Name: Praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metody przetwarzania tkanek ludzkich w translacyjnych badaniach nad rakiem. Techniki te maksymalizują jakość i ilość danych z pojedynczej resekcji chirurgicznej, umożliwiając analizę mutacji, aktywowanych szlaków i podtypów komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez filantropijne datki John G. and Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant #0727033) oraz Melanoma Research Alliance. Autorzy pragną podziękować University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) za koordynację dystrybucji i pobierania tkanek oraz ułatwianie badań translacyjnych, a także dr Ignacio Wistuba, dr Victor Prieto, MD Anderson Cancer Center Department of Patology i Melanoma Moon Shot Program. Na koniec autorzy pragną podziękować wszystkim pacjentom i rodzinom dotkniętym czerniakiem.

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół został zatwierdzony przez University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Zbierz próbki tkanek badawczych z nadwyżki guza i powiązanych normalnych tkanek10-12. Przechowuj próbki na mokrym lodzie, aby uniknąć autolizy.</li>
	<li>Wyślij wszystkie tkanki, urządzenia medyczne i ciała obce usunięte podczas zabiegu chirurgicznego do Oddziału Patologii w celu przeprowadzenia niezbędnych badań w celu ułatwienia diagnozy patologicznej.</li>
	<li>Z tkankami przeznaczonymi do badań należy postępować zgodnie z obowiązującymi zasadami i procedurami dotyczącymi badań i bankowania tkanek. 
	UWAGA: Pobieranie próbek biologicznych wymaga koordynacji działań patologów, asystentów patomorfologów, histotechnologów i specjalistów ds. pobierania tkanek.</li>
</ol>
2. Zapewnienie jakości patologii (QA) 
<ol>
	<li>Uzupełnij i zweryfikuj dokumentację pacjenta jako wczesną miarę kontroli jakości i skonsultuj się z patologiem w celu przejrzenia diagnostycznej dokumentacji pacjenta (raporty patologiczne, preparaty tkankowe itp.) oraz próbek tkanek. Oceniaj próbki tkanek pod kątem interesujących cech morfologicznych, takich jak procent guza, martwica, granica tkanka-guz itp. Jest to zgodne z najlepszymi praktykami dotyczącymi biorepozytoriów10-12.</li>
	<li>Po wstępnym przeglądzie należy przeprowadzać okresowe przeglądy danych z repozytorium biologicznego i próbek badawczych przez cały okres pobytu próbki biologicznej.</li>
	<li>Połącz wyniki i adnotacje z badań histopatologicznych i innych badań z próbkami i przekaż te dane badaczom za pośrednictwem zastrzeżonego systemu oprogramowania do biorepozytorium. 
	UWAGA: Procesy zapewniania jakości zapewniają integralność zarówno klinicznych, jak i technicznych aspektów operacji biorepozytoriów.</li>
	<li>Wykonaj testy genetyczne i molekularne w celu weryfikacji i scharakteryzowania próbek do użytku klinicznego.</li>
	<li>Zbieraj i analizuj dane w oparciu o informacje zwrotne od badaczy, którzy używali próbek do eksperymentów laboratoryjnych. Śledź próbki za pomocą technologii kodów kreskowych. Ten elektroniczny system śledzenia jest również zalecany w najlepszych praktykach biorespozytornych10-12.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie próbek/tkanek 
<ol>
	<li>Świeże próbki tkanek należy zawsze przechowywać na mokrym lodzie i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby ograniczyć zmiany wywołane ekstrakcją próbki tkanki z jej naturalnego środowiska. Normalne próbki tkanki guza i tkanki nowotworowej należy przetwarzać oddzielnie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. 
	UWAGA: W oparciu o protokoły badawcze, przetwarzanie próbek biologicznych może obejmować pobieranie próbek w jednym lub kilku rodzajach pożywki.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem procesu przygotuj sterylne naczynie do hodowli Petriego, skalpel, a także igłę lub kleszcze do obróbki tkanek. Upewnij się, że probówki zostały przygotowane, oznaczone i ułożone w celu ograniczenia czasu przetwarzania próbki (rysunek 2).</li>
	<li>Wszystkie istotne informacje o tkankach, takie jak imię i nazwisko pacjenta, numer, leczenie, data zabiegu i inne istotne informacje, które mogą być odpowiednie dla badania, powinny być łatwo dostępne w instytucjonalnej bazie danych tkanek. Ograniczone informacje o pacjencie powinny być przechowywane w laboratorium w formie papierowej lub arkusza kalkulacyjnego. 
	UWAGA: Zbieraj tylko informacje o próbkach biologicznych istotne dla charakteru badania, tj. podstawowe badania biomedyczne, badania kliniczne, badania translacyjne itp. W celu uzyskania informacji na temat konkretnej choroby, personel biorepozytorium powinien zbierać dane uznane za niezbędne przez aktualną literaturę i organizacje zarządzające, aby zapewnić właściwą diagnozę i znaczące badania. Obejmuje to między innymi stopnie zaawansowania guza i informacje o stopniu zaawansowania raka.</li>
	<li>Zaplanuj z wyprzedzeniem wszystkie pożądane kolejne eksperymenty, aby zdecydować o wielkości skrawków tkanek wymaganych dla każdego rodzaju analizy, a także o miejscu wycięć. W idealnej sytuacji, choć jest to niemożliwe, wszystkie analizy powinny być reprezentatywne dla całego przekroju tkanki, aby uwzględnić niejednorodność tkanek i ograniczyć stronniczość dalszych analiz. Rozłóż wszystkie wymagane elementy z wyprzedzeniem, jak pokazano na rysunku 2.</li>
	<li>Umieścić próbkę tkanki w otwartym naczyniu do hodowli Petriego, płasko przylegając do powierzchni. 
	UWAGA: Zezwalaj tylko upoważnionym pracownikom biorepozytorium na zajmowanie się zidentyfikowanymi próbkami i przeglądanie zidentyfikowanych danych zdrowotnych. Badacze powinni mieć dostęp tylko do tych identyfikatorów pacjentów, które są dozwolone w podpisanych świadomych zgodach i zgodnie z regulacjami IRB. Wszystkie próbki muszą być odpowiednio oznakowane i powinny zawierać co najmniej niepowtarzalny numer identyfikacyjny tkanki i typ tkanki. Nie umieszczaj na etykietach żadnych chronionych informacji o zdrowiu, zgodnie z przepisami HIPAA.</li>
	<li>Sprawdź próbkę pod każdym kątem, aby lepiej zrozumieć jej strukturę i wymiary. Przypnij próbkę do dna naczynia za pomocą igły i przystąp do przecięcia tkanki na pół wzdłuż jej największej i najlepiej reprezentatywnej osi.</li>
	<li>Wytnij mały kawałek tkanki i umieść go w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml roztworu stabilizującego RNA. Próbkę tę można umieścić na lodzie na pozostałą część procesu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. 
	UWAGA: Podczas pracy z RNA należy zawsze nosić rękawice i używać końcówek filtrujących wolnych od RNAse, aby ograniczyć ryzyko degradacji i zanieczyszczenia RNA.</li>
	<li>Rozłóż otwartą i wstępnie oznakowaną kasetę do biopsji w pokrywie szalki do hodowli Petriego. Wytnij plasterek tkanki nie grubszy niż 3 do 5 mm i przenieś go do kasety. Umieść kasetę w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) na co najmniej 72 godziny. Przenieś kasetę w 70% etanolu do długotrwałego przechowywania przed zatopieniem w parafinie. 
	UWAGA: Etykietowanie kaset powinno odbywać się ołówkiem lub zalecanymi markerami, ponieważ użycie ksylenu podczas przetwarzania spowoduje usunięcie etykiet.</li>
	<li>Wytnij kawałek chusteczki i umieść go w foremce na chusteczki higieniczne. Przykryj wycinek tkanki związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i natychmiast zamroź go w temperaturze -20 °C w celu kriosekcji. Ten wycinek tkanki może być przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie gotowy do kriosekcji.</li>
	<li>Wyciąć jeden lub wiele kawałków tkanki i przenieść je do 50 ml probówki zawierającej bufor MACS (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,5% płodowa surowica bydlęca (FBS), 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) w celu późniejszej analizy cytometrii przepływowej. W przypadku cytometrii przepływowej preferowane mogą być większe próbki, ponieważ komórki mogą zostać utracone podczas dysocjacji guza, utrwalania komórek i przepuszczalności, gdy jest to wymagane. Ogólnie rzecz biorąc, ta sekcja może być wykonana na końcu, po przetworzeniu wszystkich innych elementów. Pozostałą reprezentatywną próbkę guza można wykorzystać do cytometrii przepływowej. Opcjonalnie probówka ta może być przechowywana w temperaturze 4 °C O/N lub używana do barwienia metodą cytometrii przepływowej bezpośrednio po trawieniu do zawiesiny komórkowej (patrz Krok 4 - Barwienie cytometryczne przepływowe).</li>
	<li>Pokrój pozostałą tkankę na kawałki nie większe niż maksymalny rozmiar 0,5 mm x 0,5 mm i przenieś je do fiolek kriogenicznych w celu natychmiastowego zamrożenia w ciekłym azocie. Te zamrożone próbki mogą być wykorzystane do przyszłych analiz i celów współpracy. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z ciekłym azotem, ponieważ bezpośredni kontakt może spowodować poważne obrażenia. Oczy należy chronić okularami ochronnymi z osłonami bocznymi lub osłoną twarzy. Należy również nosić rękawice kriogeniczne w celu ochrony przed oparzeniami ciekłym azotem spowodowanymi rozpryskiwaniem i bezpośrednim kontaktem. Rękawice powinny być odpowiednio dopasowane, ale na tyle luźne, aby można je było szybko zdjąć, jeśli dostanie się do nich ciekły azot.</li>
</ol>
4. Barwienie cytometryczne przepływem
<ol>
	<li>Homogenizacja tkanek
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę wytrawiającą z DMEM (40 ml), DNazą I (50 U/ml) i kolagenazą I (2 mg/ml). Umieść świeży lub przechowywany w O/N guz w buforze MACS w pokrywie szalki Petriego i zanurz w pożywce trawiącej. 
		UWAGA: Istnieją różne metody trawienia, z których każda ma zalety (np. ekspresja białek na powierzchni komórki, żywotność). Upewnij się, że masz odpowiednią metodę dla żądanej aplikacji końcowej.</li>
		<li>Przypnij guza do dna naczynia za pomocą igły i przetnij skalpelem od zewnątrz do środka, aż guz będzie miał konsystencję pasty. Przenieś mieszaninę nowotworową do probówki o pojemności 50 ml, zamknij i umieść w plastikowej torbie, aby uniknąć wycieków. Przenieść probówkę do inkubatora i obracać z prędkością 225 obr./min, 37 °C, 1 godz.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek nowotworowych przez sitko komórkowe 70 μm. Zawiesina komórek wirówki w temperaturze 250 x g, 4 °C, 5 min. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforze FACS (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M bulionu EDTA, 10 ml FCS lub FBS).</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić w stężeniu 1x107 komórek/ml. Przenieść 100 μl na studzienkę (10-6 komórek) na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną w celu barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żywotność i barwienie przeciwciał
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl roztworu barwie żywotności i wymieszać. Inkubować przez 30 minut, w temperaturze 4 °C, w ciemności. Odwirować komórki w temperaturze 250 x g, w temperaturze 4 °C, 5 minut i odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać mieszaninę przeciwciał o zalecanym/miareczkowanym stężeniu (wg producenta) dla antygenów powierzchniowych w 200 μl buforu FACS. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, 30 minut, w ciemności. Odwirować komórki w temperaturze 250 x g, w temperaturze 4 °C, 5 minut i odessać supernatant.</li>
		<li>Przemyć 200 μl buforu FACS, odwirować komórki w temperaturze 250 x g, w temperaturze 4 °C, 5 minut i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i przystąpić do cytometru przepływowego w celu akwizycji i analizy. 
		UWAGA: W przypadku barwienia metodą cytometrii przepływu wewnątrzkomórkowego należy wykonać etapy utrwalania i przepuszczalności oraz barwienia wewnątrzkomórkowego między krokami 4.2.2 i 4.2.3. W przypadku barwienia cytokinami komórki powinny być wstępnie aktywowane przed barwieniem zgodnie z zaleceniami, a podczas aktywacji należy zastosować inhibitor wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek, taki jak monenzyna, aby zapewnić zachowanie rozpuszczalnych czynników. Utrwalone komórki mogą być przechowywane przez krótki okres (jeden tydzień) w temperaturze 4 °C w ciemności przed pobraniem na cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li>
<li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).</li>
<li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li>
<li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li>
<li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockbank%2C+KG+%22Advances+in+Biopreservation%22">Advances in Biopreservation</a>. , 157-159 (2006).</li>
<li>Bulmer, M. The ethics of social research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBulmer%2C+M+%22Researching+social+life%22">Researching social life</a>. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).</li>
<li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenslar%2C+RL+%22IRB+guidebook%22">IRB guidebook</a>. , US Government Printing Office. (1993).</li>
<li>Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25">http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25</a> (2011).</li>
<li>HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm">http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm</a> (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MD+Anderson+Cancer+Center+Institutional+Tissue+Bank+Standard+Operating+Procedures%22">MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures</a>. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).</li>
<li>Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf">http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf</a> (2011).</li>
<li>NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf">http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf</a> (2011).</li>
<li>Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li>
<li>Chung, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li>
<li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li>
<li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li>
<li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li>
<li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+thermodynamic+stability+of+DNA%2C+RNA%2C+and+DNA%3ARNA+hybrid+duplexes%3A+relationship+with+base+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ostatecznie metody przetwarzania muszą być podyktowane pożądaną hipotezą i przewidywanymi testami technicznymi, które należy przeprowadzić (rysunek 1). Poniższa sekcja służy jako przegląd w celu opisania potencjalnych testów, które można przeprowadzić na takich odcinkach tkanki. W żadnym wypadku nie jest to wyczerpujący przegląd, ale ma na celu pomóc w kierowaniu metodami przetwarzania próbek i wyborze dalszych testów poprzez opisanie technik i wymienienie ich mocnych i słabych stron.
<p class="jove_...

Badania medyczne przyniosły ogromne korzyści z badania zarówno ludzkich linii komórkowych, jak i modeli zwierzęcych. Linie komórkowe pozwalają na lepszą kontrolę składników w systemie, a także wykorzystanie komórek z właściwego organizmu. Praca z komórkami ludzkimi, choć bardziej reprezentatywna, przedstawia drastycznie uproszczony obraz mechanizmów, które mogą być odpowiedzialne za zdrowie i chorobę, ponieważ linie komórkowe mogą nie odzwierciedlać wpływu innych komórek, składników zrębu i narządów, które mogą wpływaćna odpowiedzi1. Z drugiej strony, modele zwierzęce, choć nie są w pełni dokładne w odtwarzaniu chorób ludzkich i heterogeniczności genetycznej, oferują dalszy wgląd, umożliwiając wprowadzenie danych całymi układami zwierzęcymi w większości modeli2,3.
Pomijając niedociągnięcia, obie metody mają swoje zalety i są komplementarne. Jednak głównym celem pozostaje badanie ludzkich komórek i narządów, w całym ciele, systemie wielonarządowym. W związku z tym badania translacyjne poczyniły ogromne postępy w ułatwianiu badań nad ludzkimi narządami i tkankami pobranymi od pacjentów, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw choroby. Badania translacyjne mają tę zaletę, że badają wyniki leczenia i chorób w całym ciele i w odpowiednich komórkach, zapewniając w ten sposób to, co najlepsze z obu światów między pracą z komórkami i zwierzętami4.
Badania translacyjne również nie są pozbawione wad. Próbki pobrane od ludzi, po usunięciu z gospodarza, są natychmiast poddawane niedokrwieniu i innym czynnikom zewnętrznym, przed którymi w przeciwnym razie byłyby chronione. Może to skutkować zmianami molekularnymi i genetycznymi wywołanymi stresem oraz powodować błąd systematyczny w kolejnych badaniach. W związku z tym włożono wiele wysiłku w ekstrakcję i przetwarzanie tkanek za pomocą ścisłych metod, aby jak najlepiej zachować integralność narządów i komórek na potrzeby dalszych badań5. Co ważne, przy wyborze metod przetwarzania próbek ludzkich należy dokładnie rozważyć przyszłe zastosowania, ponieważ niektóre metody mogą być szkodliwe dla komponentów komórkowych i szlaków sygnałowych, oszczędzając inne.
W przypadku jakichkolwiek badań dotyczących tkanek ludzkich, kwestie regulacyjne muszą być rozwiązane. Po raportach Tuskegee i Belmont rosła akceptacja faktu, że badania biomedyczne wiązały się z nieodłącznym ryzykiem, często prowadząc do nieuniknionych dylematów etycznych6. Dostrzeżono potrzebę wprowadzenia krajowych standardów, a rząd federalny utworzył Instytucjonalne Komisje Rewizyjne (IRB) jako środek do utrzymania zasad Raportu Belmonta (Szacunek dla osób, dobroczynność, sprawiedliwość).
IRB każdej instytucji to komitet złożony z lekarzy, badaczy i członków społeczności, którzy są odpowiedzialni za ochronę uczestników badań. Wymaga ona uzyskania dobrowolnej zgody od wszystkich uczestników badań biomedycznych oraz udokumentowania tej zgody w formularzu świadomej zgody. Proces świadomej zgody ma na celu dostarczenie uczestnikowi odpowiednich informacji, tak aby można było podjąć świadomą decyzję o włączeniu się do badania lub kontynuowaniu uczestnictwa. W związku z tym dokument świadomej zgody musi być dobrze czytelny i napisany językiem, który może być łatwo zrozumiały (poziom czytania od 6do 8 klasy) przez populację docelową. Możliwość stosowania przymusu lub bezprawnego nacisku musi być zminimalizowana, a podmiot musi mieć wystarczająco dużo czasu na rozważenie udziału. Uczestnik musi mieć również możliwość skorzystania z prawa do wycofania zgody na dowolnym etapie badania bez ponoszenia kary. Dobrowolna świadoma zgoda jest obowiązkowym warunkiem wstępnym udziału uczestnika w badaniu, a także jest prawnie skuteczna7.
Zgodnie z przepisami dotyczącymi ochrony ludzi 21 CFR 50.25 (<a href="http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html</a>8), uczestnicy badania muszą być poinformowani o celu badania, procedurach związanych z badaniem, alternatywach dla uczestnictwa, wszystkich możliwych do przewidzenia zagrożeniach i niewygodach (w tym nie tylko urazach fizycznych, ale także możliwych psychicznych, społecznych lub szkody ekonomiczne, dyskomfort lub niedogodności), korzyści płynące z badania dla społeczeństwa i ewentualnie dla jednostki, długość czasu, przez jaki uczestnik ma uczestniczyć, osoba, z którą należy się skontaktować w celu uzyskania odpowiedzi na pytania lub w przypadku urazu lub nagłego wypadku związanego z badaniem, oświadczenie wskazujące, że udział jest dobrowolny i że odmowa udziału nie będzie skutkować żadnymi konsekwencjami ani utratą korzyści, takich jak kompromis w regularnej opiece klinicznej, którą uczestnik w inny sposób jest uprawniony do otrzymania w wyniku postawionej diagnozy, a na końcu oświadczenia dotyczącego prawa uczestnika do poufności i prawa do wycofania się z badania w dowolnym momencie bez żadnych konsekwencji. Próbki tkanek pobrane od uczestników, którzy wycofali zgodę w trakcie trwania badania, nie powinny być bankowane i muszą zostać natychmiast wyczerpane. Zrzeczenie się jednego lub więcej elementów świadomej zgody można uzyskać od IRB w przypadku niektórych projektów badawczych, które w praktyce nie mogłyby zostać zrealizowane bez zmiany wymaganych elementów, lub w przypadku badań, w których wymagane elementy nie mają zastosowania. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić poufność danych. Ustawa o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych (HIPAA) to prawo federalne, które uniemożliwia wykorzystywanie lub ujawnianie "chronionych informacji zdrowotnych" (PHI) bez pisemnej zgody uczestników. PHI obejmuje między innymi informacje o stanie zdrowia przekazywane lub przechowywane w dowolnej formie lub na dowolnym nośniku i obejmują pola, które mogą być wykorzystane do identyfikacji osoby9.
Poprzez tę pracę, staramy się nakreślić protokół, który musi być przestrzegany podczas przetwarzania tkanek - w tym pobierania i przechowywania oraz podkreślić znaczenie przestrzegania tych ścisłych wytycznych, aby zminimalizować odchylenia, które mogą wyniknąć z powodu naprężeń, którym tkanka jest poddawana podczas ekstrakcji. Staramy się również przedstawić krótki przegląd dalszych testów lub analiz (Rysunek 1), które można przeprowadzić na takich próbkach, aby czytelnicy mogli dokonać kwalifikowanej oceny, które testy najlepiej odpowiadają ich potrzebom.

<table><tbody><tr><td>Igły</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe ze stali nierdzewnej</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do biopsji</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór stabilizujący RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki Eppendorfa</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>Tubki 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki na formalinę</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie optymalnej temperatury cięcia (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m sitka komórkowe</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe okrągłe płyty denne</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy roztwór plam</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Badania medyczne dla dobra ludzi są znacznie utrudnione przez konieczność stosowania ludzkich tkanek i obiektów. Jednak po uzyskaniu zgody na próbki ludzkie, cenne próbki muszą być traktowane z największą ostrożnością, aby zapewnić integralność narządów, tkanek i komórek w najwyższym stopniu. Niestety, przetwarzanie tkanek z definicji wymaga ekstrakcji tkanek od gospodarza, co może powodować duży stres komórkowy i mieć poważne reperkusje dla późniejszych analiz. Naprężenia te mogą spowodować, że próbka nie będzie już reprezentatywna dla miejsca, z którego została pozyskana. Dlatego podczas przetwarzania tych próbek należy przestrzegać ścisłego protokołu, aby zapewnić reprezentatywność. Należy również wziąć pod uwagę pożądane badanie lub próby, aby zapewnić zastosowanie optymalnej techniki przetwarzania próbki. Przedstawiono tutaj protokół pobierania tkanek, przetwarzania i różnych analiz, które mogą być wykonywane na przetworzonej tkance w celu maksymalizacji dalszej produkcji z ograniczonych próbek tkanek.

Wyniki przedstawione poniżej obrazują strategię bramkowania w cytometrii przepływowej dla szerokiego fenotypowania immunologicznego przetworzonego guza czerniaka. W dniu barwienia próbkę tkanki poddano trawieniu i homogenizacji z użyciem kolagenazy I oraz DNazy I poprzez inkubację przez 60 min w temperaturze 37 °C przy obrotach 225 RPM. Po trawieniu zawiesinę komórkową przefiltrowano przez sitko komórkowe 70 µm w celu usunięcia zanieczyszczeń, a następnie komórki zabarwiono przeciwciałami do cytometrii przepływowej znako...

Translacyjne badania nad rakiem są zależne od ekstrakcji tkanek ludzkich. Wiele pracy włożono w optymalizację metod ekstrakcji do analizy ex vivo. W tym miejscu opisujemy metody przetwarzania tkanek pozwalające na maksymalne uzyskanie danych wyjściowych z ograniczonej liczby próbek.

Praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmaksymalizowanie jakości i ilości danych wyekstrahowanych z próbek tkanek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie translacyjnych badań nad rakiem, takie jak: jakie mutacje występują, które szlaki są aktywowane oraz jakie podtypy komórek odpornościowych naciekają ludzkie guzy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wygenerowania ogromnej ilości danych z pojedynczego chirurgicznego wycięcia tkanki ludzkiej.Jednym z najbardziej krytycznych kroków przed procesowaniem preparatu jest zapewnienie jakości próbki oraz potwierdzenie obecności żywej tkanki nowotworowej poprzez ocenę patomorfologiczną, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Wszystkie istotne informacje dotyczące preparatu lub tkanki, takie jak imię i nazwisko pacjenta, numer, zastosowane leczenie oraz data operacji, powinny być łatwo dostępne w instytucjonalnej bazie danych tkanek. Świeże próbki tkanki należy zawsze przechowywać w lodzie i procesować tak szybko, jak to możliwe, aby ograniczyć zmiany wywołane usunięciem próbki tkankowej z jej naturalnego środowiska. Próbki tkanki nowotworowej oraz odpowiadające im próbki tkanki prawidłowej powinny być procesowane oddzielnie.Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy przygotować sterylną szalkę Petriego, skalpel oraz igłę lub pęsetę do obróbki tkanki. W celu skrócenia czasu przetwarzania próbek, należy wcześniej rozłożyć wszystkie wymagane elementy, tak jak przedstawiono tutaj. Umieść próbkę tkanki w otwartej szalce Petriego, płasko przy powierzchni.Obejrzyj próbkę z wszystkich stron, aby lepiej zrozumieć jej strukturę i wymiary. Przymocuj próbkę do dna naczynia za pomocą igły, a następnie podziel tkankę na pół wzdłuż jej najdłuższej i najbardziej reprezentatywnej osi. Wytnij niewielki fragment tkanki i umieść go w sterylnym mikrocentryfużowym probówce o pojemności 1,5 mililitra zawierającej jeden mililitr roztworu stabilizującego RNA.Umieść tę próbkę w lodzie przez pozostałą część procesu i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu użycia. Połóż otwartą i wcześniej opisaną kasetkę biopsyjną na pokrywce szalki Petriego. Wytnij plaster tkanki o grubości nie większej niż 3–5 mm i przenieś go do kasetki.Umieść kasetkę w 10% neutralnym buforze formalinowym na minimum 72 godziny. W temperaturze pokojowej wytnij fragment tkanki i umieść go w formie do tkanek. Przykryj sekcję tkanki związkiem OCT (optimal cutting temperature compound) i natychmiast zamroź w temperaturze -20°C do czasu przygotowania do kriosekcjonowania.Wytnij jeden lub więcej fragmentów tkanki i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml zawierającej bufor max. Tkanki można wykorzystać na świeżo lub przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza do analizy cytometrycznej. Pozostałą część tkanki potnij na fragmenty o maksymalnych wymiarach 0,5 mm na 0,5 mm i przenieś je do fiolek kriogenicznych.Tkanki należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w celu długoterminowego przechowywania. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować medium do trawienia z DM EMD NS one i kolagenazą. Świeży guz lub taki, który był przechowywany przez noc w buforze max, należy umieścić w pokrywce szalki Petriego i zanurzyć w medium do trawienia.Przytwierdź guza do dna naczynia za pomocą igły i nacinaj skalpelem od zewnątrz do środka, aż guz uzyska konsystencję pasty. Przenieś mieszaninę z guzem do probówki o pojemności 50 ml i szczelnie zamknij probówkę, aby zapobiec wyciekom. Umieść probówkę w inkubatorze i inkubuj przy 225 RPM w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Po jednej godzinie przefiltruj zawiesinę komórek nowotworowych przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, a następnie odwiruj zawiesinę przy 250 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL buforu FACS. Po policzeniu komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru), przygotuj zawiesinę komórek o stężeniu 1 × 10⁷ komórek/mL.Przenieś 100 µL lub 10⁶ komórek do każdej dołki płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie. Do każdej dołki dodaj 200 µL roztworu barwnika żywotności, wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Po 30 minutach odwiruj komórki przy 250 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut.Odsajmij supernatant. Dodaj mieszaninę przeciwciał w zalecanym stężeniu mianowanym dla antygenów powierzchniowych w 200 µL buforu fax. Inkubuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.Odwiruj komórki przy 250 Gs i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie odessij supernatant. Przepłucz komórki 200 mikrolitrami buforu fax i ponownie odwiruj, odessij supernatant i resuspenderuj komórki w 200 mikrolitrach buforu fax. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej. Te reprezentatywne wyniki przedstawiają strategię bramkowania w cytometrii przepływowej dla szerokiego fenotypowania immunologicznego w próbkach guza czerniaka, przetworzonych zgodnie z opisaną procedurą i przechowywanych przez noc w buforze max w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wykazujących bardzo ograniczoną śmiertelność.Ponadto zaprezentowano sposób przetwarzania tkanki. Pozwala to na wielokolorowe, szerokie fenotypowanie subpopulacji komórek odpornościowych w czerniaku, takich jak limfocyty B, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty T gamma delta, komórki NK, komórki dendrytyczne, makrofagi, komórki tuczne, bazofile, neutrofile i eozynofile. Po opanowaniu metody, technika ta może zostać wykonana w ciągu czterech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Unikalna metoda chirurgicznej resekcji raka płaskonabłonkowego jamy ustnej powstałych w jamie ustnej została przedstawiona tutaj.

Translacyjnie istotny model resekcji guza dla przedklinicznych modeli myszy raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metody przetwarzania tkanek ludzkich w translacyjnych badaniach nad rakiem. Techniki te maksymalizują jakość i ilość danych z pojedynczej resekcji chirurgicznej, umożliwiając analizę mutacji, aktywowanych szlaków i podtypów komórek immunologicznych.

Praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem

Przeglądaj więcej filmów