Name: Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą MALDI-TOF MS i sekwencjonowania genu 16S rRNA. Ta metoda umożliwia szybką diagnostykę mikrobiologiczną w laboratorium klinicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Enno Jacobsowi za jego nieustające wsparcie.

1. Ekstrakcja DNA bakterii
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu PBS
	<ol>
		<li>Odważyć 1,65 g Na2HPO4 x 2H2O, 0,22 g NaH2PO4 x 2H2O i 8,80 g NaCl w kolbie i napełnić wodą destylowaną do końcowej objętości 1 000 ml. Doprowadzić pH do 7,4. Do końcowego użycia przefiltrować roztwór przez filtr odporny na bakterie (0,22 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA bakterii Gram-ujemnych
	<ol>
		<li>Umieść materiał pacjenta na odpowiednich pożywkach hodowlanych (np. agarze z krwią Columbia), zidentyfikuj i wyizoluj potencjalne patogeny.</li>
		<li>Przygotować czystą kulturę i przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu określenia morfotypu i potwierdzenia czystości kultury 49.</li>
		<li>Wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną i przenieść ją za pomocą 1 μl jednorazowej pętli inokulacyjnej do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml, która zawiera 1 ml roztworu PBS.</li>
		<li>Zawiesinę tę inkubować w termomieszalniku w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Po inkubacji pozostawić ekstrakt bakteryjny (zawierający rozpuszczone DNA) do ostygnięcia do temperatury pokojowej i użyć go bezpośrednio do amplifikacji lub przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia (ryc. 1a).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA bakterii Gram-dodatnich
	<ol>
		<li>Umieść materiał pacjenta na odpowiednich pożywkach hodowlanych (np. Columbia), zidentyfikuj i wyizoluj potencjalne patogeny. Wykonaj barwienie metodą Grama w celu potwierdzenia morfotypu kultury.</li>
		<li>Przygotować czystą kulturę i przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu określenia morfotypu i potwierdzenia czystości kultury.</li>
		<li>Wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną ze sterylną pętlą inokulacyjną o pojemności 1 μl i zawiesić ją w roztworze 500 μl PBS w probówce reakcyjnej o pojemności 2,0 ml.</li>
		<li>Dodać 500 μl szklanych kulek i przenieść probówkę do homogenizatora oscylacyjnego, pracującego z maksymalną częstotliwością i amplitudą (50 Hz), na 5 minut. Użyj szklanych kulek o średnicy 1,0 mm, aby rozbić ściany komórkowe bakterii.</li>
		<li>Inkubować tę probówkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C i schłodzić do temperatury pokojowej. Ekstrakt należy stosować bezpośrednio do reakcji PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 16S rDNA PCR
<ol>
	<li>Przygotowanie podkładów wzmacniających
	<ol>
		<li>Użyj starterów TPU1 (5'-AGA, GTT, TGA, TCM, TGG, CTC, AG-3' [M = A/C]) jako startera do przodu i RTU4 (5'-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3') jako startera odwrotnego 25. Przygotować roztwór podstawowy startera z wodą wolną od DNAzy i RNAzy o stężeniu 100 pmol/μl (100 μM) i rozcieńczyć go dalej do roztworu roboczego o stężeniu 10 pmol/μl. Przechowywać podkład i roztwór roboczy w temperaturze -20 °C lub użyć bezpośrednio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR
	<ol>
		<li>Odpipetować 1 μl każdego startera, 1 μl dNTP-mix (100 mM), 2,5 μl ekstraktu DNA, 5 μl 10x buforu PCR (zawierającego 25 mM MgCl2), 0,25 μl polimerazy Taq (5 jednostek/μl) i 39,25 μl wody PCR wolnej od DNA i RNAse do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 200 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół PCR
	<ol>
		<li>Uruchom program PCR zbudowany w następujący sposób: Najpierw wstępny etap inkubacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut, który jest niezbędny do aktywacji polimerazy Taq. Po drugie, 35 cykli amplifikacji, zawierających 1-minutowy etap denaturacji w temperaturze 95 °C, 1-minutowy etap wyżarzania podkładu w temperaturze 50 °C i 1,5-minutowy etap przedłużania podkładu w temperaturze 72 °C. Po trzecie, końcowe przedłużenie trwające 10 minut w temperaturze 72 °C. Na koniec reakcja PCR jest schładzana do 4 °C. 
		UWAGA: Staphylococcus aureus iH2Osłużą jako kontrola pozytywna i negatywna (ryc. 1b).</li>
		<li>Umieść probówkę z mieszanką reakcyjną PCR w termocyklerze i uruchom program.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie produktu PCR 
	UWAGA: W celu oczyszczenia produktu PCR można zastosować kilka protokołów, opartych na enzymach lub z matrycą adsorpcji krzemionki. Zastosowane tutaj jednoetapowe oczyszczanie PCR wykorzystuje dwie hydrolityczne reakcje enzymatyczne. Podczas gdy egzonukleaza I (Exo I) usuwa jednoniciowe DNA, fosfataza alkaliczna krewetek (SAP) hydrolizuje nieinkorporowane dNTP. Druga procedura opiera się na technice adsorpcji membrany krzemionkowej z cyklem szybkiego wiązania - mycia - elucji o wysokiej zawartości soli.
	<ol>
		<li>Dodać 1,5 μl mieszaniny enzymatycznej zawierającej zarówno Exo I, jak i SAP do 25 μl produktu PCR, dokładnie wymieszać i przenieść do termocyklera, stosując prosty protokół, zgodnie z którym najpierw 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie 15 minut w temperaturze 80 °C. Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub użyć go bezpośrednio jako celu do znakowania PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroforeza w żelu agarozowym DNA
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do elektroforezy (bufor TBE)
	<ol>
		<li>Miareczkować 54,0 g (445 mM) zasady TRIS, 27,5 g (445 mM) kwasu borowego i 20 ml 0,5 M roztworu EDTA (10 mM) o pH 8,0 z NaOH w kolbie i napełnić ją wodą destylowaną do całkowitej objętości 1000 ml. Następnie rozcieńczyć ten 5x bufor 1:10 wodą destylowaną (0,5x TBE) do elektroforezy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora załadowczego
	<ol>
		<li>Zmieszać 250 mg błękitu bromofenolowego, 250 mg ksylenu cyjanolu FF i 15 g polisacharozy (tabela materiałów) w kolbie. Następnie napełnij go 0,5x buforem TBE do całkowitej objętości 100 ml. Barwnik nasycający rozdzielić na porcje o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlewanie żelu agarozowego
	<ol>
		<li>Odważyć 6 g agarozy wzorcowej do elektroforezy na 300 ml 0,5 x buforu TBE (patrz sekcja 3.1.1) w kolbie, aby przygotować 2% (m/v) żel agarozowy. Następnie włóż mieszaninę agarozy do kuchenki mikrofalowej, podgrzej ją do temperatury bliskiej, aż agaroza całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Pozostawić stopioną agarozę do odpowiedniego ostygnięcia i dodać 10 μl 1% (w/v) roztworu podstawowego bromku etydyny. Wlej roztwór do odlewu i umieść grzebień żelowy (pozwalając na 30 dołków) w gipsie. Wyjmij grzebień, gdy żel całkowicie zastygnie i włóż żel do komory elektroforetycznej zawierającej 0,5x bufor TBE. 
		UWAGA: Bromek etydyny jest toksyczny i mutagenny. Dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Wskazane jest używanie rękawic nitrylowych. Istnieją alternatywne interkalacyjne barwniki kwasów nukleinowych, które można stosować jako nietoksyczną alternatywę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza w żelu agarozowym produktów PCR 
	UWAGA: W celu sprawdzenia prawidłowej wielkości amplikonów PCR i oszacowania stężenia DNA, oczyszczony produkt PCR rozdziela się w żelu agarozowym.
	<ol>
		<li>Odpipetować 2 μl buforu ładującego do probówki reakcyjnej PCR i dodać 8 μl produktu PCR. Odpipetować tę mieszaninę do dołków żelu. Dodać 8 μl markera wielkości cząsteczkowej (drabinki DNA) do oddzielnego dołka, aby oszacować wielkość produktu PCR.</li>
		<li>Zastosować stałe napięcie 10 V/cm i przerwać elektroforezę, gdy tylko niebieski marker bromofenolowy osiągnie około 3/4 całkowitej długości żelu. Wizualizacja oddzielonych fragmentów PCR za pomocą transiluminatora UV (długość fali 302 nm) i udokumentowanie ich za pomocą systemu dokumentacji żelowej. Oszacuj ilość DNA przez wizualne porównanie z drabiną DNA. Użyj około 10 ng jako celu do etykietowania PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie Sangera
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie cyklu PCR 
	UWAGA: Wykonaj znakowanie PCR w reakcji 10 μl przy użyciu zestawu handlowego (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl 5x mastermixu reakcyjnego, 2 μl preparatu DNA, 1,5 μl roztworu roboczego TPU1 lub RTU4 (10 pmol/μl) i 4,5 μl wody wolnej od DNAzy i RNAzy.</li>
		<li>Umieść tę mieszankę reakcji sekwencjonowania w termocyklerze i uruchom kolejny PCR. W sumie proces składa się z 25 cykli składających się z etapu denaturacji (96 °C, 10 sekund), etapu wyżarzania (45-60 °C, 5 sekund) i etapu przedłużania (60 °C, 2 min). Na koniec schłodzić reakcję do temperatury 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie reakcji sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Oczyść mieszaninę reakcyjną znakowania za pomocą komercyjnych kolumn wirowych do oczyszczania PCR (tabela materiałów).</li>
		<li>Załadować 10 μl reakcji sekwencjonowania na wstępnie uwodnioną matrycę do filtracji żelowej i przeprowadzić etap wirowania przy 750 x g przez 3 min. 
		UWAGA: Dzięki zastosowaniu tej procedury nieinkorporowane terminatory barwnika są zatrzymywane w matrycy żelowej.</li>
		<li>Następnie wysuszyć wodny eluat w koncentratorze próżniowym. Wirować przy 2.500 x g przez 20 do 30 minut w temperaturze 40 °C aż do całkowitego wyschnięcia.</li>
		<li>Dodać 10 μl wysoce zdejonizowanego formamidu, następnie denaturować w temperaturze 90 °C przez 2 minuty i schłodzić mieszaninę na lodzie. Pobrać pipetą 10 μl zdenaturowanych próbek na 96-dołkową płytkę μl. Wysuszony i oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli analiza ma być przeprowadzona w późniejszym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie genu 16S rRNA i analiza sekwencji DNA 
	UWAGA: Wykonaj analizę sekwencji na automatycznym sekwencerze (Tabela materiałów). Zastosowany tutaj sekwencer to zautomatyzowany system elektroforezy kapilarnej oparty na fluorescencji, który analizuje jednocześnie 4 próbki (50 cm 4-kapilarny układ) z ciekłym polimerem 67 (ryc. 1c).
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę do mikromiareczkowania w sekwencerze. Napisz przykładowy arkusz (zapis płyty) zgodnie z opisem w 2, zapisz go i rozpocznij sekwencjonowanie/analizę, postępując zgodnie z krokami podanymi w 1. 
		UWAGA: Czas trwania sekwencji wynosi 2 godziny i dostarcza danych od 800 do 1 000 pz.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy sekwencjonowania (Tabela materiałów). Dane sekwencji są podawane w postaci pliku tekstowego (.seq) oraz pliku zawierającego elektroferogram wraz z wartościami jakości (QV) (.ab1). 
		UWAGA: Wywołanie bazy jest automatycznie wykonywane przez oprogramowanie do analizy sekwencjonowania, a podstawowy elektroferogram jest sprawdzany wizualnie (np. wysokość piku, separacja pików) przed wykorzystaniem sekwencji do dalszych zastosowań.</li>
		<li>Porównaj przechowywany plik sekwencji DNA z bazą danych NCBI nr za pomocą algorytmu BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. MALDI-TOF MS
UWAGA: Spektrometr mas wykorzystuje laser N2 o długości fali 337 nm i jest obsługiwany przez specjalne oprogramowanie sterujące (tabela materiałów). Widma są rejestrowane w trybie liniowym i obejmuje zakres mas od 2 000 do 20 000 Da. Interpretacja danych i przypisywanie punktów do próbek odbywa się w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania analitycznego (tabela materiałów) (rysunek 1d).
<ol>
	<li>Przygotowanie bakterii do analizy MS MALDI-TOF
	<ol>
		<li>Hoduj interesujące nas bakterie (np. Myroides odoratimimus) na agarze z krwią Columbia zawierającym 5% krwi końskiej w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin, w zależności od szczepu bakteryjnego (ryc. 2a). Przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu zweryfikowania morfotypu badanego organizmu, a także czystości kultury.</li>
		<li>Użyj drewnianej wykałaczki, aby przenieść pojedynczą kolonię bakterii do studzienki z 96-dołkową stalową tarczą (ryc. 2b i 2c). Umieścić 1 μl 70 % kwasu mrówkowego na wierzchu wysuszonego na powietrzu organizmu na stalowej tarczy i pozostawić do wyschnięcia na około 2-3 minuty.</li>
		<li>Następnie pokryć miejsce 1 μl roztworu matrycowego, zawierającego 50 mg/ml CHCA (kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy) w rozpuszczalniku organicznym (50% acetonitrylu, 2,5% kwasu trifluorooctowego, 47,5% H2O). 
		UWAGA: Metoda nakładania kwasem (metoda przygotowania płytki) może być stosowana w celu poprawy jakości widm masowych. Wykazano, że dla bakterii Gram-dodatnich taki "atak kwasem" zwiększa wartości punktowe mierzonych widm o 45, 
		UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system przygotowania próbki (tabela materiałów), w którym na rozmaz bakteryjny nakłada się bezkontaktowe plamki z 1 μl 70% roztworu kwasu mrówkowego, a po pierwszym cyklu suszenia 1 μl roztworu matrycowego. Próbki są następnie suszone w znormalizowanych warunkach przy wilgotności względnej 60% i są gotowe do użycia do analizy.</li>
		<li>Pozostaw rozmazany z matrycą nałożoną na powietrze do ponownego wyschnięcia przez około 5 minut w kapturze. Ten rozmaz bakteryjny po nałożeniu matrycy jest teraz stabilny przez wiele godzin. 
		UWAGA: Rozmazy bakteryjne bez matrycy mogą nie być stabilne z powodu degradacji białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie analizy MS MALDI-TOF
	<ol>
		<li>Wprowadzenie próbek
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie sterujące naszego mMIS (Tabela Materiałów).</li>
			<li>Napowietrzyć port ładowania próbki spektrometru masowego, naciskając przycisk IN/OUT przyrządu.</li>
			<li>Po kliknięciu otwórz port ładowania i włóż płytkę docelową MALDI-TOF MS z wysuszonym rozmazem bakteryjnym i matrycą.</li>
			<li>Zamknij port i ponownie się ewakuuj. Obserwuj podciśnienie, a gdy osiągnie 4,5 x 10-6 mbar, rozpocznij pomiar</li>.
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza próbki
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie analityczne naszego mMIS (Tabela materiałów) i kliknij menu "Plik". Wybierz "Nowa klasyfikacja", a otworzy się nowe okno "Kreator klasyfikacji w czasie rzeczywistym MALDI biotyper". Wpisz nazwę projektu, na przykład "Myroides measurement project_1", w polu "Nazwa projektu" i naciśnij przycisk "Nowy". W nowym oknie dialogowym o nazwie "Nowy projekt" sprawdź nazwę projektu i kontynuuj, naciskając przycisk "OK".</li>
			<li>W "Kreatorze klasyfikacji w czasie rzeczywistym biotyper MALDI" obserwuj, jak otwiera się okno "Umieszczanie analitu". Wybierz pozycje docelowe (np. A1, A2, A3...), kliknij prawym przyciskiem myszy dowolną zaznaczoną pozycję (oznaczoną niebieskim kwadratem) i wybierz "Dodaj próbki". W automatycznie otwieranym widoku tabeli wpisz nazwę próbki, identyfikator próbki i opcjonalnie komentarz. Kliknij przycisk "Dalej", aby kontynuować.</li>
			<li>W "Kreatorze klasyfikacji biotyper MALDI w czasie rzeczywistym" należy obserwować otwarte okno "Wybór metod biotyper MALDI". Wybierz "Taksonomia Bruker" z "MSP z drzew taksonomii" i kliknij "Dalej", aby kontynuować.</li>
			<li>W "Kreatorze klasyfikacji biotyper MALDI w czasie rzeczywistym" obserwuj otwarte okno "Podsumowanie projektu". Sprawdź wstawione wpisy podane powyżej, aby zapoznać się z rzeczywistym projektem klasyfikacji. Rozpocznij klasyfikację, naciskając przycisk "Zakończ" (Rysunek 2d-f). Pomiar rozpoczyna się automatycznie po osiągnięciu odpowiedniej próżni.</li>
			<li>Postępuj zgodnie z przebiegiem klasyfikacji, aż pomiar zostanie pomyślnie zakończony. Wyświetl tabelę wyników w project_1 pomiarowym "MALDI Biotyper Realtime Classification Project Myroides measurement ", otwórz menu "Widok" i kliknij "Wyniki".</li>
			<li>Wyświetl "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification Results" jako plik HTML w domyślnej przeglądarce internetowej. Wydrukuj i zapisz wyniki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Codziennie mierz wzorzec testowy przed analizą próbki, aby skalibrować przyrząd i przeprowadzaj walidację przyrządu co tydzień (autotest urządzenia). 
		UWAGA: Podczas pomiaru widma MALDI-TOF są analizowane w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie analityczne (Tabela materiałów). Podaje się listę dziesięciu gatunków wraz z ich odpowiednimi wynikami, która jest wprowadzana do systemu informacji laboratoryjnej (LIS) w celu sporządzenia raportu.</li>
		<li>Krytycznie ocenić wyniki MS MALDI-TOF (patrz reprezentatywne wyniki) i, w razie potrzeby, uwzględnić inne testy, takie jak profile wrażliwości biochemicznej i antybiotykowej lub sekwencjonowanie genu 16S rRNA i, jeśli to konieczne, barwienie metodą Grama w celu przypisania gatunku bakterii do raportu mikrobiologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zarówno sekwencjonowanie genów MALDI-TOF MS, jak i 16S rRNA daje możliwość identyfikacji dużej liczby różnych bakterii. MALDI-TOF MS to szybka i niedroga metoda, która jest łatwa w obsłudze i dostępna jest duża baza danych widm mas bakteryjnych. Z tego powodu MALDI-TOF MS jest szybką, opłacalną i niezawodną metodą przeprowadzania badań przesiewowych skoncentrowanych na rzadkich patogenach bakteryjnych 17,20,39,51. W prospektywnym badaniu porównującym MALDI-TOF MS z innymi metodami identyfikacji fenotypowej, Se...

Bezpieczna identyfikacja rzadkich patogenów w rutynowej diagnostyce jest utrudniona przez fakt, że klasyczne metody kulturowe i biochemiczne są kłopotliwe i czasami wątpliwe. Ponadto laboratorium mikrobiologiczne diagnostyczne musi przetwarzać dużą liczbę patogenów, od kilkuset do kilku tysięcy, dziennie, co wymaga zastosowania zautomatyzowanych systemów. Oprócz zarządzania wysoką dzienną przepustowością potrzebna jest precyzyjna identyfikacja gatunków bakterii. Jest to uzasadnione, ponieważ różnią się one wzorcem wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, a zatem prawidłowa identyfikacja dostarcza klinicystom niezbędnych informacji do wyboru odpowiednich antybiotyków (np. Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) Rozdział 12,43.
Zautomatyzowane systemy identyfikacji mikrobiologicznej (aMIS) stosują standardowe zestawy reakcji enzymatycznych do charakteryzowania właściwości metabolicznych izolatów bakteryjnych 13,15,16,26,27. Chociaż wkłady stosowane w tych systemach wykorzystują dużą liczbę różnych reakcji biochemicznych, np. 47 w karcie GN aMIS użytej w tym badaniu 52, strategia ta pozwala na bezpieczną identyfikację tylko dla ograniczonego zestawu bakterii. Co więcej, baza danych, będąca zaawansowanym systemem eksperckim, jest wyraźnie skoncentrowana na wykrywaniu istotnych i wysoce istotnych bakterii o znaczeniu medycznym 13,15,16,36. Dwa kolejne systemy, szeroko stosowane w laboratoriach, również stosują to biochemiczne podejście do identyfikacji bakterii. Ostatnie badania wykazują porównywalną dokładność identyfikacji między aMIS użytym w tym badaniu a jednym z konkurentów (odpowiednio 93,7% i 93,0%), podczas gdy 3. aMIS ma dokładność identyfikacji wynoszącą zaledwie 82,4% na poziomie gatunku 35. Rozbieżności te można wytłumaczyć jakością podstawowych odniesień do danych identyfikacyjnych, wersjami zestawów i oprogramowania, różnicami w metabolizmie i biegłości personelu technicznego 35,36.
Dwa zautomatyzowane systemy MS MALDI-TOF (system identyfikacji mikrobiologicznej MALDI-TOF, mMIS) są głównie używane. Systemy te pozwalają na wykrywanie dużej liczby gatunków bakterii na podstawie widm masowych ich odcisków palców białek. Na przykład baza danych użytego mMIS zawiera 6 000 widm referencyjnych. Systemy identyfikacji oparte na spektrometrii mas oferują szybkie i niezawodne wykrywanie szerokiej gamy mikroorganizmów, w tym rzadkich patogenów 11,48,51. Do tej pory dostępnych jest tylko kilka bezpośrednich porównań między mMIS zastosowanym w tym badaniu a jego konkurentem 19,33. Według Daeka i wsp. oba systemy zapewniają podobnie wysoki wskaźnik dokładności identyfikacji, ale mMIS zastosowany w tym badaniu wydaje się być bardziej wiarygodny w identyfikacji gatunków 19.
Podobnie, techniki molekularne dotyczące dobrze zachowanych, ale także odrębnych genów (np. 16S rDNA lub rpoB) pozwalają na jasną identyfikację gatunku 3,22,61. Wśród nich 16S rDNA jest najczęściej używanym genem porządkowym ze względu na jego obecność we wszystkich bakteriach 34. Jego funkcja pozostaje niezmieniona i wreszcie, przy około 1 500 pz, jest wystarczająco długi, aby nadawać się do bioinformatyki 14,34. Wielu badaczy uważa analizę genu 16S rRNA za "złoty standard" w identyfikacji bakterii 21. Wynika to z faktu, że do tej pory niewiele laboratoriów stosuje techniki hybrydyzacji DNA-DNA do identyfikacji rzadkich lub nowych bakterii 14,34. Dodatkowo dostępnych jest coraz więcej baz danych, które można wykorzystać do analizy genów 16S rRNA 50. Należy jednak wziąć pod uwagę, że systemy detekcji oparte na 16S rDNA mają ograniczoną czułość w porównaniu ze standardowymi protokołami PCR. Co więcej, podejście molekularne jest wyrafinowane, czasochłonne i wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu, a także dedykowanego zaplecza laboratoryjnego, a zatem nie jest łatwe do wdrożenia w rutynowej diagnostyce 55. Ponadto wykazano, że połączenie co najmniej dwóch różnych metod identyfikacji bakterii prowadzi do bardzo dokładnej identyfikacji szczepu. Połączenie sekwencjonowania MALDI-TOF MS i 16S rDNA pozwala na identyfikację dużej liczby różnych gatunków bakterii z dużą dokładnością. Niedawno zaprezentowano połączenie analizy genów MALDI-TOF MS i 16S rRNA w celu identyfikacji bakterii, badania nad kwestiami epidemiologicznymi i rzadkimi patogenami 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, Woda do HPLC, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>85600</td><td>Homogenizator oscylacyjny</td></tr><tr><td>Kulki szklane 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1,000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Niemcy&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Podkład odwrotny RTU4 (5&acute;-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3&acute;)</td><td>biomers.net, Ulm, Niemcy&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz cyklu&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>-&nbsp;</td><td>Termocyklik</td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72,692</td><td></td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburg, Niemcy</td> <td>-</td> <td>Mikrofalówka</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-sól odwodniona; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 do 1,000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Belgia</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Niemcy-Bromek</td><td></td></tr> <tr><td>etydyny, roztwór 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td><td></td> <td>Niemcy-Żel-system dokumentacji&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reakcji)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Wielka Brytania</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Bufor (10x) z EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Formamid Hi-Di (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>-</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>MicroAmp optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny, podstawa płytki 96-dołkowa</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny, ustalacz płytki 96-well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny, dobrze przegroda</td><td>płytkowa Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny, polimer POP-7, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny, 4-kapilarna matryca, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy sekwencjonowania 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Niemcy-Nasz</td> <td>mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Niemcy-Oprogramowanie</td> <td>do sterowania urządzeniami</td></tr><tr><td>Biotyper Klasyfikacja w czasie rzeczywistym 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Brema,</td> <td>Niemcy-Oprogramowanie</td> <td>analityczne</td></tr><tr><td>&kwas alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Niemcy</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Norma kalibracji peptydów II</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Niemcy</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 stal polerowana docelowa</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Niemcy</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Brema, Niemcy</td><td>Nr części 1836007&nbsp;</td><td>Zautomatyzowany system przygotowywania próbek</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>Nasz aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Niemcy</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Zautomatyzowany system mikrobiologiczny</td><td>BD, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><<tr><td>i>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; złocisty&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&handel ;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Francja</td><td></td><td>Kontrola pozytywna dla PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16s rrna i maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Istnieje wiele rzadkich i dlatego niedostatecznie opisanych patogenów bakteryjnych, które według doniesień powodują poważne infekcje, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością. W większości przypadków dostępnych jest tylko kilka danych, w większości publikowanych w formie opisów przypadków, które badają rolę takich patogenów jako czynnika zakaźnego. Dlatego, aby wyjaśnić chorobotwórczy charakter takich mikroorganizmów, konieczne jest przeprowadzenie badań epidemiologicznych, które obejmują dużą liczbę tych bakterii. Metody stosowane w takim badaniu nadzorczym muszą spełniać następujące kryteria: identyfikacja szczepów musi być dokładna zgodnie z obowiązującą nomenklaturą, powinny być łatwe w obsłudze (solidność), ekonomiczne w rutynowej diagnostyce i muszą dawać porównywalne wyniki w różnych laboratoriach. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy strategie identyfikacji szczepów bakteryjnych w rutynowych warunkach: 1) identyfikacja fenotypowa charakteryzująca właściwości biochemiczne i metaboliczne bakterii, 2) techniki molekularne, takie jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA oraz 3) spektrometria mas jako nowatorskie podejście oparte na proteomie. Ponieważ spektrometria mas i podejścia molekularne są najbardziej obiecującymi narzędziami do identyfikacji dużej różnorodności gatunków bakterii, opisano te dwie metody. Omówiono postępy, ograniczenia i potencjalne problemy związane ze stosowaniem tych technik.

MALDI-TOF MS to nowoczesna, szybka i niedroga metoda rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej. Identyfikacja gatunków bakterii za pomocą MALDI-TOF MS generuje spektra składające się głównie z białek rybosomalnych, ale także innych „bardzo konserwatywnych białek pełniących funkcje gospodarskie, na które warunki środowiskowe mają minimalny wpływ” 17. Baza danych tego mMIS zawiera szeroki zestaw widm referencyjnych, dzięki czemu można bezpiecznie zidentyfikować nawet bakterie rzadk...

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu spektrometrii mas MALDI-TOF jest usprawnienie typowania rzadkich patogenów za pomocą szybkiej i kosztowo efektywnej procedury. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii diagnostycznej, umożliwiając szybką identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych. Dzisiaj omówimy gatunek odoratimimus oraz bakterie z rodzaju Myroides.Aby zademonstrować metodę oraz omówić interpretację wyników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przenoszenie bakterii, nakładanie warstw podłoża oraz interpretacja wyników wymagają umiejętności technicznych i wiedzy z zakresu mikrobiologii. Pomysł wykorzystania MALDI-TOF MS do przesiewowego wykrywania rzadkich bakterii pojawił się u nas, gdy w naszym szpitalu pojawił się pacjent z zakażeniem stopy cukrzycowej wywołanym przez Myroides odoratissimus.Protokół należy rozpocząć od ekstrakcji bakteryjnego DNA, PCR rDNA 16S oraz sekwencjonowania metodą Sangera, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą drewnianego wykałaczki należy przenieść pojedynczą kolonię bakterii do dołka stalowej płytki docelowej z 96 dołkami. Na osuszony na powietrzu organ

identification-rare-bacterial-pathogens-16s-rrna-gene-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Poznaj identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą MALDI-TOF MS i sekwencjonowania genu 16S rRNA. Ta metoda umożliwia szybką diagnostykę mikrobiologiczną w laboratorium klinicznym.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Przeglądaj więcej filmów