją pierwszego obrazu donora FRET (przed bleachingiem akceptora) a drugiego obrazu donora FRET (po bleachingu akceptora FRET). Zaleca się zastosowanie mocnego źródła światła laserowego o długości fali wzbudzenia akceptora FRET, aby zminimalizować czas naświetlania i bleachingu.
W przeciwieństwie do tego, w podejściu polegającym na pomiarze emisji uwrażliwionej FRET (b), wzbudzany jest donor FRET, a emisja akceptora FRET jest obserwowana w kanale akceptora FRET. Zmiany sygnału akceptora FRET mogą być rejestrowane w czasie, jednak emisja donora FRET do przesuniętego w stronę czerwieni kanału akceptora (tzw. bleedthrough) oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET poprzez wzbudzenie donora muszą zostać dokładnie określone i odjęte od zarejestrowanego sygnału w kanale akceptora FRET. W tym celu odpowiednie obrazy donora FRET i akceptora FRET muszą zostać wyrównane przestrzennie.
Detekcja zdarzeń smFRET (FRET pojedynczych cząsteczek)
Dzięki zastosowaniu laserów jako źródła wzbudzenia, czułej kamery oraz mikroskopii TIRF z tłumieniem szumów, fluorescencję pojedynczych fluoroforów można łatwo śledzić w czasie. Podobne zasady obowiązują w przypadku detekcji międzycząsteczkowych zdarzeń smFRET. Niemniej jednak komplikacje mogą być powodowane przez przesączanie sygnału donora FRET oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET, dlatego podczas dostosowywania gęstości fluoroforów w eksperymencie smFRET należy zachować szczególną ostrożność.
W poniższym protokole (sekcja protokołu 4) jako donor FRET wybrano TCR w dużym stężeniu, a jako akceptor FRET pMHC w niskim stężeniu. Aby wystarczająco zredukować przesłuch (bleedthrough) donora FRET, należy oznakować 10-30% cząsteczek TCR fluorescencyjnym scFV, a 90-70% cząsteczek TCR niefluorescencyjnym scFV. W tym przypadku kanał akceptora FRET wybrano jako kanał pojedynczych cząsteczek, ponieważ jest on konfokalny z kanałem smFRET. Pomaga to powiązać zdarzenia smFRET z pojedynczymi cząsteczkami akceptorów FRET, co stanowi podstawę walidacji smFRET.
Wyznaczanie stałych dysocjacji synaptycznych za pomocą pomiarów smFRET
Podczas wyznaczania okresu półtrwania oddziaływań z przebiegów FRET pojedynczych cząsteczek należy uwzględnić fotoblaknięcie zarówno donora, jak i akceptora FRET. Liczba obserwowalnych sygnałów FRET w momencie pojawienia się pojedynczej pary donor-akceptor N(0) ulega w czasie zmniejszeniu zarówno w wyniku dysocjacji kompleksu receptor-ligand, jak i fotoblaknięcia. Liczbę kompleksów utrzymujących się w danym czasie N(t) można wyrazić matematycznie w następujący sposób:
<img alt="Wzór na zanik populacji; N(t) = N(0)exp(-t/τ_bleach)exp(-t/τ_off); wyjaśnienie fotowybielania." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
W członie fotoblaknięcia exp(-t/τbleach) czas t jest opisany jako iloczyn liczby obserwacji n oraz czasu naświetlania till, ze względu na nieciągły, dyskretny tryb obserwacji (t.j. blaknięcie zachodzi tylko podczas naświetlania). W członie kinetycznym exp-(t/τoff) czas t jest iloczynem liczby obserwacji n oraz czasu tlag dla pojedynczej obserwacji FRET (t.j. kinetyczne rozłączenie zachodzi w sposób ciągły). Równanie 1 można zapisać jako:
<img alt="Równanie zaniku fluorescencji białka, N(t)=N(0)exp(-ntfit/tbleach)exp(-ntflag/toff)." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">
Termin τbleach/τill opisuje liczbę obserwacji do momentu wystąpienia blaknięcia i jest zdefiniowany jako wartość oczekiwana &lt;nbleach&gt; jego funkcji wykładniczej. Równanie 2 można uprościć w następujący sposób:
<img alt="Równanie procesu rozpadu, funkcja wykładnicza, zależność od czasu, formuła symboliczna, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3">
Wartość oczekiwana &lt;n(tlag)&gt; liczby klatek N(t) z obserwowalnymi zdarzeniami FRET po czasie t jest wyznaczana bezpośrednio z eksperymentu. Zależy ona od ustawionego czasu między obserwacjami (tlag) wybranego w eksperymencie oraz nieznanych wartości τoff (odwrotności stałej szybkości dysocjacji koff) oraz &lt;nbleach&gt;, czyli wartości oczekiwanej liczby obserwacji przed wystąpieniem fotowyblaknięcia.
Zatem obliczenie wartości oczekiwanej &lt;n(tlag)&gt; dla co najmniej dwóch wartości tlag umożliwia eksperymentalne wyznaczenie &lt;nbleach&gt; oraz τoff.
Wyznaczanie synaptycznych wartości 2D-KD za pomocą pomiarów opartych na FRET
Pomiar stopnia zajętości TCR, t.j. stosunku związanych TCR do całkowitej liczby TCR, jest kluczowy dla wyznaczenia wartości synaptic 2D-KD. Zgodnie z równaniem 4 termin ten jest wprost proporcjonalny do zmierzonej wydajności FRET, pod warunkiem że TCR pełnią rolę donorów FRET, a pMHC rolę akceptorów FRET.
<img alt="Wzór na wydajność FRET a=FRET yield·c; powiązany z analizą FRET (transferu energii rezonansowej Förstera)." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4">
gdzie a = stopień zajęcia TCR, C = współczynnik konwersji
C jest stałą, która zależy od systemu FRET oraz zastosowanych fluoroforów. Można ją wyznaczyć eksperymentalnie, jak pokazano poniżej. Wartość a może zostać przekształcona w 2D-KD zgodnie z równaniem 5, jeżeli znana jest początkowa gęstość ligandów TCR przed dodaniem limfocytów T do dwuwarstwy. Wynika to z wysokiej mobilności białek przyłączonych do SLB oraz z faktu, że SLB stanowią niemal niewyczerpalny rezerwuar ligandów 2.
<img alt="Równanie dla dwuwymiarowej stałej dysocjacji równowagowej, obejmujące stężenie pMHC i zmienną 'a'." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5">
gdzie [pMHC initial] = początkowe zagęszczenie pMHC przed dodaniem limfocytów T
Wykorzystując równania 4 i 5 można teraz łatwo wyznaczyć synaptyczne 2D-KD pomiędzy TCR a pMHC. Najbardziej wiarygodnie przeprowadza się to za pomocą pomiarów FRET opartych na regeneracji donora po wybieleniu akceptora (patrz sekcja protokołu 3.1).
Aby jednak zmierzyć C, należy określić zależność między intensywnością FRET IFRET (skorygowaną o tło, przenikanie sygnału donora FRET oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET) a stopniem zajętości TCR. W tym celu konieczna jest znajomość stosunku R między średnią intensywnością fluorescencji pojedynczych fluoroforów donora FRET związanych z TCR (np. Cy3 lub AF555) sm IFRET donor a średnią intensywnością zdarzeń FRET pojedynczych cząsteczek sm IFRET. Wartość R zależy od rozważanego układu FRET, filtrów emisyjnych oraz kamery użytej do detekcji fluorescencji.
Stopień zajętości TCR można następnie bezpośrednio wyznaczyć zgodnie z równaniem 6.
<img alt="Obliczanie wiązania TCR-pMHC; równania do analizy FRET; badanie oddziaływań biologicznych." src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 6">
gdzie R = sm IFRET donor / sm IFRET
R określono jako 1,45 dla układu H57 scFv- Cy3/pMHC-Cy5, co prowadzi do:
a= całkowity IFRET/ całkowity ITCR-cy3 • 1,45
Zależność między stopniem zajętości TCR a wydajnością FRET można określić poprzez odzyskiwanie sygnału donora FRET po wybieleniu akceptora. W tym celu oba parametry naniesiono na wykres dla liczby mikroklastrów TCR, jak pokazano na ryc. 4A. Nachylenie dopasowania liniowego wskazuje współczynnik konwersji C (z równania 4).
Jak pokazano na Rysunku 4A, wartości C dla (a) układu FRET H57 scFV- Cy3/pMHC-Cy5 oraz (b) zastosowanej konfiguracji systemu mikroskopowego wynoszą 1,995. Stopień zajętości TCR a można łatwo wyznaczyć w następujący sposób:
Zajętość TCR a = FRET yield • 1.995

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>ekspresję bakteryjną</td></tr><tr><td>Sf900 II Life</td><td>Technologies</td><td>10227402</td><td>pożywki komórkowe owadów do produkcji wirusa baculo</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS z L-glutaminą (Lonza)</td><td>Pożywka komórkowa dla owadów 10564038 Fisher Scientific do ekspresji wirusa baculo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Komórki Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>komórki dla wirusa Produkcja i ekspansja</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>komórki do ekspresji poteiny</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>ekspresję bakterii</td></tr><tr><td>System Centramate</td><td>Koncentracja białka Palla</td><td></td><td>z dużych objętości</td></tr><tr><td>Kaseta Centramate 10kDa odcięcie</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td> białka <td>z dużych objętości</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Koncentrat</td><td>białek</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 Koncentrat</td><td>białek</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>koncentrat białek</td></tr><tr><td>&Auml; kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>oczyszczanie białka</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>oczyszczanie białka</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>oczyszczanie białka</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>oczyszczanie białka</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>System HPLC Gilsona</td> Oczyszczanie <td>Gilsona</td><td></td><td>peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 250 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 50 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Kolumna Tricorn 10/20&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>System HPLC Gilson</td> Oczyszczanie <td>Gilsona</td><td></td><td>peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 250 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Pursuit XR C18, 5 i mikro; Rozmiar cząstek m, rozmiar kolumny 21,2 * 50 mm</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem</td></tr><tr><td>Cy3 maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych, niesparowanych cystein</td></tr><tr><td>Cy5 maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych, niesparowanych cystein</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Technologie</td><td>życia</td><td>A-20346</td><td>znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych niesparowanych cystein</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych niesparowanych cystein</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, przenikanie komórkowe</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>barwnik wrażliwy na wapń do znakowania komórek</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich 151874</td><td></td><td>do rozpuszczania fury-2 am</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka plus wapń/magnez</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>bufor do obrazowania</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina liofilizowana proszek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>suplement do obrazowania bufor</td></tr><tr><td>14-4-4S przeciwciało</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>przeciwciało blokujące dla H2-I-Ek (rozpoznawane przez 5c.c7, 2B4 i AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml polipropylenowa probówka okrągłodenna</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filtr odśrodkowy Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m</td><td>Mikrosfery Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwony</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do pomiarów wapnia na bazie fura-2&nbsp;</td><td>Mikroskop LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>do pomiarów (pojedynczych cząsteczek) FRET</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>szczegółowe informacje można znaleźć w równoległym artykule JoVE autorstwa Axmanna i wsp.</td><td></td></tr><tr>Dwuwarstwy <td></td><td>lipidowe podparte planarnie</td><td>, aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z równoległym wkładem JoVE autorstwa Axmanna i wsp.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, z L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>pożywka z komórek T</td></tr><tr><td>aminokwas endogenny 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>Suplement pożywki dla komórek T</td></tr><tr><td>penicylina / streptomycyna / L-glutamina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>Suplement pożywki dla komórek T</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowane białko interleukiny-2 myszy</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>Suplement pożywki dla komórek T</td></tr><tr><td>Klasa badawcza Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Pochodzenie (program analizy)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>nieliniowe dopasowanie dwóch parametrów (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

pomiar wiązania tcr-pmhc in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na fret

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Limfocyty T są niezwykle specyficzne i skuteczne w rozpoznawaniu antygenów w postaci peptydów osadzonych w cząsteczkach MHC (pMHC) na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Dzieje się tak pomimo tego, że receptory antygenu komórek T (TCR) wywierają zwykle umiarkowane powinowactwo (zakres μM) do antygenu, gdy wiązanie mierzy się in vitro1. Ze względu na parametry molekularne i komórkowe przyczyniające się do wrażliwości antygenu komórek T, opracowano metodologię opartą na mikroskopii jako sposób monitorowania wiązania TCR-pMHC in situ, ponieważ zachodzi ono w synapsie żywej komórki T oraz sztucznej i funkcjonalizowanej dwuwarstwowej płaskiej warstwy lipidowej (SLB) na podłożu szklanym, która naśladuje błonę komórkową komórki prezentującej antygen (APC) 2. Pomiary opierają się na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między przesuniętym do niebieskiego i czerwonego barwnikiem fluorescencyjnym dołączonym do TCR a pMHC. Ponieważ wydajność FRET jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między barwnikami, można wykorzystać sygnały FRET do wizualizacji synaptycznego wiązania TCR-pMHC. Czułość podejścia mikroskopowego wspomaga wykrywanie zdarzeń FRET w postaci pojedynczej cząsteczki. Pozwala to określić powinowactwo i niewspółczynniki interakcji synaptycznych TCR-pMHC, a co za tym idzie, interpolować szybkość wiązania. Analogiczne testy można zastosować do pomiaru innych interakcji receptor-ligand w ich naturalnym środowisku.

Rejestracja wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą barwnika wapniowego fura-2, a także późniejsza analiza komórkowa w celu weryfikacji potencjału stymulującego, a tym samym funkcjonalności SLB, przedstawione są na Rysunku 4. Jak widać, poziomy wapnia w limfocytach T (wyrażone jako znormalizowany stosunek fura-2 340nm/380nm, gdzie poziom bazowy wynosi 1) wzrastają natychmiast po osiadaniu komórek na stymulujących SLB. Poziomy wapnia powracają do wartości bazowych krótko po dodaniu przeciwciała, które blokuje angażowanie pMHC przez TCR, co kończy aktywację limfocytów T.
Rysunek 6 przedstawia typowy eksperyment obejmujący powrót donora FRET po wybieleniu akceptora, który jest wykorzystywany do pomiaru wydajności FRET i służy do obliczania wartości 2D-KD (pokazanych na Rysunku 4). Należy zwrócić uwagę na wzrost intensywności donora FRET, reprezentującego TCR znakowany AF555, po szybkiej i całkowitej ablacji gatunku akceptora FRET (tutaj: AF647 związany z pMHC). Widoczna jest również silna redukcja w kanale FRET, tj. w kanale akceptora FRET przy wzbudzeniu donora FRET, po wybieleniu akceptora FRET. Ledwo widoczny pozostały sygnał odpowiada przesiąkowi (bleedthrough) donora FRET. Wydajność FRET w obrębie pojedynczych mikroklastrów TCR lub całych synaps jest obliczana na podstawie wskazanych zmierzonych wartości intensywności (Rysunek 6B).
Rycina 7 przedstawia trajektorię i sekwencję czasową zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki widocznego w dwóch ramach czasowych. Jak opisano powyżej we wstępie, takie zachowanie jest spowodowane zarówno rozpadem wiązania synaptycznego TCR-pMHC, jak i fotoblakaniem. Aby rozróżnić te dwa wkłady, należy zróżnicować czas trwania ram akwizycji eksperymentalnej: podczas gdy fotoblakanie pozostaje stałe, zmiany w długości trajektorii zdarzenia FRET są powodowane wyłącznie przez kinetykę wiązania. Ilościowe określenie długości śladów, które stanowią podstawę do obliczenia stałych szybkości dysocjacji oraz blakania przedstawionych na Rycynie 7, podano w tabelach 1–3.
Wyznaczenie 2D-KD wymaga zarejestrowania całkowitych wydajności FRET dla TCR znakowanych donorem FRET. Przy użyciu wyznaczonej eksperymentalnie stałej C (Rycina 4), wydajność FRET zmierzoną dla mikroklastra TCR lub całej synapsy można przekształcić w stopień zajętości TCR a, t.j. stosunek TCR związanych z pMHC do całkowitej liczby TCR (Rycina 4C). Znając gęstość pMHC obecną na SLB przed dodaniem limfocytu T, wartości a można wykorzystać do wyznaczenia synaptycznych wartości 2D-KD (Rycina 4D). Stałe szybkości asocjacji można obliczyć zgodnie z prawem działania mas (2D-kon = 2D-koff/2D-KD) na podstawie wyznaczonych synaptycznych wartości stałej szybkości dysocjacji oraz 2D-KD.
<img alt="Schemat dwuwarstwy lipidowej z POPC, DGS NTA-Ni; podłoże szklane; metoda znakowania białek fluorescencyjnie." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny zarys płaskiego systemu lipidowych dwuwarstw wspieranych na szkle (SLB). (A) SLB składają się z POPC (90-99%) oraz syntetycznego lipidu DGS Ni-NTA (1-10%) i tworzą się spontanicznie, gdy czyste powierzchnie szklane zostaną naładowane małymi pęcherzykami jednowarstwowymi (SUVs) składającymi się z odpowiednich lipidów. (B) Po utworzeniu takie SLB mogą zostać funkcjonalizowane rozpuszczalnymi fragmentami zewnątrzkomórkowymi z tagiem polihistydynowym pochodzącymi z pMHC, kostymulującymi białkami B7-1 oraz białkami adhezyjnymi ICAM-1, aby służyć jako APC dla limfocytów T. Więcej informacji na temat przygotowania SLB znajduje się w pracy Axmann et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat oddziaływania TCR-pMHC z wykorzystaniem mikroskopii FRET i TIRF do analizy wiązania białek." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test oparty na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET) do ilościowego oznaczania wiązania TCR-pMHC in situ. (A) Złożona struktura kompleksu TCR z fragmentem jednocząsteczkowym H57 wiążącym pMHC ilustruje opisaną tutaj metodę opartą na FRET. Należy zwrócić uwagę na krótką odległość wynoszącą około 41Å, oddzielającą dwa odpowiadające sobie fluorofory podlegające FRET. Miejsca akceptorowe dla fluoroforów-maleimidów zaznaczono kolorem zielonym i czerwonym. (B) Przedstawiono zasadę wykrywania oddziaływań TCR-pMHC in situ. Tylko TCR-y i pMHC (tutaj I-Ek) znakowane scFV, które tworzą specyficzne kompleksy, generują mierzalny sygnał FRET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny, znakowane peptydy, kolumny Superdex, analiza oczyszczania białek." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Chromatogramy końcowego etapu filtracji żelowej prowadzącego do uzyskania monomerycznych scFVs oraz cząsteczek I-Ek -2x6H obciążonych peptydami. Osie X reprezentują objętość retencji w ml, osie Y wskazują absorbancję przy 280 nm w jednostkach arbitralnych (AU). (A) scFV H57 znakowany specyficznie w określonym miejscu maleimidem Alexa Fluor 555 poddano chromatografii S75 w celu oddzielenia niezwiązanego barwnika od białka (krok 1.2.5). Frakcje odpowiadające przedziałowi retencji od 14 do 15 ml (linie przerywane) reprezentują znakowane monomeryczne scFV H57. (B) Cząsteczki I-Ek -2x6H w kompleksie z peptydem ANP-space holder, który jest usuwany pod wpływem UV, zostały naświetlone promieniami UV, inkubowane z peptydem znakowanym specyficznie w określonym miejscu maleimidem Alex 647, a następnie poddane chromatografii S200 w celu oddzielenia białka od wolnego peptydu (krok 1.1.2.4). Przedział między liniami przerywanymi zawiera prawidłowo sfałdowane i monomeryczne pMHC. (A, B) Na początku przebiegu (punkt 0 ml) na kolumnę naniesiono 0,7 ml próbki. Zebrane frakcje zostały skoncentrowane. Stosunek białka do barwnika określono za pomocą fotospektrometrii przed dializą przeciwko PBS/50% glicerolu (do przechowywania w -20°). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza zajętości TCR względem wydajności FRET, histogramy, wykresy pokazujące klastry, dane dotyczące kinetyki wiązania." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wyznaczanie 2D-KD oraz 2D-kon. (A) Korelację między wydajnością FRET, wyznaczoną poprzez odzyskiwanie donora po wybieleniu akceptora, a zajętością TCR zmierzono eksperymentalnie. Zajętość TCR można wyznaczyć dla pojedynczych mikroklastrów TCR, zgodnie z wyjaśnieniami w sekcji 4.2. Dopasowanie liniowe danych przedstawiono linią, której nachylenie odpowiada stosunkowi C między zajętością TCR a wydajnością FRET. C jest stałą specyficzną dla systemu FRET i zastosowanych fluoroforów (tutaj Cy3 i Cy5). W tym przykładzie wyniosła ona 1,988. (B) Dane dotyczące wydajności FRET wyznaczono dla pojedynczych mikroklastrów TCR (N = 187, temperatura = 24 °C) poprzez odzyskiwanie donora po wybieleniu akceptora. Liczby pod słupkami histogramu wskazują górną granicę przedziału. (C) Przeliczenie danych pokazanych w (B) poprzez pomnożenie zmierzonych wydajności FRET przez stałą C wyznaczoną w (A). Liczby pod słupkami wskazują górną granicę przedziału. (D) Histogram (półlogarytmiczny, podstawa = 4) przedstawiający rozkład wartości 2D-KD zmierzonych dla pojedynczych mikroklastrów TCR. Medianę 2D-KD zaznaczono na niebiesko. Liczby pod słupkami wskazują górną granicę przedziału. (E) Histogram pokazany w (D) został przekształcony w histogram 2D-kon (półlogarytmiczny, podstawa = 4) przy zastosowaniu synaptycznej wartości koff dla 24 °C (0,41 s-1). Wyznaczoną medianę wartości 2D-kon zaznaczono na niebiesko. Dane zostały pierwotnie opublikowane w pracy Huppa et al.2 i są tutaj przedstawione w nowym formacie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia za pomocą Fura-2 i analiza stosunku; odpowiedź limfocytów T w czasie; dane mikroskopowe i wykresy." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Walidacja funkcjonalna SLB zastosowanych do stymulacji i obrazowania limfocytów T. (A) Blasty limfocytów T transgenicznych TCR naładowane fura-2 zostały poddane działaniu stymulujących SLB zawierających antygenowe pMHC, ICAM-1 i B-7. Zarejestrowano emisję fura-2 z komórek przy pobudzeniu 340 nm i 380 nm oraz obrazy DIC. Jak wskazano, wartości stosunku intensywności emisji pobudzonej przy 340 i 380 nm przedstawiono na prawym panelu. Dodanie przeciwciał blokujących pMHC w 14 minucie przebiegu eksperymentu spowodowało spadek wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia do poziomu porównywalnego z limfocytami T w stanie spoczynku. (B) Typowy profil czasowy średnich stosunków fura-2 w limfocytach T kontaktujących się ze stymulującymi SLB charakteryzuje się początkowym wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, który jest od 2 do 4 razy wyższy w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami T lub limfocytami T pozbawionymi antygenu po blokadzie za pośrednictwem przeciwciał. Zielone kółka wskazują punkty czasowe zilustrowane w części (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii FRET, wzbudzenie/emisja DNA, schemat kanałów, analiza wydajności FRET w synapsie." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Zbiorcze wydajności FRET mierzone poprzez odzyskiwanie donora FRET po wybieleniu akceptora FRET. (A) Przedstawiono przykład typowego pomiaru FRET w synapsie. Jak wskazano po lewej stronie i u góry, seria obrazów została pozyskana przy użyciu dzielnika wiązki emisji, co pozwoliło na uzyskanie kanału donora FRET i kanału akceptora FRET (szczegółowe informacje na temat dzielników wiązki znajdują się u Axmann et al4). Linia pokazana na lewym obrazie DIC wskazuje granicę synapsy komórki T. Należy zwrócić uwagę na spadek intensywności w kanale akceptora FRET, a także wzrost intensywności w kanale donora FRET po wybieleniu akceptora FRET (krok 4). (B) Efektywności FRET mogą być kwantyfikowane, jak wskazano, dla poszczególnych obszarów synaptycznych lub dla całych synaps. Do celów weryfikacji, obrazy przed i po wybieleniu akceptora FRET przedstawiono z użyciem dwóch tabel mapowania kolorów (LUTs, green i physics). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy FRET: kanały sm FRET i Alexa 647 w czasie; fluorescencyjny rezonansowy transfer energii." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Zdarzenia FRET pojedynczych cząsteczek pojawiają się i znikają w pojedynczych krokach i są idealnie zsynchronizowane z pojedynczym fluorophorem akceptorem FRET. Przedstawiono przebieg czasowy zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki. Obrazy zostały pozyskane przy użyciu kamery EMCCD z podświetleniem tylnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zaniku wykładniczego pokazujący wpływ opóźnienia czasowego na wykrywalne zdarzenia; analiza danych, dopasowanie krzywych." src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Wyznaczanie τoff = 1/ koff z pomiarowych trajektorii smFRET. (A) Znormalizowane sumy skumulowane obserwowalnych sygnałów FRET (pochodzące z blastów transgenicznych limfocytów T TCR 5c.c7 znakowanych H57 scFV-AF555 rozpoznających I-Ek/K3-AF647 w 24°C) dla czterech różnych opóźnień czasowych (42 msec, 490 msec, 1,007 msec, 1,989 msec) przedstawiono jako funkcję całkowitej liczby obserwacji. Funkcje dopasowania mono-wykładniczego pozwalają na wyznaczenie odpowiadających im ujemnych odwrotności wartości oczekiwanych &lt;n(tlag)&gt;. (B) Wartości oczekiwane wykreślono w funkcji opóźnień tlag i dopasowano za pomocą równania &lt;n(tlag)&gt; = τoff /{(τoff /&lt;nbleach&gt;) + tlag}, aby otrzymać τoff oraz &lt;nbleach&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

W tym filmie pokażemy, jak mierzyć kinetykę oddziaływań między receptorem antygenowym limfocytów T a kompleksem głównego układu zgodności tkankowej z załadowanym peptydem (pMHC) w 2D, czyli w obrębie synapsy immunologicznej między limfocytem T a płaską, wspieraną błoną lipidową. Krótko omówimy istotne aspekty produkcji białek oraz weryfikacji integralności funkcjonalnej błony lipidowej za pomocą pomiarów strumienia jonów wapnia. Po bardziej szczegółowe informacje na temat przygotowania błon lipidowych oraz konfiguracji mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania pojedynczych cząsteczek prosimy o zapoznanie się z naszą równoległą publikacją w Journal of Visualized Experiments. Następnie szczegółowo wyjaśnimy, jak przeprowadzać i analizować pomiary transferu energii rezonansowej FRET w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych cząsteczek.Aby wywnioskować kinetykę wiązania synaptycznego receptora limfocytów T z PMHC i wyjaśnić naszą strategię opartą na FRET zastosowaną w ogólnym podejściu, zaczynamy od struktury krystalicznej receptora limfocytów T (TCR), tutaj zaznaczonego na niebiesko, w momencie wiązania z antygenem, czyli cząsteczką MHC obciążoną peptydem (PMHC), pokazaną na żółto i czerwono. Wprowadzamy również jednoczynnikowy fragment domen zmiennych przeciwciała reaktywnego wobec łańcucha beta receptora limfocytów T, nazwanego AGE57. W celu przeprowadzenia ilościowych pomiarów opartych na FRET konieczne jest swoiste dla miejsca znakowanie zarówno donora FRET, w naszym przypadku fragmentu jednoczynnikowego, jak i akceptora FRET, czyli PMHC.Jest to możliwe w przypadku białek rekombinowanych poprzez wprowadzenie nienaturalnej cysteiny, która może następnie zostać kowalencyjnie związana z koniugatami fluoroforów. Jak pokazano, do fragmentu jednoczyniącego przyłączamy donora FRET Alexa Fluor 555 lub Cy3, a do końca C-końcowego peptydu związanego z MHC akceptora FRET Alexa Fluor 647 lub Cy5.Odległość Indy pokazana w tej strukturze kompozytowej wynosi około 41 angstrum, co jest wartością mniejszą nawet niż pierwszy promień, czyli odległość połowicznego maksymalnego transferu energii między dwoma barwnikami. W naszych eksperymentach wykorzystujemy płaskie dwuwarstwy lipidowe na podłożu szklanym jako substytuty komórek prezentujących antygen. Są one funkcjonalizowane PMXC, cząsteczką atory B71 oraz cząsteczką adhezyjną I chem 1.W ten sposób obrazowanie może być przeprowadzone w trybie fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia, który oświetla fluorofory znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni styku, co znacznie redukuje tło komórkowe. FRET jest wykrywalny tylko wtedy, gdy TCR znakowane fragmentami jednołańcuchowymi wiążą pMHC osadzone w warstwie. Pozwala nam to zwizualizować wiązanie TCR-pMHC, a następnie obliczyć kinetykę wiązania w obecności prawidłowo sfałdowanego histogenu.Fragmenty zewnątrzkomórkowe białek P71 oraz Ichem1 są oczyszczane z supernatantów kultur komórek owadziech zainfekowanych odpowiednim wirusem BUC. Oczyszczanie przeprowadzane jest w trzech etapach, zaczynając od chromatografii powinowactwa do niklu (Ni-NTA), a następnie chromatografii wymiany jonowej i wykluczania wielkościowego. Heterodimery MHC klasy II z znacznikiem His są ekspresowane w E. coli jako ciałka inkluzyjne, a następnie refoldowane in vitro w temperaturze 4 °C w obecności peptydu stabilizującego poprzez szybkie rozcieńczenie w buforze redoks.Peptyd pełniący rolę wypełniacza zostanie później odszczepiony poprzez naświetlanie światłem UV. Prawidłowo sfałdowane kompleksy PMHC są oczyszczane i zagęszczane wraz z wypełniaczem. Peptyd jest odszczepiany i zastępowany peptydem fluorescencyjnym przy pH 5,2.Produkt końcowy jest oczyszczony pod kątem wielkości. Fragment jednocułkowzy jest eksprymowany w postaci ciał inkluzyjnych w e coli z wolną cysteiną, a następnie refoldowany in vitro poprzez dializę stopniową i oczyszczany pod kątem wielkości. Następnie jest on znakowany za pomocą wolnej cysteiny barwnikiem sprzężonym z maleimidem i ponownie oczyszczany pod kątem wielkości.Wszystkie białka rekombinowane są ostatecznie dializowane przeciwko PBS zawierającemu 50% glicerolu, zagęszczane do stężenia 1 mg białka na ml i przechowywane długoterminowo w temperaturze -20 °C. W celu pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia w limfocytach T, jako sposób na weryfikację potencjału stymulującego lipid blay, należy zastosować ratiometryczny barwnik URA two. Obciążone blasty limfocytów T należy inkubować z estrem URA 2:00 AM.Związek ten wnika do komórek poprzez swój motyw AM, ale następnie zostaje w nich uwięziony w wyniku działania esteraz, które odszczepiają część AM. Dodaj fira 2:00 AM do około 3 milionów limfocytów T w końcowym stężeniu 5 µM na litr. Przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do nowej probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Przemyj komórki raz w buforze do obrazowania zawierającym roztwór soli w buforze Hanksa z dodatkiem wapnia i magnezu oraz 1% albuminy. W celu monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia użyj zautomatyzowanego systemu odwróconego mikroskopu z możliwością naświetlania UV. Rozpocznij protokół pomiaru czasu i dodaj co najmniej dwie załadowane limfocyty T do funkcjonalizowanej dwuwarstwy lipidowej umieszczonej w ognisku na stoliku mikroskopu, a następnie w regularnych odstępach czasu wykonaj obraz DIC oraz dwa obrazy fluorescencyjne wzbudzone światłem UV o długości fali 340 i 380 nm.Bezpośrednio po nawiązaniu kontaktu z dwuwarstwą limfocyty T wykazują podwyższony poziom wapnia, co jest odczytywane przez stosunek URA dwa w 15. minucie pomiaru. Do komórek należy dodać przeciwciało blokujące, które nasyca wszystkie antygeny PMHC. W konsekwencji wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia spadają do wartości charakterystycznych dla stanu nieaktywnego, które służą później jako punkt odniesienia.Gdy tylko poziomy obecnych przeciwciał blokujących spadną do wartości odzwierciedlającej stan nieaktywowany, którą normalizujemy do jedności dla pomiarów FRET, limfocyty T muszą zostać zabarwione sondą FRET w postaci jednoprzestronowego fragmentu przeciwciała reaktywnego wobec TCR. Dla każdego eksperymentu przenieś około 1 milion komórek do probówki i odwiruj je przy 400 g. Odlej medium i usuń pozostałe krople medium przylegające do wewnętrznych ścianek za pomocą ręcznika papierowego. Zapewnia to minimalną objętość inkubacji wynoszącą około 30 µL, o której wspomniałem wcześniej.Sonda FRET jest przechowywana w stężeniu 1 mg/mL w 50% glicerolu w temperaturze -20 °C. Jest ona znakowana specyficznie w danej pozycji za pomocą Alexa Fluor 555 lub Alexa Fluor 647 w stosunku sonda:białko równym 1:1. Dodaj 0,3 µL sondy do komórek. Delikatnie i kilkukrotnie uderz w probówkę, aby rozbić osad, a następnie inkubuj komórki przez 20 minut w lodzie.Przemyj komórki w lodowatym buforze do obrazowania. Powtórz tę procedurę płukania raz. Inkubacja, wirowanie oraz przechowywanie w niskiej temperaturze zapewniają, że limfocyty T nie internalizują fluorescencyjnej sondy podczas ekspozycji na nią.Doprowadziłoby to do podwyższonej fluorescencji tła. Co więcej, limfocyty T nie tracą sondy w niskiej temperaturze podczas płukania i przechowywania przed umieszczeniem bielara z komorą na wymienniku stolika mikroskopu. Przy wymianie PBS na bufor do obrazowania należy za wszelką cenę unikać kontaktu dwuwarstwy z powietrzem, ponieważ doprowadziłoby to do jej zniszczenia.Aby zmniejszyć tło komórkowe, stosujemy oświetlenie typu turf. W tym celu ustawiamy wiązkę wzbudzenia pod kątem krytycznym, przy którym zachodzi całkowite wewnętrzne odbicie. Wyłącz wzbudzenie, włącz światło szerokokątne, dodaj limfocyty T do komory ltec i pozwól im osiąść na warstwie lipidowej.Włącz wzbudzenie i ustaw ostrość poza obszarem turf. Błona komórkowa jest widoczna jako pierścień wzdłuż osi optycznej w każdej płaszczyźnie ogniskowania; w obszarze turf widoczna jest jedynie błona podstawna w kontakcie z dwuwarstwą. Płaszczyzny ogniskowania powyżej nie są już wzbudzane, a w konsekwencji nie są widoczne.Protokół czasowy rozpoczyna się od czerwonego i zielonego impulsu wzbudzenia w celu obrazowania PMHC i TCR, po których następuje czerwony impuls wybielający w celu ablacji akceptora P-M-H-C-F. Zielony impuls do obrazowania TCR po wybieleniu akceptora F oraz czerwony impuls do weryfikacji ablacji akceptora F są wykonywane w skali poniżej sekundy, z jak najkrótszą przerwą między pierwszym a drugim impulsem zielonym. Opcjonalnie, na początku można uzyskać obraz DIC; rozdzielenie obrazu dwukolorowego umożliwia jednoczesną detekcję kanału donora i akceptora.Ekscytacja akceptora wykazuje akumulację p MHC w synapsie limfocytów T. Ten obraz wstępny potwierdza obecność p MHC i wskazuje na już zachodzące wiązanie p MHC pośredniczone przez TCR. Ekscytacja donora generuje obrazy w obu kanałach.Sygnał z kanału donora FRET jest w pewnym stopniu zredukowany pod względem intensywności ze względu na przekaz energii do kanału akceptora FRET. Sygnał z kanału akceptora FRET składa się z przenikania sygnału (bleed-through) donora FRET oraz wzbudzenia krzyżowego akceptora FRET. Niemniej jednak, obraz ten nie zostanie wykorzystany do analizy.W niniejszym protokole następuje szybkie wybielanie, które eliminuje wszystkie zaakceptowane siły fluoro-F. Intensywność obrazu donora F Fed po dopuszczalnym wybielaniu FRET zostaje teraz przywrócona do wyższych poziomów bez utraty intensywności w kanale fre.Następująca analiza akceptora FRET weryfikuje całkowite wybielenie akceptora F. Przybliżmy widok synapsy, aby określić stopień regeneracji donora FRET. Należy wyznaczyć średnią intensywność tła, która pozostaje stała niezależnie od akceptora FRET.Następnie przeprowadź fotowybielanie, a potem wyznacz średnią intensywność synapsy oraz reprezentatywnego klastra TCR. Wydajność FRET oblicza się poprzez normalizację różnicy przed i po ablacji akceptora F. W naszym przykładzie zmierzono 16% FRET dla całej synapsy i 26% FRET dla reprezentatywnego klastra.Wydajności FRET klastrów TCR zostaną później przekonwertowane na stopień zajętości TCR, co pozwoli na uzyskanie dwuwymiarowych danych jednocząsteczkowych dotyczących stałej dysocjacji synaptycznej. Służy to wyznaczeniu kinetyki wiązania TCR z peptydem MHC w synapsie dla jednocząsteczkowych eksperymentów FRET. Stosujemy te same odczynniki i strategię etykietowania co poprzednio.Aby jednak upewnić się, że rzeczywiście obserwujemy oddziaływanie między pojedynczym TCR a pojedynczym kompleksem peptyd-MHC, zdecydowaliśmy się spełnić następujące kryterium. Zdarzenie kandydujące na pojedynczą cząsteczkową FRET musi współwystępować z pojedynczym akceptorem FRET lub pojedynczą cząsteczką donora FRET. W tym przypadku wykorzystujemy pojedynczy pMHC jako cząsteczkę akceptora FRET, aby zweryfikować jednocząsteczkowy charakter obserwowanego zdarzenia FRET, stosując analogiczne rozumowanie w odwrotnym przypadku.Wykorzystanie akceptorów w kanałach wyższych oraz donorów w kanałach niższych jest jak najbardziej możliwe. Zazwyczaj poddajemy limfocyty T w kontakcie ze stymulującą warstwą lipidową wzbudzeniu światłem o długości 514 i 647 nm; sekwencyjne i powtarzalne wzbudzanie donora i akceptora z minimalnym opóźnieniem wynoszącym 1 ms jest poprzedzone czasem oczekiwania, który może być zmieniany w zależności od wymagań eksperymentu.Aby uzyskać wystarczająco silny sygnał fluorescencyjny dla detekcji pojedynczego barwnika w ciągu milisekund od wzbudzenia, konieczne jest zastosowanie wysokich gęstości mocy wzbudzenia w zakresie od 1 do 5 kW/cm². Ze względu na fotobleaching liczba widocznych cząsteczek akceptora FRET PMHC szybko spada do poziomu, w którym pojedyncze siły fluoroakceptora FRET stają się rozróżnialne w dwuwarstwie zawierającej 30 lub więcej znakowanych PMCS na µm². Przykład pokazano tutaj dla całkowitego opóźnienia czasowego wynoszącego 42 ms.Pojedyncze zdarzenie FRET oznaczone czerwonym okręgiem staje się widoczne w drugim i trzecim punkcie czasowym. Współlokalizuje się ono z pojedynczą cząsteczką S pięć oznaczoną zielonym okręgiem. W tym przykładzie obserwowalne zdarzenie FRET ma długość śladu równą dwóm; należy zebrać więcej śladów FRET dla pojedynczych cząsteczek, jak pokazano w tabeli w niektórych 128 śladach.Następnie oblicz komplementarną sumę skumulowaną śladów, zgodnie z zielonymi liczbami, znormalizuj je, przedstaw znormalizowane wartości na wykresie i dopasuj do nich funkcję monoeksponencjalną. Wartość oczekiwana wynosi nieco ponad 1,5 ramki czasowej. Wartość ta zależy od peptydy TCR, wiązania MHC oraz fotoblaknięcia; aby móc odróżnić te dwa wkłady, wartość oczekiwaną należy obliczyć dla co najmniej trzech różnych czasów.Następnie nanieście na wykres wszystkie wartości oczekiwane w funkcji odpowiednich opóźnień czasowych i dopasujcie punkty danych do przedstawionej funkcji zawierającej czas życia, który wynosi tutaj 2,12 s oraz wartość oczekiwaną dla fotobleachingu f Fred. Odzyskiwanie donora po akceptowalnym fotobleachingu, jak pokazano tutaj i wcześniej w większych szczegółach, może zostać wykorzystane do wyznaczenia w kilku prostych krokach dwuwymiarowych stałych dysocjacji, jakie występują w obrębie synapsy immunologicznej.W niniejszej analizie skupiamy się na zaangażowaniu TCR oraz klastrach TCR, w których wiązanie T-C-R-P-M-H-C jest najbardziej wyraźne. Jak wynika z przedstawionych pomiarów, wartości F FRED znacząco się różnią dla poszczególnych klastrów TCR.Pomnożenie F fred przez współczynnik proporcjonalności C pozwala wyznaczyć stopień zajętości TCR, A – termin opisujący stosunek liczby TCR związanych z pMHC do ich całkowitej liczby. Współczynnik C musi zostać wyznaczony raz dla konkretnego zestawu par fre oraz zastosowanego systemu FRE. Pod koniec tej prezentacji wyjaśnimy szczegółowo, jak wyznaczyć C, na przykład przy użyciu SI three i SI five umieszczonych specyficznie na fragmencie przeciwciała jednoprzestronowego reaktywnego TCR R oraz na C-końcu peptydu związanego z MHC. Wynosi on około dwóch synaptycznych, dwuwymiarowych stałych dysocjacji, które można obliczyć na podstawie stopnia zajętości TCR określanego jako A oraz początkowej gęstości pMHC obecnych na błonie lipidowej.Przedstawiona zależność wynika z prawa działania mas i jest wyjaśniona szczegółowo w artykule towarzyszącym temu filmowi. W naszym przykładzie początkowa gęstość pmcs wynosi 30 cząsteczek na mikrometr kwadratowy. Otrzymujemy rozkład 2D kds, które są efektywne w synapsie limfocytów T, z wartością mediany wynoszącą około 34 cząsteczek na mikrometr kwadratowy.Rozkład stałej on można obliczyć z synaptycznego dwuwymiarowego rozkładu KD oraz odpowiadającej mu stałej off, która wynosi tutaj 0,41 s⁻¹, co określono za pomocą analizy śladów FRET pojedynczych cząsteczek w temperaturze 24 °C. Wartość mediany wynosi około 0,01 µm²/(cząsteczka·s). Podsumowując, pomiary FRET między TCR a pMHC umożliwiają kompleksową analizę wszystkich parametrów kinetycznych opisujących dynamikę reakcji w C2.Niniejszą metodologię można w zasadzie uogólnić na analizę innych oddziaływań receptor-ligand, które mogą odgrywać kluczową rolę w rozpoznawaniu międzykomórkowym. Na koniec omówimy, jak eksperymentalnie wyznaczyć stałą C, która jest niezbędna do przeliczenia wydajności FRET na stopień zajętości TCR. Procedurę tę należy przeprowadzić tylko raz.Wyznaczoną stałą C można następnie wykorzystać we wszystkich kolejnych eksperymentach, w których zastosowano ten sam układ FRET z tymi samymi fluoroforami. W tej procedurze w zasadzie odnieśliśmy wydajność FRET mierzoną w poszczególnych klastrach TCR poprzez odzyskiwanie donora po fotowybieleniu akceptora do odpowiadających im wartości intensywności wykrytych w sensybilizowanym kanale FRET. Jak omówiono wcześniej, wydajność FRET jest wyznaczana z obrazów kanału donora FRET z korektą tła przed i po ablacji akceptora FRET.Skalibrowany kanał FRET musi być wyrównany z kanałem donora F oraz osiami X i Y i skorygowany o tło. Przedstawiono tutaj prześwit donora FRET (bleed through) oraz wzajemną ekscytację akceptora FRET (cross excitation). Szczegółowy opis sposobu korekty prześwitu donora FRET i wzajemnej ekscytacji akceptora FRET znajduje się w artykule.W nawiązaniu do tego filmu, należy teraz obliczyć dla każdego klastra TCR stosunek sygnału błędu obrazu FRET po korekcie do odpowiadającego mu skorygowanego obrazu donora FRET. Należy wyznaczyć skorygowany średni sygnał dla pojedynczych donorów FRET oraz pojedynczych zdarzeń FRET cząsteczkowych, a następnie obliczyć ich stosunek. Stopień zajętości TCR wyznacza się poprzez pomnożenie obu tych stosunków.Następnie należy nanieść na wykres wydajności FRET wyznaczone dla poszczególnych klastrów TCR w funkcji ich stopnia zajętości TCR. Wartość C jest następnie wyznaczana za pomocą regresji liniowej, jak pokazano tutaj. W naszym przykładzie wynosi ona w przybliżeniu dwa.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo potrafić wykorzystać funkcjonalizowaną białkami dwuwarstwę lipidową w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią pojedynczych cząsteczek do pomiaru kinetyki wiązania synaptycznego pomiędzy PMHC a TCR. Omówiono wszystkie niezbędne etapy, w tym produkcję białek, znakowanie limfocytów T oraz końcowe pomiary FRET. Ponadto szczegółowo zaprezentowano analizę obrazów, pozwalającą na uzyskanie krzywych aktywacji limfocytów T oraz wartości FRET.Na koniec przedstawiono metodologię stanowiącą podstawę wyznaczania kinetycznych stałych asocjacji i dysocjacji. Analogiczne podejście może w zasadzie zostać wykorzystane do badania innych oddziaływań ligandów z receptorami synaptycznymi, choć konieczne może okazać się wprowadzenie odpowiednich modyfikacji.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Poznaj metodę mikroskopii FRET do pomiaru kinetyki wiązania TCR-pMHC in situ w synapsie immunologicznej. Technika ta umożliwia ilościową analizę powinowactwa i stałych kinetycznych na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Przeglądaj więcej filmów