In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie wydajnej metody generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (PDCs) na potrzeby badań nad ich rozwojem. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii z dziedziny immunologii, takich jak mechanizmy regulujące rozwój PDCs. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania niewielkiej liczby komórek progenitorowych do wydajnego generowania dużych ilości PDCs.

Implikacje tej techniki odnoszą się do terapii chorób autoimmunologicznych związanych z PDC, takich jak toczeń rumieniowaty układowy, ateoza i łuszczyca. Zaprezentowanie tej procedury będzie niezwykle pomocne dla studenta pracującego w laboratorium. Dzień przed pobraniem komórek szpiku kostnego, wysiej komórki linii stromalne AC6 w zagęszczeniu 5,9 × 10⁴ komórek na dołek w poszczególne dołki płytek 12-dołkowych, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. Następnego ranka naświetl komórki AC6 promieniowaniem gamma z dawką 3000 rad i wymień pożywkę hodowlaną na 1 mL pożywki kompletnej.

Następnie umieść odpowiednią liczbę dorosłych myszy typu dzikiego szczepu C57BL/6 w kuwecie sekcyjnej i wysterylizuj zwierzęta 70% etanolem. Przenieś kuwetę do komory z przepływem laminarnym i wykonaj nacięcia w środkowej części brzucha każdego zwierzęcia, usuwając skórę z części dystalnych, w tym z kończyn dolnych, aby odsłonić kości udowe i piszczelowe; przetnij kość udową powyżej, a kość piszczelową poniżej stawów kolanowych, a następnie za pomocą nożyczek oddziel mięśnie od kości w miarę ich wycinania. Umieść kości w 6 cm czalce Petriego zawierającej 5 ml kompletnego medium RPMI i przenieś czalkę do sterylnej komory do hodowli komórkowych.

Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 3 mL wyposażoną w igłę 27G pełnym medium RPMI i za pomocą nożyczek odetnij oba końce każdej kości. Wprowadź igłę do każdej kości i wypłucz szpik, wykonując delikatny wtrysk pełnego medium RPMI raz z każdego końca. Następnie, bez igły, delikatnie aspiruj i wydzielaj komórki trzy do pięciu razy w naczyniu hodowlanym, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Po odwirowaniu komórek należy zlizować erytrocyty za pomocą jednego mililitra buforu CK, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 10 objętości pełnego medium RPMI. Po jednej minucie należy pozwolić skupkom martwych komórek iy detrytusowi osiąść przez pięć minut, a następnie ostrożnie zdekantować nadsącz do nowej probówki. Po ponownym odwirowaniu komórek zawiesza się całkowitą liczbę komórek szpiku kostnego w 100 µl buforu fax, aby przeanalizować wspólne progenitory limfoidalne (CLP) za pomocą cytometrii przepływowej.

Następnie zablokuj receptor Fc w komórkach przeciwciałem anty-CD 16-32 przez jedną do dwóch minut, po czym przeprowadź jednoczesne barwienie komórek odpowiednim koktajlem przeciwciał. Po 15 minutach w lodzie przemyj komórki trzema mililitrami buforu FACS i resuspenduj osad w 300 µL świeżego buforu FACS. Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 40 µm i niezwłocznie posortuj komórki w cytometrze przepływowym, stosując odpowiednie filtry i napięcia.

Zbierz interesujące komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej osiem ml kompletnego medium RPMI. Aby uzyskać silnie wzbogaconą populację PDCM, kluczowe jest wyselekcjonowanie odpowiedniej populacji CLP z pobranych komórek szpiku kostnego do ich hodowli in vitro z systemem Z sześć feeder. Po zakończeniu sortowania odwiruj komórki i resuspenduj osad komórek CLP w odpowiedniej ilości kompletnego medium RPMI, aby uzyskać gęstość komórek na poziomie około pięciu razy 10⁴ komórek na ml.

Następnie wysiej 500 komórek na studzienkę na płytce 12-dołkowej zawierającej komórki dokarmiające AC six i uzupełnij kokultury o 100 ng/ml liganda FL three, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, okresowo monitorując pod mikroskopem rozwój komórek dendrytycznych (DC). W 12. dniu zbierz komórki z supernatantu kokultury i przepłucz każdą studzienkę jeden raz 0,5 ml kompletnego medium RPMI, łącząc otrzymany supernatant i płukanki. Następnie dodaj do każdej studzienki 0,5 ml świeżego medium i użyj skrobaka do komórek, aby odlepić komórki adherentne.

Połącz odseparowane komórki z komórkami pływającymi i odwiruj powstałą zawiesinę komórkową. Resuspenduj osad w 50 µL buforu FACS. Następnie policz komórki i zabarw je w celu oceny ekspresji CD11c, CD11b oraz B220 po blokowaniu receptorów Fc.

Jak właśnie zademonstrowano, komórki współhodowli można następnie analizować pod kątem obecności konwencjonalnych populacji DC: CD11c-dodatnich, CD11b-dodatnich, B220-ujemnych oraz plazmocytoidalnych populacji CD11c-dodatnich, CD11b-ujemnych i B220-dodatnich, przy całkowitej liczbie od 4 do 6 × 10⁷. Komórki szpiku kostnego są zazwyczaj izolowane z kości udowych i piszczelowych myszy typu dzikiego C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni, przy czym 5 × 10⁴ CLP uzyskuje się zazwyczaj z jednej myszy C57BL/6. Po sortowaniu metodą cytometrii przepływowej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, w trzecim lub czwartym dniu współhodowli z komórkami dokarmiającymi AC6 zaczynają pojawiać się komórki tworzące obszary brukowane (cobblestone area forming cells), a nad nimi pojawiają się zawieszone, okrągłe plazmocytoidalne DC.

Do ósmego dnia liczba plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) osiąga szczyt około 12. do 14. dnia, po czym komórki te, po pełnym rozwoju, zaczynają ulegać apoptozie, a ich liczba stopniowo spada. Konwencjonalne kolonie komórek dendrytycznych (cDC) pojawiają się później, między szóstym a ósmym dniem; są one adherentne i charakteryzują się większą, wrzecionowatą morfologią. Analiza cytometryczna przepływowa wykazuje, że w ko-kulturowaniu 91% komórek to CD11c+, CD11b-, B220+ plazmacytoidalne komórki dendrytyczne oraz 6% to CD11c+, CD11b+, B220- konwencjonalne komórki dendrytyczne, co wskazuje na 100-krotny wzrost liczby pDC w stosunku do pierwotnej populacji CLP przy zastosowaniu tej metody.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że komórka C6 jest w dobrym stanie, a gęstość komórek jest prawidłowa przed dodaniem CLP po etapie namnażania. Technika ta utorowała drogę badaczom biologii DC do przełamania ograniczeń związanych z wykorzystaniem niewielkiej liczby prekursorów w badaniu rozwoju DC z różnych prekursorów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować PC in vitro z CLP przy użyciu systemu C6 BEAT.