Name: Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę generowania iPSC z ludzkich limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela. Ta technika zwiększa bezpieczeństwo i skuteczność zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi i Rei Ohno z Keio University School of Medicine za pomoc techniczną. Prace te zostały częściowo sfinansowane z programu wsparcia systemów badawczo-rozwojowych w celu przyspieszenia praktycznego wykorzystania wyników badań nad zdrowiem oraz programu Highway for the Implementation of Regenerative Medicine.

1. Przygotowanie aktywowanych ludzkich limfocytów T
<ol>
	<li>Pobrać 10 ml heparynizowanej krwi pełnej od dawcy przez nakłucie żyły.
	<ol>
		<li>Uzyskanie świadomej zgody dawców przed pobraniem żyły. Nakłucie żyły musi być wykonane przez wykwalifikowany i przeszkolony personel.</li>
		<li>Z uzyskanymi próbkami krwi należy obchodzić się za pomocą sterylnego sprzętu i zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 ml heparynizowanej krwi pełnej w 10 ml D-PBS(–).</li>
	<li>Umieścić 15 ml roztworu Ficoll (Ficoll-Paque PREMIUM) w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Nałożyć warstwę 20 ml roztworu krwi przygotowanego w kroku 1.2 na roztwór Ficollu w kroku 1.3. Za pomocą pipety elektrycznej pozwól, aby roztwór krwi przygotowany w kroku 1.2 powoli spływał wzdłuż wewnętrznej ścianki probówki. Należy uważać, aby nie mieszać roztworu krwi z roztworem Ficollu.</li>
	<li>Wirować przy 400 × g przez 30 min przy suchym natężeniu ruchu. Ustawić prędkość zwalniania odśrodkowego na "niską". 
	Uwaga: Po odwirowaniu między górną mleczną warstwą plazmy a dolną przezroczystą warstwą Ficollu wyłania się biała cienka warstwa. Ta biała cienka warstwa zawiera komórki jednojądrzaste.</li>
	<li>Przenieść warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie dołączyć roztworu Ficoll.</li>
	<li>Dodać D-PBS(–) do komórek jednojądrzastych do całkowitej objętości 10 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Dodać 10 ml D-PBS(–) do komórek jednojądrzastych i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać 1 ml pożywki KBM502 do pobranych komórek jednojądrzastych i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Ponad 5 × 106 komórek jednojądrzastych można uzyskać z 10 ml heparynizowanej krwi pełnej z odpowiednią separacją za pomocą Ficollu.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 o stężeniu 10 μg/ml w D-PBS(–). Dodać roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 do płytki 6-dołkowej, namoczyć powierzchnię każdej studzienki i inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 z każdej studzienki i przemyć raz D-PBS(–) tuż przed wysiewem komórek.</li>
	<li>Jednojądrzaste komórki nasienne, które przygotowano w kroku 1.9 o gęstości 2,5 × 105 komórek/cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych przeciwciałem anty-ludzkim CD3 w pożywce KBM502. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 3–7 dni bez zmiany pożywki, aż limfocyty T osiągną zbieżność. Limfocyty T w tym okresie są zarówno zawieszonymi, jak i przylegającymi komórkami.</li>
</ol>
2. Infekuj ludzkie limfocyty T wektorami SeV
<ol>
	<li>Po 3–7 dniach hodowli zebrać aktywowane limfocyty T z istniejącą pożywką przez pipetowanie. Przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki KBM502. Policz komórki i płytkę 1,5 × 106 komórek (w 2 ml świeżej pożywki KBM502) do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem anty-CD3.</li>
	<li>Rozmrozić roztwory SeV OCT3/4-SeV/TSΔF, SOX2-SeV/TSΔF, KLF4-SeV/TSΔF i c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF na lodzie.</li>
	<li>Dodaj roztwory SeV zawierające OCT3/4-SeV/TSΔF, SOX2-SeV/TSΔF, KLF4-SeV/TSΔF i c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF indywidualnie do studzienek, każdy przy wielokrotności infekcji (MOI) 10. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez kolejne 24 godziny.</li>
</ol>
3. Usuń wektory SeV z ludzkich komórek T
<ol>
	<li>24 godziny po zakażeniu zbierz zainfekowane komórki za pomocą pipety. Jeśli istnieją przylegające komórki, można je łatwo odłączyć, wielokrotnie pipetując w górę iw dół. Przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant zawierający wektory SeV i dodać 2 ml świeżej pożywki KBM502. Ponownie płytkować komórki w każdym z dołków. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% zawartościCO2 przez dodatkowe 24 godziny.</li>
</ol>
4. Ponowne zasianie komórek na warstwie matrycy
<ol>
	<li>Przygotować roztwór matrycy błony podstawnej, rozmrażając żel do matrycy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) w temperaturze 4 °C i rozpuszczając 0,2 ml w 10 ml podłoża DMEM/F12. 
	Uwaga: Żel matrycowy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) musi rozmrozić O/N w temperaturze 4 °C, aby został całkowicie rozmrożony. Trzymaj go na lodzie do momentu tuż przed użyciem.</li>
	<li>Umieść 5 ml roztworu matrycy błony podstawnej na naczynie do szalek o średnicy 100 mm i pozostaw w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed wysiewem komórek. Do jednego eksperymentu potrzebne są co najmniej dwie talerze o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Zebrać komórki zakażone SeV przez pipetowanie, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki KBM502. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, usuń roztwór matrycy błony podstawnej ze 100-milimetrowych szalek przygotowanych w kroku 4.2 i podaj 1 × 105 i 1 × 106 komórek (w 10 ml świeżej pożywki mTeSR) na 100-milimetrowych naczyniach pokrytych matrycą z membraną podstawną. Na koniec użyj talerza, na którym łatwo zbiera się kolonie.</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 O/N.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę na 10 ml pożywki mTeSR w miąższu co drugi dzień. 
	Uwaga: Około 20-30 dni po zakażeniu pojawią się kolonie, które bardzo przypominają embrionalne komórki macierzyste (ESC).</li>
</ol>
5. Rozwiń iPSC pochodzące z limfocytów T
<ol>
	<li>Przygotować roztwór matrycy błony podstawnej, rozmrażając żel matrycowy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) w temperaturze 4 °C i rozpuszczając 0,2 ml w 10 ml pożywki DMEM/F12.</li>
	<li>Umieścić 1 ml roztworu matrycy błony podstawnej na studzience na płytce 6-dołkowej i pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed pobraniem kolonii.</li>
	<li>Napełnij 96-dołkową płytkę 20 μl pożywki mTeSR na dołek.</li>
	<li>Za pomocą pipety 20 μl wybierz kolonie przypominające ESC pod mikroskopem stereoskopowym. 
	Uwaga: Kolonie ESC i iPSC są okrągłe i płaskie, jak pokazano na rysunku 1B.</li>
	<li>Przenieś wybrane kolonie do 96-dołkowej płytki wypełnionej pożywką mTeSR w kroku 5.3.</li>
	<li>Dodać 200 μl pożywki mTeSR do każdej studzienki i ostrożnie pipetować w górę iw dół, aby rozbić kolonię na małe grudki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pipety 200 μl. Wyjąć roztwór matrycy błony podstawnej z dołka przygotowanego w 5.2 i umieścić każdą kolonię w jednym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej z 2 ml pożywki mTeSR na studzienkę.</li>
	<li>Zmieniać pożywkę na 2 ml pożywki mTeSR miąższu co drugi dzień.</li>
</ol>
6. Utrzymanie iPSC pochodzących z limfocytów T
Komórki iPS pochodzące z limfocytów T mogą być utrzymywane i przechowywane przy użyciu tych samych technik, co w przypadku ludzkich iPSC i ludzkich ESC. Gdy kolonie iPSC dorosną, rozwiń je w większe szalki, powtarzając tę samą procedurę.
<ol>
	<li>Zmieniaj pożywkę mTeSR co 1–2 dni.</li>
	<li>Gdy kolonie zlewają się co 5–7 dni, należy przejść komórki za pomocą roztworu dysocjacyjnego dla ludzkich iPSC i ludzkich ESC zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+making+induced+pluripotent+stem+cells%3A+reprogramming+a+la+carte%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte.</a> Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Sampsell-Barron, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+adaptation+and+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Minegishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optineurin+E50K-TBK1+interaction+evokes+protein+insolubility+and+initiates+familial+primary+open-angle+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma.</a> Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).</li>
<li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+induces+myofibrillar+disarray+and+contractile+vector+variability+in+hypertrophic+cardiomyopathy-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Am Heart Assoc. 3, e001263(2014).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Kishino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+peripheral+T+cells+in+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions.</a> PLoS One. 9, e97397(2014).</li>
<li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+to+vasculature%3A+a+new+class+of+efficient+gene+transfer+vector+to+the+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system.</a> FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+into+adult+rat+retinal+tissue%3A+efficient+gene+transfer+by+brief+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure.</a> Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Iida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vector%3A+vector+development+and+its+application+to+health+care+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Uirusu%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology.</a> Uirusu. 57, 29-36 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulation+of+cytoplasmically+gene+transferred+hematopoietic+cells+by+temperature-sensitive+mutant+of+recombinant+Sendai+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector.</a> Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).</li>
<li>Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vectors+as+an+emerging+negative-strand+RNA+viral+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system.</a> J Gene Med. 5, 543-553 (2003).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li>
<li>Okano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+vectors+for+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.</a> Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konkurencyjnych ani sprzecznych interesów.

Opisujemy protokół generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach bez surowicy i bez karmienia przy użyciu kombinacji matrigelu, pożywki mTeSR i wektorów SeV. W przypadku zastosowań klinicznych iPSC ważne jest, aby mieć protokół stabilnego generowania iPSC i mniej inwazyjną metodę pobierania próbek komórek. Chociaż wytwarzanie iPSC za pomocą kombinacji matrigelu i pożywki mTeSR wykazało niższą skuteczność przeprogramowania niż w przypadku pożywki zastępującej surowicę nokautującą (KSR) i komórek zasilających, ta kombinacja zapewnia stabilne wytwarzanie iPSC od dawców16. Stabilne wytwarzanie iPSC i mniej inwazyjne pobieranie próbek komórek ma tę zaletę, że jest w stanie zwiększyć liczbę dawców do wytwarzania iPSC. 
Wektory SeV, wirus o ujemnej nici RNA, nie jest zintegrowany z genomem gospodarza. W związku z tym ryzyka nowotworzenia można uniknąć na etapie indukcji czynnika przeprogramowania20-24. Dodatkowo, warunki wolne od karmnika, w których wykorzystuje się kombinację zdefiniowanej pożywki hodowlanej i matrycy zamiast warstwy paszowej, umożliwiają zminimalizowanie potencjalnego ryzyka narażenia na nieznane czynniki egzogenne. Połączenie tych technik zapewnia mniej inwazyjną i bezpieczniejszą technologię iPSC dla medycyny regeneracyjnej16.
Ważnymi krokami w tym protokole są etap aktywacji ludzkich limfocytów T (krok 1) i zakażenie ich wektorami SeV (krok 2). Jeżeli w naczyniu hodowlanym nie uzyskano kolonii podobnej do ESC w optymalnym czasie po zakażeniu SeV, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Po pierwsze, zbieganie się komórek jednojądrzastych przed aktywacją limfocytów T może nie być odpowiednie, ponieważ optymalna aktywacja limfocytów T ma kluczowe znaczenie dla infekcji SeV25,26. Zbyt duże zagęszczenie komórek jednojądrzastych prowadzi do śmierci komórki, zaburzając prawidłową aktywację limfocytów T. Zbyt małe zagęszczenie komórek jednojądrzastych zaburza również prawidłową aktywację i proliferację limfocytów T. Dlatego należy sprawdzić i odpowiednio dostosować zbieganie się komórek jednojądrzastych. Po drugie, dawka wektorów SeV może być niewystarczająca. Skuteczność indukcji kolonii iPSC zależy od dawki wirusa6. Jeżeli po zakażeniu SeV nie obserwuje się kolonii podobnej do ESC, należy rozważyć możliwość zwiększenia dawki wirusa do MOI 15-20. W przypadku zaobserwowania oznak różnicowania kolonii iPSC, częstotliwość, z jaką zmienia się pożywka, może być zwiększona do co drugi dzień lub do każdego dnia, gdy kolonie są większe. 
Ograniczenie w tym protokole polega na tym, że ta metoda nie jest wolna od wirusów. Chociaż SeV do przeprogramowania ogniw jest łatwo dostępny na rynku, użytkownicy muszą przygotować sprzęt zgodnie z odpowiednim poziomem bezpieczeństwa biologicznego. Jako inną metodę generowania iPSC bez integracji, wektory episomalne były stosowane do tej pory27-29. Chociaż wektory episomalne mogą być używane ze sprzętem o niższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego, wektory episomalne mogą wstawiać się do genomu gospodarza w bardzo niskich prędkościach. W związku z tym wymagane są dodatkowe kontrole w celu potwierdzenia zaniku transgenów, tak jak w przypadku stosowania SeV.
Jest jeszcze jedno ograniczenie, polegające na tym, że technika ta nie jest całkowicie wolna od produktów pochodzenia zwierzęcego. Niektóre substraty, takie jak matrigel, anty-CD3 mAb, roztwór dysocjacyjny i roztwór SeV, pochodzą z produktów pochodzenia zwierzęcego i dlatego wiążą się z ryzykiem przenoszenia patogenów ksenogenicznych. Jednak zmniejszenie ilości substratów pochodzenia zwierzęcego w systemie hodowli ma znaczenie dla klinicznego zastosowania technologii iPSC ze względu na mniejsze ryzyko.

iPSC przyciągnęły znaczną uwagę jako przełomowe źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej1-3. Do tej pory opisano różne metody generowania iPSC4,5. Wśród nich iPSC generowane z ludzkich limfocytów T cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na mniej inwazyjną metodę pobierania próbek komórek6-8. Ponadto iPSC pochodzące z limfocytów T zawierają rearanżacje genu receptora limfocytów T (TCR), a zatem są źródłem limfocytów T specyficznych dla antygenu9,10. Dlatego bezpieczne wytwarzanie iPSC pochodzących z limfocytów T jest przydatne w rozwoju medycyny regeneracyjnej.
Ta metoda opiera się na koncepcji zmniejszania ryzyka nieprzewidywalnej chorobotwórczości. Dla bezpiecznego klinicznego stosowania iPSC ważne jest zmniejszenie ryzyka narażenia na patogeny11. Wcześniej w wielu systemach hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych jako niezbędne odczynniki stosowano płodową surowicę bydlęcą i komórki żywicielskie12. Jednak usunięcie obu tych odczynników z systemu hodowli jest preferowane do wytwarzania iPSC, aby zmniejszyć ryzyko nieprzewidywalnej chorobotwórczości.
Dodatkowo, ta metoda ma tę zaletę, że pozwala uniknąć inwazyjnego pobierania próbek komórek od pacjentów i pracochłonnego przygotowywania komórek zasilających. Ponieważ iPSC pochodzące z limfocytów T są już z powodzeniem stosowane w badaniach nad chorobami13,14, metoda ta ma również zastosowanie i jest przydatna do generowania specyficznych dla choroby iPSC od pacjentów.
Wśród metod przeprogramowania limfocytów T, użycie wektora wirusa Sendai (SeV) jako nośnika genów jest metodą, która może generować iPSC z wysoką wydajnością7,16. Dodatkowo, ponieważ SeV jest jednoniciowym wirusem RNA i nie potrzebuje fazy DNA do replikacji, jego zastosowanie w generowaniu iPSC pozwala uniknąć uszkodzenia genomu gospodarza17-19. Dlatego opracowaliśmy protokoły generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach bez surowicy i bez karmienia przy użyciu kombinacji matrigelu, pożywki mTeSR i wektorów SeV.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz NA/LE anty-ludzka CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca frakcja frakcji V roztwór</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 średni zestaw</td><td>KOMÓRKA STEM</td><td>5850</td><td>Przed użyciem ogrzać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Roztwór dysocjacyjny</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Rozmrozić na lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160; ml Probówka wirówkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160; ml Probówka wirówkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów t przy użyciu wirusa sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Ostatnio iPSC przyciągnęły uwagę jako nowe źródło komórek do terapii regeneracyjnych. Chociaż pierwotna metoda generowania iPSC opierała się na fibroblastach skóry uzyskanych w wyniku inwazyjnej biopsji i retrowirusowej insercji genomowej transgenów, podjęto wiele wysiłków, aby uniknąć tych wad. Ludzkie obwodowe limfocyty T są unikalnym źródłem komórek do wytwarzania iPSC. iPSC pochodzące z limfocytów T zawierają rearanżacje genów receptora limfocytów T (TCR) i są źródłem limfocytów T specyficznych dla antygenu. Dodatkowo, rearanżacja receptora limfocytów T w genomie ma potencjał do oznaczania poszczególnych linii komórkowych i rozróżniania komórek przeszczepionych i dawców. Dla bezpiecznego klinicznego zastosowania iPSC ważne jest zminimalizowanie ryzyka narażenia nowo wytworzonych iPSC na działanie czynników szkodliwych. Chociaż płodowa surowica bydlęca i komórki żywicielskie są niezbędne do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, lepiej jest usunąć je z systemu hodowli, aby zmniejszyć ryzyko nieprzewidywalnej patogenności. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai, aby zmniejszyć ryzyko narażenia iPSC na niezdefiniowane patogeny. Chociaż radzenie sobie z wirusem Sendai wymaga sprzętu o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, wirus Sendai infekuje aktywowane limfocyty T bez insercji genomu, ale z wysoką skutecznością. W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmienia przy użyciu kombinacji aktywowanej hodowli limfocytów T i wirusa Sendai.

Korzystając z niniejszego protokołu, użytkownicy mogą stabilnie generować iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T. Generowanie iPSC z limfocytów T przy użyciu SeV i matrigelu wykazało wydajność reprogramowania komórek na poziomie około 0,002% – 0,005% w kilku przypadkach dawców, a SeV nie były wykrywane po kilku pasażach16. Rysunek 1A przedstawia schemat protokołu generowania iPSC pochodzących z limfocytów T w warunkach bez karmiarek z użyciem matrigelu i pożywki mTeSR. Około 20–30 dni po infekcji SeV kolonie iPSC są rozpoznawane po ich morfologii przypominającej kolonie ESC (Rysunek 1B). Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło ekspresję typowych markerów komórek pluripotencjalnych (NANOG, OCT3/4, SSEA4, TRA-1-60 oraz TRA-1-81) w iPSC pochodzących z limfocytów T generowanych w warunkach bez karmiarek (Rysunek 1C).
<img alt="Reprogramowanie ludzkich limfocytów T do iPSC; schemat i obrazy mikroskopowe analizy ekspresji markerów." src="/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A): Schemat protokołu reprogramowania limfocytów T w warunkach bez użycia komórek karmiących (feeder-free) zastosowanego w tej pracy. (B): Typowa kolonia iPSC przypominająca ESC w 27. dniu po pobraniu krwi w warunkach feeder-free. (C): Barwienie ALP oraz barwienie immunofluorescencyjne na markery pluripotencji i markery powierzchniowe (NANOG, OCT3/4, SSEA4, TRA-1-60 oraz TRA-1-81) w iPSC pochodzących z limfocytów T wygenerowanych w warunkach feeder-free. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSCs) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach bez użycia komórek karmnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, w tym w kwestii zastosowania komórek iPS w praktyce klinicznej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość hodowli komórek iPS bez wprowadzania potencjalnych czynników szkodliwych, co zmniejsza ryzyko patogenności.Znaczenie tej techniki rozciąga się na klinicznie istotne terapie oparte na komórkach iPS, ponieważ to nieinwazyjne pobieranie komórek wiąże się z mniejszym ryzykiem narażenia rozwijających się komórek iPS na niezdefiniowane patogeny. W związku z tym metoda ta może dostarczyć cennych informacji w kontekście klinicznej terapii z użyciem komórek iPS. Może ona również zostać zastosowana w innych obszarach, takich jak modelowanie warunków chorobowych.Rozpocznij przygotowanie aktywowanych ludzkich limfocytów T, rozcieńczając 10 mililitrów heparynowanej krwi pełnej z 10 mililitrami DPBS za pomocą pipety. Przenieś 15 mililitrów roztworu fol do 50-mililitrowej probówki stożkowej. Powoli pipetuj rozcieńczoną krew, prowadząc ją wzdłuż wewnętrznej ścianki probówki, aby utworzyła warstwę na powierzchni roztworu.Należy uważać, aby nie naruszyć granicy faz. Wirować probówkę z prędkością 400 ×g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu powinny być widoczne trzy warstwy: dolna warstwa klarowna, cienka biała warstwa zawierająca komórki mononuklearne oraz górna mleczna warstwa osocza.Przenieś warstwę komórek jednojądrowych do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, nie przenosząc żadnej części roztworu nad warstwą. Następnie dodaj DPBS, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Wirowarkuj probówkę przy 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Usunąć nadsącz, przemyć komórki 10 ml DPBS, odwirować probówkę z prędkością 200 ×g przez pięć minut i usunąć nadsącz. Następnie dodać do komórek 1 ml pożywki KBM 5 0 2 i policzyć je za pomocą komory licznej. Aby przygotować naczynie do hodowli komórkowej, pokryć dołki płytki 6-dołkowej roztworem przeciwciała anty-CD3 ludzkiego w stężeniu 10 µg/ml w PBS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciał z płytki i przemyć raz buforem PBS. Wysiać komórki mononuklearne w gęstości 2,5 × 10⁵ komórek na cm² w całkowitej objętości 2 ml pożywki KBM 502 w pokrytych płytkach 6-dołkowych. Inkubować komórki od 3 do 7 dni bez wymiany pożywki, aż limfocyty T osiągną konfluencję. Po upływie 3–7 dni przenieść aktywowane limfocyty T wraz z pożywką do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 ×g przez 5 minut. Usunąć nadsącz i dodać 1 ml świeżej pożywki KBM 502.Należy policzyć komórki i wysiać 1,5 × 10⁶ komórek w 2 ml pożywki KBM 502 do każdego dołka płytki 6-dołkowej pokrytej przeciwciałami anty-CD3. Następnie należy rozmrozić na lodzie roztwory wirusów Sendai: OC3SOX2, KLF4, c-MYC i L. Do każdego dołka należy indywidualnie dodać odpowiedni zmodyfikowany wirus Sendai z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 10. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie zebrać zainfekowane komórki za pomocą pipety i przenieść je do 15 ml probówki stożkowej.Odwiruj komórki przy 200 ×g przez pięć minut. Usuń supernatant i dodaj dwa mililitry świeżej pożywki KBM 5 0 2. Przenieś komórki do dołków płytki 6-dołkowej i inkubuj przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.Aby zasiać komórki, najpierw rozmrozić roztwór macierzy błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc. Rozpuścić 0,2 ml rozmrożonego roztworu w 10 ml pożywki DMEM/F12. Nalać 5 ml roztworu macierzy błony podstawnej do szalek 100 mm. Pozostawić szalki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby macierz pokryła dno naczynia przed zasianiem komórek. W tym czasie zebrać zainfekowane wirusem SAI limfocyty T do probówki stożkowej 15 ml i odwirować przy 200 ×g przez 5 minut.Następnie resuspenduj pellet w jednym mililitrze świeżej pożywki KBM 5 0 2 i policz komórki za pomocą komory licznikowej po 30-minutowym okresie inkubacji. Usuń roztwór macierzy błony podstawnej z obu płytek, a następnie resuspenduj osobno 1 × 10⁵ komórek oraz 1 × 10⁶ komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki M-T-E-S-R, która jest pożywką hodowlaną do iPSC pozbawioną komórek karmiarek. Przenieś każdą zawiesinę komórkową pipetą na osobną płytkę 100 mm.Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wymieniaj medium co drugi dzień przez okres od 20 do 30 dni. Powinny pojawić się kolonie przypominające kolonie embrionalnych komórek macierzystych.Przygotuj sześć płytek ściennych do ekspansji IPSC, inkubując jeden mililitr roztworu macierzy błony podstawnej w każdej studzience przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie obejrzyj płytki hodowlane zawierające kolonie IPSC pod stereomikroskopem i wyizoluj pojedyncze kolonie, zeskrobując je pipetą o pojemności 20 µL. Przenieś każdą kolonię do studzienki w 96-dołkowej płytce ściennej zawierającej 20 µL pożywki M-T-E-S-R.Po przeniesieniu kolonii, należy dodać 200 µL pożywki M-T-E-S-R do każdej studni i pipetować w górę i w dół, aby rozbić kolonię. Po usunięciu roztworu macierzy błony podstawnej z płytek sześciostudniowych, należy przenieść komórki z pojedynczej kolonii do każdej studni, następnie dodać 2 mL pożywki M-T-E-S-R, inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej i wymieniać pożywkę co drugi dzień, stosując hodowlę bez komórek karmiających oraz pożywki bezerumowe. iPSC zostały wygenerowane z ludzkich obwodowych limfocytów T. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało ekspresję typowych markerów komórek pluripotencyjnych, w tym nano T trzy cztery, SSEA 4, TRA 1 60 oraz TRA 1 80 1.W tych pochodnych liniach IPSE. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przeprowadzić wszystkie kroki, uwzględniając wszystkie istotne kwestie dotyczące sterylności i bezpieczeństwa biologicznego.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-peripheral-t

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film demonstruje przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) na indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) za pomocą wirusa Sendai. Wirus Sendai jest nieintegrującym się wirusem, który oferuje skuteczny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania komórek.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Poznaj metodę generowania iPSC z ludzkich limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela. Ta technika zwiększa bezpieczeństwo i skuteczność zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Przeglądaj więcej filmów