Name: In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj metodę generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder. Technika umożliwia efektywną produkcję dużych ilości pDC z małej liczby komórek progenitorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni doktorom Markusowi Manzowi i Irvingowi Weissmanowi za dostarczenie odczynników. Doceniamy również usługi świadczone przez Główny Zakład Analizy Cytometrii Przepływowej i Sortowania Komórek w Pierwszym i Drugim Laboratorium Podstawowym odpowiednio w National Taiwan University College of Medicine i szpitalu NTU. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) oraz Narodowe Instytuty Badawcze Zdrowia na Tajwanie (NHRI-EX102-10256SI i NHRI-EX103-10256SI).

Myszy C57BL/6 typu dzikiego zakupiono w National Laboratory Animal Center (NLAC) na Tajwanie. Wszystkie myszy zostały wyhodowane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Protokoły i procedury wykorzystania zwierząt zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt National Taiwan University College of Medicine (numer zezwolenia: 20120075). Ponadto naukowcy dołożyli wszelkich starań, aby zmniejszyć ryzyko bólu, cierpienia lub dystresu u zwierząt podczas przeprowadzania eksperymentów. Wszystkie opisane procedury zostały przeprowadzone w RT w rękawiczkach.
1. Przygotowanie ogniw zasilających AC-6
Uwaga: Linia komórek zrębu18 AC-6.21 (w skrócie AC-6) (dostarczona przez I. Weissmana, Uniwersytet Stanforda) powinna być utrzymywana w RPMI uzupełnionym 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby służyć jako komórki zasilające, komórki AC-6 są γ napromieniowywane 3,000 rad (30Gy) na dzień przed kokulturą, aby zapobiec ich proliferacji. Należy zauważyć, że komórki AC-6 mają tendencję do utraty zdolności do różnicowania, jeśli są przepełnione podczas konserwacji lub jeśli ich liczba przejścia przekracza 20.
<ol>
	<li>Umyj komórki AC-6 raz 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco i usuń DPBS przez aspirację. Traktować komórki AC-6 0,8 ml roztworu trypsyny (0,05% trypsyny i 0,5 mM EDTA w DPBS) przez 3-5 minut w temperaturze 37oC, 5% CO2 , a następnie zatrzymać reakcję, rozcieńczając ją 10 objętościami pożywki hodowlanej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>Komórki AC-6 zasiać w 5,9x104 komórki/basenie na płytki 12-dołkowe i inkubować w temperaturze 37oC, 5% CO2 O/N. 
	Uwaga: Gęstość ogniw AC-6 jest bardzo ważna, ponieważ niższa gęstość będzie sprzyjać wytwarzaniu prądu stałego. Wysiew o gęstości 5,9x104 komórek/studzienkę pozwoli AC-6 osiągnąć konfluencję do następnego dnia, co jest optymalne do wyprowadzenia pDC z CLP.</li>
	<li>Naświetlić ogniwa AC-6 o natężeniu 3,000 rad (30 Gy) za pomocą γ-naświetlacza. 
	Uwaga: Dawka stosowana do napromieniania AC-6 jest zoptymalizowana tak, aby zapobiec proliferacji komórek, a jednocześnie utrzymać je przy życiu wystarczająco długo, aby zapewnić cytokiny i kontakt komórka-komórka wymagane do różnicowania DC od CLP.</li>
	<li>Odessać pożywkę i zastąpić 1 ml pełnego RPMI (RPMI 10 % inaktywowanego termicznie FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu).</li>
</ol>
2. Izolowanie komórek BM od myszy
<ol>
	<li>Ofiarować myszy przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Umieść myszy na tacy preparacyjnej i wysterylizuj 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w środkowej części brzucha i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą kończyny dolne.</li>
	<li>Wypreparuj myszy w półsterylnym kapturze. Aby uwolnić kość udową i piszczelową, przypnij kość udową powyżej, a piszczele poniżej stawu kolanowego. Odłącz mięśnie od kości za pomocą nożyczek i umieść kości na 6-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 5 ml pełnego RPMI.</li>
	<li>Przenieś się do sterylnego kaptura hodowlanego. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml podłączoną do igły 27G pełnym RPMI. Odetnij oba końce kości za pomocą nożyczek i włóż igłę 27G, aby wypłukać szpik z kości, delikatnie wstrzykując pełne RPMI raz z każdego końca.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół 3-5 razy w naczyniu hodowlanym za pomocą strzykawki bez igły.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g i zdekantować supernatant.</li>
	<li>Lizować krwinki czerwone za pomocą 1 ml buforu ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) inkubować przez 1 minutę i zatrzymać reakcję przez rozcieńczenie 10 objętościami pełnego RPMI. Pozostaw komórki na 5 minut, aby grawitacyjnie rozdrobnić martwe grudki komórek i resztki tkanek. 
	Uwaga: Nie stój dłużej niż 5 minut, ponieważ spowoduje to utratę komórek z powodu osiadania żywych komórek.</li>
	<li>Powoli zdekantować supernatant zawierający komórki do nowej probówki, pozostawiając zanieczyszczenia w oryginalnej probówce.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić całkowitą liczbę komórek BM (zwykle 4-6 x 107 komórek BM uzyskuje się z jednej myszy) w buforze FACS o pojemności 100 μl (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).</li>
</ol>
3. Analiza FACS i sortowanie CLP
<ol>
	<li>Dodaj anty-CD16/32 (klon hybrydoma supernant 2,4G2, 50 μl/reakcję lub 1-2 μg/reakcję) do komórek w buforze FACS (krok 2.9) na 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc. 
	Uwaga: Anty-CD16 / 32 jest również nazywany blokiem Fc, który jest dodawany, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc, w tym granulocytami, monocytami i limfocytami B.</li>
	<li>Jednocześnie barwić komórki następującymi przeciwciałami znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym (dla komórek 4x107) przez 15 minut na lodzie, unikając światła otoczenia. Przeciwciała: markery linii sprzężone z PE (po 0,2 μg), w tym anty-CD3 (17A2), anty-CD8 (53-6.). 7), anty-B220 (RA3-6B2), anty-CD19 (eBio1D3), anty-CD11b (M1/70), anty-Gr-1 (RB6-8C5), anty-Thy1.1 (HIS51), anty-NK1.1 (PK136), anty-TER119 (TER-119) i anty-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anty-c-Kit-PerCP-Cy5,5 (2B8), 1 μg anty-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anty-M-CSFR-APC (AFS98) i 0,2 μg anty-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).</li>
	<li>Przemyć komórki 3 ml buforu FACS i odwirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 300 μl i przefiltrować komórki przez sitko o pojemności 40 μM.</li>
	<li>Przemyć probówkę dodatkowym buforem FACS o pojemności 100 μl w celu odzyskania pozostałych komórek i przefiltrować do sterylnej probówki sortującej FACS przy użyciu tego samego sitka do komórek.</li>
	<li>Analizę cytometryczną przepływową należy przeprowadzić natychmiast po barwieniu, używając odpowiednich filtrów i napięć do wykrywania sygnału. Użyj lasera 488 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych FITC, PerCP-Cy5.5, lasera 561 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych PE i PE-Cy7 oraz lasera 633 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych APC.</li>
	<li>Sortuj CLP według następujących znaczników: lin-c-kit,int, Sca-1,int, M-CSFR-IL-7Rα+ (zgodnie z zabarwieniem w kroku 3.2), używając sortera komórek. Zebrać posortowane komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml pełnego RPMI jako poduszkę.</li>
	<li>Zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek, jak pokazano przez sortownik komórek na końcu przebiegu. Zazwyczaj 5x104 CLP można uzyskać z BM jednej myszy.</li>
</ol>
4. Coculture CLP i AC-6
<ol>
	<li>Odwirować posortowane komórki z kroku 3.7 przez 10 minut przy 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z wystarczającą ilością pełnego RPMI, aby uzyskać gęstość komórek około 5x104 komórek/ml. Wysiać 500 komórek/basenik na 12-dołkową płytkę zawierającą komórki zasilające przygotowane w kroku 1.4.</li>
	<li>Dodać 100 ng/ml FL19 (hu-Flt3L-Ig wytworzony we własnym zakresie przy użyciu systemu ekspresji dostarczonego przez M. Manz, Szpital Uniwersytecki w Zurychu, Szwajcaria) i inkubować w temperaturze 37oC, 5% CO2 z okresowym wizualnym monitorowaniem rozwoju prądu stałego pod mikroskopem. 
	Uwaga: Dostępny na rynku rekombinowany ludzki FL lub mysi FL może być stosowany jako substytut hu-Flt3L-Ig w celu wsparcia rozwoju prądu stałego.</li>
	<li>Zebrać komórki w supernatance w dniu 12 i przemyć studzienki raz 0,5 ml kompletnej pożywki RPMI, łączącej otrzymane supernatanty. Dodać 0,5 ml świeżej pożywki i zeskrobać przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Połączyć pożywkę zawierającą komórki z obu części i wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 50 μl. Dodać 50 μl supernatantu hybrydoma anty-CD16/32 i inkubować przez 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc.</li>
	<li>Wylicz i wybarwij wszystkie komórki następującymi przeciwciałami (po 0,05 μg każda): anty-CD11c-APC (N418), anty-CD11b-FITC i anty-B220-PE.</li>
	<li>Umyć i odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 3.3.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS 100 μl, zabramkować na CD11c+ i przeanalizować pod kątem cDC (CD11c+CD11b+B220-) i pDC (CD11c+CD11b-B220+)17.</li>
</ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy system hodowli in vitro dla solidnego wytwarzania DC, a w szczególności pDC, z niewielkiej liczby CLP. Wyjątkowość tego systemu hodowli wynika z zastosowania komórek AC-6, linii komórek zrębu, jako karmników. Wykazano, że takie podejście dostarcza nie tylko cytokin, takich jak IL-7, SCF, M-CSF i FL20, ale także kontakt komórka-komórka21 niezbędny do wspierania rozwoju prądu stałego. Komórki AC-6 były już wcześniej wykorzystywane do ułatwienia badań nad rozwojem D...

Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki prezentujące antygen, które odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu odpowiedzi immunologicznej1. Chociaż DC są niejednorodne, można je ogólnie podzielić na dwie populacje, konwencjonalne DC (cDC) i plazmocytoidalne DC (pDCs)2,3. Oprócz narządów limfatycznych, cDC i pDC znajdują się również w tkankach, w tym w płucach, jelitach i skórze2. Morfologia cDC i pDC różni się, przy czym cDC wykazują dendrytowe projekcje, a kształt pDC jest bardziej podobny do komórek plazmatycznych. Ponadto powszechny mysi marker DC, CD11c, ulega wyższej ekspresji na cDC niż na pDC. Co więcej, cDC można dalej podzielić na cDC CD11b+CD24- cDC i cDC CD11b-CD24+, z których oba wyrażają wyższe poziomy MHC klasy II i cząsteczek kostymulujących niż pDC2. Z drugiej strony wykazano, że dojrzałe pDC selektywnie eksprymują Siglec-H i BST24. Funkcjonalnie cDC są lepszymi komórkami prezentującymi antygen niż pDC; jednak pDC mogą wytwarzać ogromne ilości interferonu typu I po zakażeniu wirusem lub stymulacji zapalnej5.
Zarówno cDCs, jak i pDC są krótkotrwałe, dlatego muszą być stale uzupełniane z komórek progenitorowych w szpiku kostnym (BM)6,7. Adoptywny transfer wspólnych komórek progenitorowych szpiku (CMP) i zwykłych komórek progenitorowych limfoidalnych (CLP) do myszy śmiertelnie napromieniowanych pokazuje, że cDC i pDC mogą być generowane z obu linii8-10. Istnieje jednak podzbiór pDC, które wyrażają RAG1 / 2 i mają przegrupowane segmenty D-J w locus IgH11,12. Komórki te mają również podobieństwa molekularne z limfocytami B, w tym ekspresję markera B220, receptory wyczuwające kwasy nukleinowe (TLR7 / TLR9) i czynniki transkrypcyjne (Spib i Bcl11a)13, cechy uważane za sygnatury linii limfoidalnej. W związku z tym CLP mogą być dobrym wyborem do generowania pDC in vitro ze względu na podobieństwo linii.
Podczas gdy częstość występowania zarówno cDC, jak i pDC u ludzi i myszy jestbardzo niska6, DCs, szczególnie cDCs, mogą być generowane in vitro z BM lub komórek progenitorowych w obecności cytokin, takich jak GM-CSF11,14 lub ligand Flt3 (FL) przy użyciu systemów bezzasilających 11,15,16. Niestety, nie jest możliwe wytworzenie dużej liczby pDC in vitro przy użyciu FL11,15,16. Wcześniej wykazaliśmy, że pDC mogą być efektywnie generowane in vitro z CLP przy użyciu systemu zasilania AC-617. Zaletą zastosowania linii komórek zrębu AC-6 w systemie hodowli jest to, że zapewnia ona kontakt komórka-komórka i wydzielanie cytokin, które wspierają wytwarzanie dużej liczby pDC z CLP. Chociaż produkcja z wykorzystaniem tego systemu jest dość solidna, konieczne jest staranne odtworzenie procedur opisanych poniżej, aby zapewnić wydajne wytwarzanie pDC.

<table><tbody><tr><td>Anty-mysz Ly6g/Ly6c (PE), klon RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anty-mysz NK1.1 (PE), klon PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anti-mysz&nbsp; CD11b (PE), klonM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>marker liniowy</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD19 (PE), klon eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>marker liniowy</td></tr><tr><td>Anty-mysz B220 (PE), klon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>marker linii/FACS</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD3 (PE), klon 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD8a (PE), klon 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>marker liniowy</td></tr><tr><td>Anty-mysz MHC-II (PE), klon NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anty-mysz Ter119 (PE), klon TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), klon HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>marker linii</td></tr><tr><td>Anti-mouse M-CSFR (APC), klon AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), klon 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), klon D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), klon A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), klon N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), klon M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sortownik komórek</td></tr><tr><td>Rurka sortująca FACS&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo FlowJo LLC</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy przepływu</td></tr></tbody></table>

in vitro generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu ac-6 feeder

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) są potężnymi komórkami wytwarzającymi interferon typu I (IFN-I), które są aktywowane w odpowiedzi na infekcję lub podczas reakcji zapalnych. Niestety, badania funkcji pDC są utrudnione ze względu na ich niską częstotliwość w narządach limfatycznych, a istniejące metody wytwarzania prądu stałego in vitro w przeważającej mierze faworyzują produkcję cDC w stosunku do pDC. W tym miejscu przedstawiamy unikalne podejście do wydajnego generowania pDC z powszechnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP) in vitro. W szczególności protokół szczegółowo opisywał, w jaki sposób oczyszczać CLP ze szpiku kostnego i generować pDC poprzez kokulturację z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3. Unikalną cechą tego systemu hodowli jest to, że CLP migrują pod komórkami AC-6 i stają się komórkami tworzącymi obszar bruku, co jest krytycznym krokiem dla ekspansji pDC. Morfologicznie odrębne DC, a mianowicie pDC i cDC, zostały wygenerowane po około 2 tygodniach ze składem 70-90% pDC w optymalnych warunkach. Zazwyczaj liczba pDC generowanych tą metodą jest około 100-krotnie większa niż liczba zainicjowanych CLP. W związku z tym jest to nowatorski system, za pomocą którego można solidnie generować dużą liczbę pDC wymaganą do ułatwienia dalszych badań nad rozwojem i funkcjonowaniem tych komórek.

Z kości udowych i piszczeli jednej myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego w wieku 6-8 tygodni zazwyczaj izoluje się łącznie 4-6x107 komórek szpiku kostnego (BM). W celu wyizolowania CLP, całkowitą populację komórek BM barwi się przeciwciałami sprzężonymi z PE przeciwko markerom linii (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 oraz MHC-II), przeciwciałem anti-c-Kit-PerCP/Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC oraz anti-IL-7Rα-PE/Cy7, a następnie analizuje się i sortuje za pomocą sortera komórek. St...

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie wydajnej metody generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (PDCs) na potrzeby badań nad ich rozwojem. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii z dziedziny immunologii, takich jak mechanizmy regulujące rozwój PDCs. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania niewielkiej liczby komórek progenitorowych do wydajnego generowania dużych ilości PDCs.Implikacje tej techniki odnoszą się do terapii chorób autoimmunologicznych związanych z PDC, takich jak toczeń rumieniowaty układowy, ateoza i łuszczyca. Zaprezentowanie tej procedury będzie niezwykle pomocne dla studenta pracującego w laboratorium. Dzień przed pobraniem komórek szpiku kostnego, wysiej komórki linii stromalne AC6 w zagęszczeniu 5,9 × 10⁴ komórek na dołek w poszczególne dołki płytek 12-dołkowych, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. Następnego ranka naświetl komórki AC6 promieniowaniem gamma z dawką 3000 rad i wymień pożywkę hodowlaną na 1 mL pożywki kompletnej.Następnie umieść odpowiednią liczbę dorosłych myszy typu dzikiego szczepu C57BL/6 w kuwecie sekcyjnej i wysterylizuj zwierzęta 70% etanolem. Przenieś

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Źródło: Cruz-Adalia, A., et al. Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje transinfekcję bakteryjną poprzez interakcje limfocytów T i komórek dendrytycznych specyficznych dla antygenu. Zakażone bakteriami komórki dendrytyczne prezentujące peptyd albuminy jaja kurzego są inkubowane z limfocytami T, bezpośrednio lub oddzielone błoną. Bezpośredni kontakt umożliwia tworzenie synaps immunologicznych, umożliwiając przenoszenie...

Transinfekcja bakteryjna limfocytów T in vitro poprzez tworzenie synaps immunologicznych

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Poznaj metodę generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder. Technika umożliwia efektywną produkcję dużych ilości pDC z małej liczby komórek progenitorowych.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Przeglądaj więcej filmów