Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

W tym filmie pokażemy, jak mierzyć kinetykę oddziaływań między receptorem antygenowym limfocytów T a kompleksem głównego układu zgodności tkankowej z załadowanym peptydem (pMHC) w 2D, czyli w obrębie synapsy immunologicznej między limfocytem T a płaską, wspieraną błoną lipidową. Krótko omówimy istotne aspekty produkcji białek oraz weryfikacji integralności funkcjonalnej błony lipidowej za pomocą pomiarów strumienia jonów wapnia. Po bardziej szczegółowe informacje na temat przygotowania błon lipidowych oraz konfiguracji mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania pojedynczych cząsteczek prosimy o zapoznanie się z naszą równoległą publikacją w Journal of Visualized Experiments. Następnie szczegółowo wyjaśnimy, jak przeprowadzać i analizować pomiary transferu energii rezonansowej FRET w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Aby wywnioskować kinetykę wiązania synaptycznego receptora limfocytów T z PMHC i wyjaśnić naszą strategię opartą na FRET zastosowaną w ogólnym podejściu, zaczynamy od struktury krystalicznej receptora limfocytów T (TCR), tutaj zaznaczonego na niebiesko, w momencie wiązania z antygenem, czyli cząsteczką MHC obciążoną peptydem (PMHC), pokazaną na żółto i czerwono. Wprowadzamy również jednoczynnikowy fragment domen zmiennych przeciwciała reaktywnego wobec łańcucha beta receptora limfocytów T, nazwanego AGE57. W celu przeprowadzenia ilościowych pomiarów opartych na FRET konieczne jest swoiste dla miejsca znakowanie zarówno donora FRET, w naszym przypadku fragmentu jednoczynnikowego, jak i akceptora FRET, czyli PMHC.

Jest to możliwe w przypadku białek rekombinowanych poprzez wprowadzenie nienaturalnej cysteiny, która może następnie zostać kowalencyjnie związana z koniugatami fluoroforów. Jak pokazano, do fragmentu jednoczyniącego przyłączamy donora FRET Alexa Fluor 555 lub Cy3, a do końca C-końcowego peptydu związanego z MHC akceptora FRET Alexa Fluor 647 lub Cy5.

Odległość Indy pokazana w tej strukturze kompozytowej wynosi około 41 angstrum, co jest wartością mniejszą nawet niż pierwszy promień, czyli odległość połowicznego maksymalnego transferu energii między dwoma barwnikami. W naszych eksperymentach wykorzystujemy płaskie dwuwarstwy lipidowe na podłożu szklanym jako substytuty komórek prezentujących antygen. Są one funkcjonalizowane PMXC, cząsteczką atory B71 oraz cząsteczką adhezyjną I chem 1.

W ten sposób obrazowanie może być przeprowadzone w trybie fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia, który oświetla fluorofory znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni styku, co znacznie redukuje tło komórkowe. FRET jest wykrywalny tylko wtedy, gdy TCR znakowane fragmentami jednołańcuchowymi wiążą pMHC osadzone w warstwie. Pozwala nam to zwizualizować wiązanie TCR-pMHC, a następnie obliczyć kinetykę wiązania w obecności prawidłowo sfałdowanego histogenu.

Fragmenty zewnątrzkomórkowe białek P71 oraz Ichem1 są oczyszczane z supernatantów kultur komórek owadziech zainfekowanych odpowiednim wirusem BUC. Oczyszczanie przeprowadzane jest w trzech etapach, zaczynając od chromatografii powinowactwa do niklu (Ni-NTA), a następnie chromatografii wymiany jonowej i wykluczania wielkościowego. Heterodimery MHC klasy II z znacznikiem His są ekspresowane w E. coli jako ciałka inkluzyjne, a następnie refoldowane in vitro w temperaturze 4 °C w obecności peptydu stabilizującego poprzez szybkie rozcieńczenie w buforze redoks.

Peptyd pełniący rolę wypełniacza zostanie później odszczepiony poprzez naświetlanie światłem UV. Prawidłowo sfałdowane kompleksy PMHC są oczyszczane i zagęszczane wraz z wypełniaczem. Peptyd jest odszczepiany i zastępowany peptydem fluorescencyjnym przy pH 5,2.

Produkt końcowy jest oczyszczony pod kątem wielkości. Fragment jednocułkowzy jest eksprymowany w postaci ciał inkluzyjnych w e coli z wolną cysteiną, a następnie refoldowany in vitro poprzez dializę stopniową i oczyszczany pod kątem wielkości. Następnie jest on znakowany za pomocą wolnej cysteiny barwnikiem sprzężonym z maleimidem i ponownie oczyszczany pod kątem wielkości.

Wszystkie białka rekombinowane są ostatecznie dializowane przeciwko PBS zawierającemu 50% glicerolu, zagęszczane do stężenia 1 mg białka na ml i przechowywane długoterminowo w temperaturze -20 °C. W celu pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia w limfocytach T, jako sposób na weryfikację potencjału stymulującego lipid blay, należy zastosować ratiometryczny barwnik URA two. Obciążone blasty limfocytów T należy inkubować z estrem URA 2:00 AM.

Związek ten wnika do komórek poprzez swój motyw AM, ale następnie zostaje w nich uwięziony w wyniku działania esteraz, które odszczepiają część AM. Dodaj fira 2:00 AM do około 3 milionów limfocytów T w końcowym stężeniu 5 µM na litr. Przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do nowej probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Przemyj komórki raz w buforze do obrazowania zawierającym roztwór soli w buforze Hanksa z dodatkiem wapnia i magnezu oraz 1% albuminy. W celu monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia użyj zautomatyzowanego systemu odwróconego mikroskopu z możliwością naświetlania UV. Rozpocznij protokół pomiaru czasu i dodaj co najmniej dwie załadowane limfocyty T do funkcjonalizowanej dwuwarstwy lipidowej umieszczonej w ognisku na stoliku mikroskopu, a następnie w regularnych odstępach czasu wykonaj obraz DIC oraz dwa obrazy fluorescencyjne wzbudzone światłem UV o długości fali 340 i 380 nm.

Bezpośrednio po nawiązaniu kontaktu z dwuwarstwą limfocyty T wykazują podwyższony poziom wapnia, co jest odczytywane przez stosunek URA dwa w 15. minucie pomiaru. Do komórek należy dodać przeciwciało blokujące, które nasyca wszystkie antygeny PMHC. W konsekwencji wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia spadają do wartości charakterystycznych dla stanu nieaktywnego, które służą później jako punkt odniesienia.

Gdy tylko poziomy obecnych przeciwciał blokujących spadną do wartości odzwierciedlającej stan nieaktywowany, którą normalizujemy do jedności dla pomiarów FRET, limfocyty T muszą zostać zabarwione sondą FRET w postaci jednoprzestronowego fragmentu przeciwciała reaktywnego wobec TCR. Dla każdego eksperymentu przenieś około 1 milion komórek do probówki i odwiruj je przy 400 g. Odlej medium i usuń pozostałe krople medium przylegające do wewnętrznych ścianek za pomocą ręcznika papierowego. Zapewnia to minimalną objętość inkubacji wynoszącą około 30 µL, o której wspomniałem wcześniej.

Sonda FRET jest przechowywana w stężeniu 1 mg/mL w 50% glicerolu w temperaturze -20 °C. Jest ona znakowana specyficznie w danej pozycji za pomocą Alexa Fluor 555 lub Alexa Fluor 647 w stosunku sonda:białko równym 1:1. Dodaj 0,3 µL sondy do komórek. Delikatnie i kilkukrotnie uderz w probówkę, aby rozbić osad, a następnie inkubuj komórki przez 20 minut w lodzie.

Przemyj komórki w lodowatym buforze do obrazowania. Powtórz tę procedurę płukania raz. Inkubacja, wirowanie oraz przechowywanie w niskiej temperaturze zapewniają, że limfocyty T nie internalizują fluorescencyjnej sondy podczas ekspozycji na nią.

Doprowadziłoby to do podwyższonej fluorescencji tła. Co więcej, limfocyty T nie tracą sondy w niskiej temperaturze podczas płukania i przechowywania przed umieszczeniem bielara z komorą na wymienniku stolika mikroskopu. Przy wymianie PBS na bufor do obrazowania należy za wszelką cenę unikać kontaktu dwuwarstwy z powietrzem, ponieważ doprowadziłoby to do jej zniszczenia.

Aby zmniejszyć tło komórkowe, stosujemy oświetlenie typu turf. W tym celu ustawiamy wiązkę wzbudzenia pod kątem krytycznym, przy którym zachodzi całkowite wewnętrzne odbicie. Wyłącz wzbudzenie, włącz światło szerokokątne, dodaj limfocyty T do komory ltec i pozwól im osiąść na warstwie lipidowej.

Włącz wzbudzenie i ustaw ostrość poza obszarem turf. Błona komórkowa jest widoczna jako pierścień wzdłuż osi optycznej w każdej płaszczyźnie ogniskowania; w obszarze turf widoczna jest jedynie błona podstawna w kontakcie z dwuwarstwą. Płaszczyzny ogniskowania powyżej nie są już wzbudzane, a w konsekwencji nie są widoczne.

Protokół czasowy rozpoczyna się od czerwonego i zielonego impulsu wzbudzenia w celu obrazowania PMHC i TCR, po których następuje czerwony impuls wybielający w celu ablacji akceptora P-M-H-C-F. Zielony impuls do obrazowania TCR po wybieleniu akceptora F oraz czerwony impuls do weryfikacji ablacji akceptora F są wykonywane w skali poniżej sekundy, z jak najkrótszą przerwą między pierwszym a drugim impulsem zielonym. Opcjonalnie, na początku można uzyskać obraz DIC; rozdzielenie obrazu dwukolorowego umożliwia jednoczesną detekcję kanału donora i akceptora.

Ekscytacja akceptora wykazuje akumulację p MHC w synapsie limfocytów T. Ten obraz wstępny potwierdza obecność p MHC i wskazuje na już zachodzące wiązanie p MHC pośredniczone przez TCR. Ekscytacja donora generuje obrazy w obu kanałach.

Sygnał z kanału donora FRET jest w pewnym stopniu zredukowany pod względem intensywności ze względu na przekaz energii do kanału akceptora FRET. Sygnał z kanału akceptora FRET składa się z przenikania sygnału (bleed-through) donora FRET oraz wzbudzenia krzyżowego akceptora FRET. Niemniej jednak, obraz ten nie zostanie wykorzystany do analizy.

W niniejszym protokole następuje szybkie wybielanie, które eliminuje wszystkie zaakceptowane siły fluoro-F. Intensywność obrazu donora F Fed po dopuszczalnym wybielaniu FRET zostaje teraz przywrócona do wyższych poziomów bez utraty intensywności w kanale fre.

Następująca analiza akceptora FRET weryfikuje całkowite wybielenie akceptora F. Przybliżmy widok synapsy, aby określić stopień regeneracji donora FRET. Należy wyznaczyć średnią intensywność tła, która pozostaje stała niezależnie od akceptora FRET.

Następnie przeprowadź fotowybielanie, a potem wyznacz średnią intensywność synapsy oraz reprezentatywnego klastra TCR. Wydajność FRET oblicza się poprzez normalizację różnicy przed i po ablacji akceptora F. W naszym przykładzie zmierzono 16% FRET dla całej synapsy i 26% FRET dla reprezentatywnego klastra.

Wydajności FRET klastrów TCR zostaną później przekonwertowane na stopień zajętości TCR, co pozwoli na uzyskanie dwuwymiarowych danych jednocząsteczkowych dotyczących stałej dysocjacji synaptycznej. Służy to wyznaczeniu kinetyki wiązania TCR z peptydem MHC w synapsie dla jednocząsteczkowych eksperymentów FRET. Stosujemy te same odczynniki i strategię etykietowania co poprzednio.

Aby jednak upewnić się, że rzeczywiście obserwujemy oddziaływanie między pojedynczym TCR a pojedynczym kompleksem peptyd-MHC, zdecydowaliśmy się spełnić następujące kryterium. Zdarzenie kandydujące na pojedynczą cząsteczkową FRET musi współwystępować z pojedynczym akceptorem FRET lub pojedynczą cząsteczką donora FRET. W tym przypadku wykorzystujemy pojedynczy pMHC jako cząsteczkę akceptora FRET, aby zweryfikować jednocząsteczkowy charakter obserwowanego zdarzenia FRET, stosując analogiczne rozumowanie w odwrotnym przypadku.

Wykorzystanie akceptorów w kanałach wyższych oraz donorów w kanałach niższych jest jak najbardziej możliwe. Zazwyczaj poddajemy limfocyty T w kontakcie ze stymulującą warstwą lipidową wzbudzeniu światłem o długości 514 i 647 nm; sekwencyjne i powtarzalne wzbudzanie donora i akceptora z minimalnym opóźnieniem wynoszącym 1 ms jest poprzedzone czasem oczekiwania, który może być zmieniany w zależności od wymagań eksperymentu.

Aby uzyskać wystarczająco silny sygnał fluorescencyjny dla detekcji pojedynczego barwnika w ciągu milisekund od wzbudzenia, konieczne jest zastosowanie wysokich gęstości mocy wzbudzenia w zakresie od 1 do 5 kW/cm². Ze względu na fotobleaching liczba widocznych cząsteczek akceptora FRET PMHC szybko spada do poziomu, w którym pojedyncze siły fluoroakceptora FRET stają się rozróżnialne w dwuwarstwie zawierającej 30 lub więcej znakowanych PMCS na µm². Przykład pokazano tutaj dla całkowitego opóźnienia czasowego wynoszącego 42 ms.

Pojedyncze zdarzenie FRET oznaczone czerwonym okręgiem staje się widoczne w drugim i trzecim punkcie czasowym. Współlokalizuje się ono z pojedynczą cząsteczką S pięć oznaczoną zielonym okręgiem. W tym przykładzie obserwowalne zdarzenie FRET ma długość śladu równą dwóm; należy zebrać więcej śladów FRET dla pojedynczych cząsteczek, jak pokazano w tabeli w niektórych 128 śladach.

Następnie oblicz komplementarną sumę skumulowaną śladów, zgodnie z zielonymi liczbami, znormalizuj je, przedstaw znormalizowane wartości na wykresie i dopasuj do nich funkcję monoeksponencjalną. Wartość oczekiwana wynosi nieco ponad 1,5 ramki czasowej. Wartość ta zależy od peptydy TCR, wiązania MHC oraz fotoblaknięcia; aby móc odróżnić te dwa wkłady, wartość oczekiwaną należy obliczyć dla co najmniej trzech różnych czasów.

Następnie nanieście na wykres wszystkie wartości oczekiwane w funkcji odpowiednich opóźnień czasowych i dopasujcie punkty danych do przedstawionej funkcji zawierającej czas życia, który wynosi tutaj 2,12 s oraz wartość oczekiwaną dla fotobleachingu f Fred. Odzyskiwanie donora po akceptowalnym fotobleachingu, jak pokazano tutaj i wcześniej w większych szczegółach, może zostać wykorzystane do wyznaczenia w kilku prostych krokach dwuwymiarowych stałych dysocjacji, jakie występują w obrębie synapsy immunologicznej.

W niniejszej analizie skupiamy się na zaangażowaniu TCR oraz klastrach TCR, w których wiązanie T-C-R-P-M-H-C jest najbardziej wyraźne. Jak wynika z przedstawionych pomiarów, wartości F FRED znacząco się różnią dla poszczególnych klastrów TCR.

Pomnożenie F fred przez współczynnik proporcjonalności C pozwala wyznaczyć stopień zajętości TCR, A – termin opisujący stosunek liczby TCR związanych z pMHC do ich całkowitej liczby. Współczynnik C musi zostać wyznaczony raz dla konkretnego zestawu par fre oraz zastosowanego systemu FRE. Pod koniec tej prezentacji wyjaśnimy szczegółowo, jak wyznaczyć C, na przykład przy użyciu SI three i SI five umieszczonych specyficznie na fragmencie przeciwciała jednoprzestronowego reaktywnego TCR R oraz na C-końcu peptydu związanego z MHC. Wynosi on około dwóch synaptycznych, dwuwymiarowych stałych dysocjacji, które można obliczyć na podstawie stopnia zajętości TCR określanego jako A oraz początkowej gęstości pMHC obecnych na błonie lipidowej.

Przedstawiona zależność wynika z prawa działania mas i jest wyjaśniona szczegółowo w artykule towarzyszącym temu filmowi. W naszym przykładzie początkowa gęstość pmcs wynosi 30 cząsteczek na mikrometr kwadratowy. Otrzymujemy rozkład 2D kds, które są efektywne w synapsie limfocytów T, z wartością mediany wynoszącą około 34 cząsteczek na mikrometr kwadratowy.

Rozkład stałej on można obliczyć z synaptycznego dwuwymiarowego rozkładu KD oraz odpowiadającej mu stałej off, która wynosi tutaj 0,41 s⁻¹, co określono za pomocą analizy śladów FRET pojedynczych cząsteczek w temperaturze 24 °C. Wartość mediany wynosi około 0,01 µm²/(cząsteczka·s). Podsumowując, pomiary FRET między TCR a pMHC umożliwiają kompleksową analizę wszystkich parametrów kinetycznych opisujących dynamikę reakcji w C2.

Niniejszą metodologię można w zasadzie uogólnić na analizę innych oddziaływań receptor-ligand, które mogą odgrywać kluczową rolę w rozpoznawaniu międzykomórkowym. Na koniec omówimy, jak eksperymentalnie wyznaczyć stałą C, która jest niezbędna do przeliczenia wydajności FRET na stopień zajętości TCR. Procedurę tę należy przeprowadzić tylko raz.

Wyznaczoną stałą C można następnie wykorzystać we wszystkich kolejnych eksperymentach, w których zastosowano ten sam układ FRET z tymi samymi fluoroforami. W tej procedurze w zasadzie odnieśliśmy wydajność FRET mierzoną w poszczególnych klastrach TCR poprzez odzyskiwanie donora po fotowybieleniu akceptora do odpowiadających im wartości intensywności wykrytych w sensybilizowanym kanale FRET. Jak omówiono wcześniej, wydajność FRET jest wyznaczana z obrazów kanału donora FRET z korektą tła przed i po ablacji akceptora FRET.

Skalibrowany kanał FRET musi być wyrównany z kanałem donora F oraz osiami X i Y i skorygowany o tło. Przedstawiono tutaj prześwit donora FRET (bleed through) oraz wzajemną ekscytację akceptora FRET (cross excitation). Szczegółowy opis sposobu korekty prześwitu donora FRET i wzajemnej ekscytacji akceptora FRET znajduje się w artykule.

W nawiązaniu do tego filmu, należy teraz obliczyć dla każdego klastra TCR stosunek sygnału błędu obrazu FRET po korekcie do odpowiadającego mu skorygowanego obrazu donora FRET. Należy wyznaczyć skorygowany średni sygnał dla pojedynczych donorów FRET oraz pojedynczych zdarzeń FRET cząsteczkowych, a następnie obliczyć ich stosunek. Stopień zajętości TCR wyznacza się poprzez pomnożenie obu tych stosunków.

Następnie należy nanieść na wykres wydajności FRET wyznaczone dla poszczególnych klastrów TCR w funkcji ich stopnia zajętości TCR. Wartość C jest następnie wyznaczana za pomocą regresji liniowej, jak pokazano tutaj. W naszym przykładzie wynosi ona w przybliżeniu dwa.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo potrafić wykorzystać funkcjonalizowaną białkami dwuwarstwę lipidową w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią pojedynczych cząsteczek do pomiaru kinetyki wiązania synaptycznego pomiędzy PMHC a TCR. Omówiono wszystkie niezbędne etapy, w tym produkcję białek, znakowanie limfocytów T oraz końcowe pomiary FRET. Ponadto szczegółowo zaprezentowano analizę obrazów, pozwalającą na uzyskanie krzywych aktywacji limfocytów T oraz wartości FRET.

Na koniec przedstawiono metodologię stanowiącą podstawę wyznaczania kinetycznych stałych asocjacji i dysocjacji. Analogiczne podejście może w zasadzie zostać wykorzystane do badania innych oddziaływań ligandów z receptorami synaptycznymi, choć konieczne może okazać się wprowadzenie odpowiednich modyfikacji.