Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar odporności na obróbkę termochemiczną i hydrolizę enzymatyczną w różnych wariantach pokrewnej biomasy. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie próbek biomasy do badań poprzez dopasowanie rozmiaru, redukcję oraz ekstrakcję skrobi i cukrów rozpuszczalnych. Drugim krokiem jest precyzyjne dozowanie biomasy do wysokoprzepustowych płytek reaktorowych, kompatybilnych z obróbką termochemiczną.

Próbki są poddawane obróbce wstępnej w reaktorze parowym. Następnie próbki są trawione standardową komercyjną celulazą przez trzy dni w celu hydrolizy celulozy i hemicelulozy. Ostatnim etapem jest oznaczenie glukozy i ksylozy uwolnionych podczas hydrolizy enzymatycznej z wykorzystaniem testów GO pod i XDH.

Ostatecznie wysokoprzepustowe oznaczanie ilości glukozy i ksylozy jest wykorzystywane do określenia względnego uwalniania cukrów pomiędzy próbkami w przeliczeniu na gram cukru na gram biomasy początkowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami w skali laboratoryjnej, takimi jak laboratoryjna obróbka wstępna i hydroliza enzymatyczna, jest możliwość jednoczesnego przeprowadzenia analizy setek, a nawet tysięcy próbek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu konwersji biomasy, takie jak to, które odmiany lub warianty są bardziej podatne na konwersję do cukrów i produktów pochodnych.

Zatem implikacje tej techniki można rozszerzyć na zrozumienie struktury i funkcji ściany komórkowej, ponieważ mutacje generowane w szlaku biosyntezy ściany komórkowej mogą być przesiewowo badane pod kątem zmian chemicznych w strukturze. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat oporności ściany komórkowej roślin. Można ją również zastosować do innych komponentów konwersji biomasy, takich jak badania aktywności enzymatycznej i synergii.

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ wymaga ona pracy z dużymi zestawami próbek wariantów biomasy, które muszą być traktowane identycznie i jednocześnie w skali miligramowej. W związku z tym niezbędne jest zastosowanie specjalistycznej robotyki i sprzętu. Aby rozpocząć procedurę, odważ około 250 mg uprzednio zmielonej biomasy z zakodowanej kreskowo torebki antystatycznej do ponumerowanej torebki do herbaty, a następnie ostrożnie zwiń torebkę, upewniając się, że końce są zagięte nad biomasą, aby zapobiec jej utracie podczas skrobiowania i ekstrakcji. Następnie zamknij każdą torebkę, owijając ją miedzianym drutem powlekanym cyną, i zapisz numer torebki dla każdej próbki z kodem kreskowym.

Do plastikowego pojemnika należy wlać 500 milliliters wcześniej przygotowanego roztworu enzymu odskrobiującego. Następnie, w celu przeprowadzenia protokołu partiami, do enzymatycznego roztworu buforowego dodaje się 120 torebek herbaty. Po inkubacji w wytrząsarce biomasę należy przepłukać i moczyć w kilku litrach wody dejonizowanej przez 30 minut, po uprzednim dokładnym wypłukaniu odskrobionej biomasy.

Aby usunąć sole buforowe, należy umieścić torebki z herbatą w kolumnie z tkaniną (sock lit) w celu ekstrakcji. Należy przygotować układ refluksu z tkaniną, używając 95% ethanol, i prowadzić ekstrakcję próbek przez 24 godziny. Po zakończeniu ekstrakcji należy rozwinąć torebki i przenieść wysuszoną biomasę do oryginalnych probówek z kodem kreskowym.

Workow antystatyczne. Przenieś co najmniej 50 milligrams wysuszonej biomasy do zakodowanego kodem kreskowym zasobnika. Zeskanuj kody kreskowe worków antystatycznych oraz zasobnika odbiorczego, aby zapewnić dokładne śledzenie próbek. Po załadowaniu zasobników do robota wagowego, odważ robotycznie pięć milligrams wysuszonych próbek do kwasoodpornej stali nierdzewnej.

Na płytki 96-dołkowe odważ trzy powtórzenia każdej próbki, rozmieszczając je na płytce w sposób minimalizujący wszelkie lokalne różnice. Następnie do każdego dołka dodaj 250 µL wody dejonizowanej i uszczelnij płytki taśmą z politetrafluoroetylenu (PTFE) z klejem silikonowym. Za pomocą grotu lutownicy o średnicy 1/8 cala przebij taśmę PTFE w każdym porcie pary.

Każdą płytkę należy mocno zacisnąć, stosując uszczelki z PTFE wzmocnionego szkłem o grubości 0,031 cala pomiędzy płytkami oraz puste płytki na górze i na dole stosu. Próbki należy poddać obróbce wstępnej w reaktorze parowym ustawionym na 180 °C przez 17,5 minuty. Po zakończeniu procesu płytki reaktora należy schłodzić do 50 °C poprzez zalanie wodą dejonizowaną.

Po ostygnięciu płytek należy odwirować je w wirówce z koszykami wahadłowymi. Wirować przy 1700 GS przez 20 minut. Następnie usunąć folię zabezpieczającą wierzch.

Do każdego dołka należy dodać 40 µL wcześniej przygotowanego 8% roztworu zapasu enzymu. Po ponownym uszczelnieniu taśmą PTFE, zamkniętą płytkę należy umieścić w magnetycznym uchwycie do płytek. Próbki należy delikatnie wymieszać poprzez odwrócenie płytki co najmniej 15 razy, a następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 70 godzin. Po inkubacji płytki reakcyjne są mieszane i wirowane.

Następnie robot do obsługi cieczy jest wykorzystywany do przeprowadzenia oznaczania ilościowego glukozy i ksylozy za pomocą enzymatycznych testów kolorymetrycznych: dehydrogenazy ksylozowej (XDH) dla ksylozy oraz oksydazy glukozowej i peroksydazy (GO POD) dla glukozy. Na platformie robota rozmieszczone są zbiorniki z odczynnikami GO POD i XDH, woda do rozcieńczeń oraz statywy z 96-kanałowymi końcówkami 200 µL dla każdego odczynnika. Końcówki te są wykorzystywane wielokrotnie dla wielu płytek reaktora.

Na pokładzie znajdują się również jednorazowe końcówki o pojemności 200 µL do usuwania wody i przygotowywania wzorców cukrów, a także gotowe wzorce cukrów. Z karuzeli magazynującej robot pobiera trzy przezroczyste płytki mikrotitracyjne w fiolkach do HPLC: jedną do rozcieńczania mieszaniny hydrolizy oraz po jednej do analiz XDH i GoPod. Chwytak przenosi wszystkie cztery płytki na odpowiednie pozycje na pokładzie.

Jednorazowe końcówki 96-kanałowe o pojemności 100 µL są pobierane z karuzeli na pokład w celu przenoszenia próbek z reaktora na płytkę rozcieńczeń oraz z płytki rozcieńczeń na płytki XDH i go pod. Za pomocą 8-kanałowej pipety o zmiennej objętości usuwa się wodę dodaną przed wstępną obróbką z trzech dołków w każdym narożniku płytki reaktora, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej na płytce rozcieńczeń. Te 12 dołków jest wykorzystywanych do standardów cukrów przy użyciu 96-kanałowej głowicy pipetującej.

Po usunięciu trzech końcówek z każdego rogu, do dołków płytki rozcieńczającej dodaje się 180 µL wody. Po wymianie końcówek, odczynniki XD, H oraz go pod przenosi się z odpowiednich zbiorników do odpowiednich płytek testowych, używając 96-kanałowej głowicy pipetującej.

W tym czasie standardy cukrów są dodawane do trzech studzienek w każdym rogu płytki rozcieńczającej. Po zmianie na mniejsze końcówki, za pomocą ośmiokanałowej głowicy pipetującej, wykorzystuje się 96-kanałową głowicę pipetującą do przeniesienia 20 µL supernatantu z hydrolizy na płytkę rozcieńczającą, a następnie płytka jest mieszana poprzez potrząsanie. Próbkę należy aspirować z górnej części cieczy, aby ograniczyć zanieczyszczenie końcówek cząstkami biomasy.

Po wymieszaniu kolejno przenosi się 20 µL. Przy użyciu 96-kanałowej głowicy pipetujących do płytek XDH i go pod. Każda z nich jest mieszana przez trier, końcówki z próbkami, reaktor oraz płytki rozcieńczające są przenoszone do racka na odpady w karuzeli, a płytki XDH i go pod przenosi się do osobnego racka w karuzeli i pozostawia na jedną godzinę przed odczytem w spektrofotometrze, używając czytnika płytek 96-dołkowych w zakresie ultrafiolet i widzialnym.

Ustaw zmierzoną długość fali na 510 nanometrów i zmierz absorbancję w stosunku do ślepej próby odczynników. Następnie ustaw zmierzoną długość fali w czytniku płytek na 340 nanometrów i zmierz absorbancję, używając małej szpatułki. Odważ około czterech miligramów przygotowanej biomasy do stalowego naczynia o pojemności 80 mikrolitrów, przeznaczonego do autopodajnika spektrometru mas.

Za pomocą standardowego dziurkacza ręcznie przygotuj szklane dyski filtrujące z arkuszy włókna szklanego typu ad bez lepiszcza. Za pomocą pęsety załaduj próbki do statywów automatycznego próbnika, rozmieszczając je w kubeczkach w sposób losowy, aby uniknąć błędu wynikającego z dryfu spektrometru w czasie. Po przeprowadzeniu kalibracji i wprowadzeniu odpowiednich parametrów do spektrometru mas, rozpocznij akwizycję danych i odczekaj co najmniej 60 sekund, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do zebrania widm tła. Na koniec uruchom zautomatyzowaną metodę automatycznego próbnika, stosując przepływ gazu nośnego helu o wartości 0,9 liters per minute.

Przykładem trendów jest badanie oporności 755 naturalnych wariantów topoli pobranych w regionie Pacyficznego Północnego Zachodu. Wyniki wskazują, że wraz ze wzrostem stosunku strzykawki do guil, oporność maleje do momentu osiągnięcia stosunku wynoszącego około dwóch, po czym poziom poprawy oporności stabilizuje się. W tym miejscu widoczne są wartości odstające, w których gen PT four CL one był wyciszony.

W przypadku topoli, spośród przesiewanych setek odmian, w kilku z nich wyraźnie odnotowano wzrost ilości frakcji recalcytrantnych, o czym świadczy zmniejszone uwalnianie cukrów. Różne odmiany słomy pszennej, uprawiane w kilku lokalizacjach i zbierane przy zróżnicowanych warunkach wzrostu, pozwoliły na wyodrębnienie 20 odrębnych populacji na podstawie kombinacji powyższych zmiennych. Zbiory próbek te są łatwo rozróżnialne i wskazują na zmienne dodatnie oraz ujemne.

W przypadku pirolizy materiałów opornych można zastosować spektrometrię mas wiązki molekularnej w celu oceny zmian w składzie ściany komórkowej. Fragmenty widma masowego przypisuje się różnym monomerom ligniny. Przy porównaniu próbki o wysokiej zawartości ligniny z próbką o wysokiej zawartości węglowodanów rozbieżności w danych spektralnych są wyraźne.

W niniejszym materiale przedstawiono zastosowanie danych z spektrometrii mas w połączeniu z analizą głównych składowych. Wykres obciążeń głównych składowych może pomóc w zidentyfikowaniu cech chemicznych wyjaśniających klasyfikację na wykresie wyników, a także w wyjaśnieniu, które cechy ulegają zmianie pomiędzy klastrami próbek. Po opanowaniu ta technika, przy prawidłowym wykonaniu, może być wykorzystywana do przesiewania tysięcy próbek tygodniowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zachowanie maksymalnej spójności i porównywanie próbek wyłącznie w obrębie powiązanego zestawu.

W związku z tym, po opracowaniu, technika ta utorowała drogę innym badaczom do pracy nad metodami wysokoprzepustowego przesiewania oraz innymi obszarami dotyczącymi oporności ścian komórkowych roślin, z wykorzystaniem m.in. cieczy jonowych i obróbki wstępnej w środowisku alkalicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak prawidłowo przygotowywać, przetwarzać i analizować duże zestawy próbek biomasy w skali mikro pod kątem różnic w oporności, stosując redukcję rozmiaru i ekstrakcję, obróbkę termochemiczną oraz hydrolizę enzymatyczną. Prosimy pamiętać, że praca z wysokim ciśnieniem, parą oraz zautomatyzowanym sprzętem jest niezwykle niebezpieczna i należy podjąć wszelkie środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony indywidualnej oraz zapewnienie działania blokad bezpieczeństwa we wszystkich urządzeniach podczas wykonywania tych procedur.