Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS
11 lipca 2016
Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.
Ogólnym celem tego protokołu spektrometrii mas MALDI-TOF jest poprawa typowania rzadkich patogenów poprzez szybką i opłacalną procedurę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii diagnostycznej, pozwala na szybkie poznanie rzadkich patogenów bakteryjnych. Dzisiaj chcemy porozmawiać o odoratimimus i bakteriach z rodzaju Myroides.
Zademonstrowanie metody i opowiedzenie o interpretacji wyników. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą mieć trudności, ponieważ przenoszenie bakterii, nakładanie metryk i interpretacja wyników wymagają umiejętności technicznych i wiedzy mikrobiologicznej. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł, aby użyć MALD-TOF MS do badań przesiewowych w kierunku rzadkich bakterii, gdy mieliśmy w naszym szpitalu pacjenta cierpiącego na cukrzycową infekcję pokarmową wywołaną przez Myroides odoratimus.
Rozpocznij ten protokół od ekstrakcji bakteryjnego DNA, 16S rybosomalnego DNA PCR i sekwencjonowania Sangera, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj drewnianej wykałaczki, aby przenieść pojedynczą kolonię bakterii do studzienki z 96-dołkowym stalowym celem. Umieść jeden mikrolitr 70% kwasu mrówkowego na wierzchu wysuszonego na powietrzu organizmu na stalowej tarczy i pozostaw do wyschnięcia na około dwie do trzech minut.
Na miejsce nałożyć jeden mikrolitr roztworu matrycowego zawierającego 50 mg/ml CHCA w rozpuszczalniku organicznym złożonym z 50% acetonitrylu, 2,5 kwasu trifluorooctowego i 47,5% wody. Pozostaw rozmazaną i nałożoną matrycę do wyschnięcia na około pięć minut w kapturze. Aby wprowadzić próbki, należy napowietrzyć port ładowania próbki spektrometru masowego, naciskając przycisk wsiadania/wyłączania przyrządu.
Otwórz port ładowania i włóż płytkę docelową MALDI-TOF MS z wysuszonym rozmazem bakteryjnym i matrycą. Zamknij port i ponownie się ewakuuj. Obserwuj próżnię, a gdy osiągnie 4,5 miliona milibarów, rozpocznij pomiar.
Otwórz oprogramowanie analityczne MMIS i kliknij menu plik. Wybierz nową klasyfikację"i nowe okno o nazwie Kreator klasyfikacji w czasie rzeczywistym MALDI Biotyper w czasie rzeczywistym"powinien się otworzyć. Wpisz nazwę projektu w polu Nazwa projektu" i kliknij Nowy, w nowym oknie dialogowym o nazwie Nowy projekt sprawdź nazwę projektu i kontynuuj, klikając przycisk W porządku".
W Kreatorze Klasyfikacji MALDI Biotyper w czasie rzeczywistym obserwuj okno umieszczania analitu. Wybierz pozycje docelowe, kliknij prawym przyciskiem myszy dowolną wybraną pozycję i wybierz Dodaj próbki. W automatycznie otwieranym widoku tabeli wpisz nazwę próbki, identyfikator próbki i opcjonalnie komentarz.
Kliknij Dalej"przycisk, aby kontynuować. Następnie obserwuj okno wyboru metod MALDI Biotyper. Wybierz Taksonomię Bruker"z MSP z drzew taksonomii i kliknij Dalej"kontynuować.
Następnie obserwuj okno podsumowania projektu. Sprawdź wstawione wpisy podane powyżej, aby zapoznać się z rzeczywistym projektem klasyfikacji. Rozpocznij klasyfikację, klikając przycisk "Zakończ".
Pomiary rozpoczynają się automatycznie po osiągnięciu odpowiedniej próżni. Postępuj zgodnie z przebiegiem klasyfikacji, aż pomiar zostanie pomyślnie zakończony. Po zakończeniu pomiaru otwórz menu Widok"i kliknij Wyniki", aby wyświetlić tabelę wyników w MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.
Wyświetl wyniki klasyfikacji Bruker-Daltonik MALDI Biotyper jako plik html w domyślnej przeglądarce internetowej. Wydrukuj i zapisz wyniki. Pokazano tutaj widma uzyskane przez MALDI-TOF MS, które są mierzone i klasyfikowane w czasie rzeczywistym.
Widmom przypisuje się nazwę gatunku i wartość punktową odzwierciedlającą jakość pomiaru. Wyniki powyżej 2.300 reprezentują wysoce prawdopodobną identyfikację gatunku. Wynik od 2.000 do 2.300 wskazuje na bezpieczną identyfikację gatunku.
Wynik poniżej 1.700 i 2.000 oznacza prawdopodobną identyfikację gatunku. A wynik poniżej 1.700 nie jest miarodajny. Identyfikacja patogenów bakteryjnych wyhodowanych na czystej kulturze na stałym podłożu zajmuje od dwóch do trzech minut.
Ważne jest, aby pamiętać, że rzadkie patogeny bakteryjne można znaleźć za pomocą MALDI-TOF MS tylko wtedy, gdy instrumenty niezawodnie zawierają odpowiednie widma. W przeciwnym razie musi zostać usunięty poprzez integrację widm MaSDA z typowanych szczepów ich scharakteryzowanych izolatów. W przypadku, gdy wyniki punktacji nie prowadzą do jednoznacznej identyfikacji szczepu, można zastosować dalsze metody, takie jak profilowanie biochemiczne lub sekwencjonowanie 16S rDNA.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wykrywanie bakterii, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów, takich jak grzyby lub beztlenowce. Ponadto można zmierzyć odporność bakterii. Nie zapomnij o pracy z matrycą, która jest substancją niebezpieczną, noś rękawice, okulary ochronne i pracuj pod kapturem.
Ponadto bezwzględnie konieczne jest wysuszenie matrycy i dokładne rozsmarowanie, aby uniknąć rozpryskiwania się w komorze analitycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie spektrometrii mas MALDI-TOF w celu usprawnienia identyfikacji rzadkich patogenów bakteryjnych. Dzięki zintegrowaniu tej metody z technikami molekularnymi badacze mogą uzyskać dokładniejszą diagnostykę mikrobiologiczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Techniki diagnostyczne
- Identyfikacja patogenów
Wstęp
- MALDI-TOF MS jest potężnym narzędziem do typowania patogenów.
- Rzadkie patogeny bakteryjne stanowią wyzwanie w rutynowej diagnostyce.
- Zrozumienie ograniczeń tradycyjnych metod jest kluczowe.
- Do efektywnego wdrożenia wymagane są umiejętności techniczne.
Cel badania
- Udoskonalenie typowania rzadkich patogenów.
- Zapewnienie szybkiej i kosztowo efektywnej procedury diagnostycznej.
- Zaprezentowanie metody na konkretnych przykładach bakteryjnych.
Zastosowane metody
- Spektrometria mas MALDI-TOF do przesiewowego wykrywania patogenów.
- Sekwencjonowanie genu 16S rRNA do identyfikacji molekularnej.
- Procedury techniczne przenoszenia i nakładania warstwy bakterii.
- Interpretacja wyników spektrometrii mas.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja Myroides odoratimimus.
- Wykazanie skuteczności szybkiej diagnostyki rzadkich patogenów.
- Podkreślenie znaczenia wiedzy technicznej.
- Przedstawienie informacji na temat możliwości zastosowania tej metody w warunkach klinicznych.
Wnioski
- Połączenie MALDI-TOF MS z technikami molekularnymi usprawnia diagnostykę.
- Szkolenie jest niezbędne do efektywnego stosowania tej metody.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć zakres identyfikacji patogenów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych ma krytyczne znaczenie dla mikrobiologii diagnostycznej w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym, szczególnie w odniesieniu do populacji pacjentów z niedoborami odporności. Integracja MALDI-TOF MS z sekwencjonowaniem 16S rRNA umożliwia szybką i kosztowo efektywną identyfikację na poziomie gatunkowym, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów przeciwdrobnoustrojowych. To zintegrowane podejście zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez redukcję liczby wyników fałszywie ujemnych w detekcji patogenów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez potwierdzenie tożsamości rzadkich patogenów w modelach infekcji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia rzetelną, zgodną z nomenklaturą identyfikację szczepów, niezbędną do powtarzalnego ograniczania ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dokładną charakterystykę patogenów w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki punktowe (np. >2,300 dla wysokiego prawdopodobieństwa identyfikacji), co umożliwia standaryzowaną potwierdzoną identyfikację trafień w badaniach przesiewowych środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie do analizy dzięki szybkiej (<3 min) identyfikacji czystych kultur, co zwiększa przepustowość i skalowalność badań przesiewowych.
- Wartość reprodukowalności: Zapewnia porównywalność między laboratoriami dzięki standaryzowanemu dopasowaniu widm i opieraniu się na zwalidowanych bazach danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację rzadkich patogenów w klinicznie istotnych modelach infekcji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, gdy progi punktowe (2.000–2.300) potwierdzają pewną identyfikację gatunku.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera dopasowanie biomarkerów w sytuacjach, gdy obecność patogenu koreluje z odpowiedzią gospodarza w modelach z niedoborem odporności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, w której precyzyjna identyfikacja patogenu dostarcza informacji niezbędnych do badań mechanistycznych i oceny związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez potwierdzanie rzadkich czynników bakteryjnych w modelach infekcji, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, zwalidowanych systemów biologicznych z wynikami ilościowymi w celu rzetelnej oceny związków.
- Analityka: Zapewnia odczyty oparte na punktacji (np. klasyfikacja MALDI Biotyper), które umożliwiają obiektywne porównanie warunków i walidację trafień.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez walidację patogenów w systemach istotnych dla danej choroby, wyłącznie w przypadku dostępności materiału źródłowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku potencjał diagnostyczny w wielu projektach dotyczących rzadkich patogenów, co ogranicza redundantne prace walidacyjne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja błędnych przypisań patogenów oraz mechanistyczne ograniczanie ryzyka.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność identyfikacji patogenów w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje go/no-go w programach przeciwdrobnoustrojowych, efektywność kapitałowa dzięki szybkiej diagnostyce oraz zmniejszone biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe w oparciu o ryzyko, z wykorzystaniem potwierdzonej tożsamości patogenów w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu mikrobiologii w celu przenoszenia bakterii, nakładania macierzy oraz interpretacji wyników.
- Zależne od instrumentacji MALDI-TOF MS z aktualnymi bazami danych taksonomicznych (np. Bruker Taxonomy) w celu dokładnego dopasowania widm.
- Wymaga standaryzowanych protokołów przygotowania próbek w celu zapewnienia suchości macierzy i preparatu, co zapobiega zanieczyszczeniu analizatora.
- Wymaga zastosowania metod alternatywnych, takich jak sekwencjonowanie 16S rRNA lub profilowanie biochemiczne, gdy wyniki MALDI-TOF spadną poniżej 1,700, co uniemożliwia wiarygodną identyfikację.
- Obejmuje protokoły bezpieczeństwa dotyczące obchodzenia się z niebezpiecznymi roztworami macierzy (np. kwas mrówkowy, acetonitryl) w dygestorium z użyciem środków ochrony indywidualnej.
