Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, w tym w jaki sposób komórki IPS mogą być stosowane w praktyce klinicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki IPS można leczyć bez włączania ewentualnej refaktoryzacji szkód, co zmniejsza ryzyko patogenności.

Implikacje tej techniki rozszerzają światowe klinicznie istotne terapie komórkowe IPS ze względu na to inwazyjne pobieranie próbek komórek w połączeniu ze zmniejszeniem ryzyka narażenia rozwijających się komórek IPS na niezdefiniowane patogeny. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w terapię kliniczną usługi IPS. Może być również stosowany w innych obszarach, takich jak warunki modelowania chorób.

Rozpocznij przygotowanie aktywowanych ludzkich limfocytów T od rozcieńczenia 10 mililitrów heparynizowanej krwi pełnej za pomocą 10 mililitrów pipety DPBS. 15 mililitrów roztworu fol do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Powoli odpipetować rozcieńczoną krew biegnącą wzdłuż wewnętrznej ścianki probówki, aby nałożyć warstwę na wierzch roztworu.

Uważaj, aby nie przeszkadzać interfejsowi. Odwirować probówkę o sile 400 razy G przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu obserwuj trzy warstwy, w tym dolną przezroczystą warstwę, cienką białą warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste i górną mleczną warstwę plazmy.

Przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów bez przenoszenia roztworu z pasującym otworem. Następnie dodaj DPBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do 10 mililitrów. Odwirować probówkę o sile 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant, umyć komórki 10 mililitrami DPBS, odwirować probówkę o temperaturze 200 razy G przez pięć minut i usunąć supernatant. Następnie dodać jeden mililitr pożywki KBM 5 0 2 do komórek i policzyć za pomocą cytometru hemologicznego w celu przygotowania naczynia do hodowli komórkowej, pokryć dołki sześciodołkowej płytki 10 mikrogramami na mililitr roztworu przeciwciała anty-ludzkiego CD three w PBS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 30 minut.

Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała z płytki ósmej i przemyć raz nasionami PBS komórki jednojądrzaste o gęstości 2,5 razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy w całkowitej objętości dwóch mililitrów pożywki KBM 5 0 2 w powlekanych płytkach sześciodołkowych, inkubować komórki przez trzy do siedmiu dni bez zmiany pożywki, w którym to momencie limfocyt T powinien osiągnąć płynność po trzech do siedmiu dniach. Przenieś aktywowane limfocyty T z pożywką do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 200 razy G przez pięć minut. Usuń SNAT i dodaj jeden mililitr świeżego podłoża KBM 5 0 2.

Policz komórki i płytkę 1,5 razy 10 do sześciu komórek w dwóch mililitrach KBM 5 0 2 pożywki do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej przeciwciałem anty CD three, a następnie rozmrozić OC trzy roztwory SOX dwa, KLF cztery i C-M-Y-C-H i L sendi na lodzie w każdym zmodyfikowanym wirusie Sendai indywidualnie do każdej studzienki i wielokrotność infekcji 10. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnie zbierz zainfekowane komórki za pomocą pipety i przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i dodać dwa mililitry świeżego podłoża KBM 5 0 2. Wymień komórki w studzienkach na płytce sześciodołkowej i inkubuj przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Aby cofnąć komórki, najpierw rozmrozić roztwór matrycy błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, rozpuścić 0,2 mililitra roztworu myślowego w 10 mililitrach pożywki DMM F 12, pięciu mililitrach roztworu matrycy błony podstawnej w 100-milimetrowych naczyniach. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut, aby matryca pokryła naczynie przed wysiewem komórek. W międzyczasie zbierz limfocyty T zakażone wirusem SAI w 15-litrowej stożkowej probówce i wiruj przy 200 razy G przez pięć minut.

Następnie ponownie zawiesić podniebienie w jednym mililitrze świeżej pożywki KBM 5 0 2 i policzyć komórki za pomocą cytometru hemologicznego po 30-minutowym okresie inkubacji. Usunąć roztwór macierzy błony podstawnej z dwóch płytek, a następnie ponownie zawiesić jeden razy 10 do piątych komórek i oddzielnie jeden razy 10 do sześciu komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki M-T-E-S-R, pożywki hodowlanej wolnej od komórek zasilających dla ipsc. Odpipetować każdą zawiesinę komórek do osobnej płytki o średnicy 100 milimetrów.

Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zmiana podłoża co drugi dzień po 20 do 30 dniach. Powinny pojawić się kolonie przypominające kolonie embrionalnych komórek macierzystych.

Przygotuj sześć płytek ściennych do ekspansji IPSC, inkubując jeden mililitr roztworu matrycy membrany podstawnej w każdej studzience przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie obejrzyj płytki hodowlane zawierające kolonie IPSC pod mikroskopem stereoskopowym i wyizoluj poszczególne kolonie, zeskrobując je pipetą o pojemności 20 mikrolitrów. Przenieś każdą kolonię do studzienki i płytki ściennej 96 zawierającej 20 mikrolitrów pożywki M-T-E-S-R.

Po przeniesieniu kolonii dodaj 200 mikrolitrów pożywki M-T-E-S-R do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić kolonię. Po usunięciu roztworu macierzy błony podstawnej z sześciu płytek dołkowych, przenieś komórki z pojedynczej kolonii do każdej studzienki, a następnie dodaj dwa mililitry pożywki M-T-E-S-R, inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych i zmieniaj pożywkę co drugi dzień przy użyciu pożywki wolnej od podajnika i pożywki wolnej od surowicy, z ludzkich obwodowych limfocytów T wygenerowano ipsc. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało ekspresję typowych pluripotencjalnych markerów komórkowych, w tym nano T trzy cztery SSEA cztery, TRA jeden 60 i TRA 180 1.

W tych pochodnych liniach IPSE. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu wszystkich kroków, biorąc pod uwagę wszystkie ważne względy sterylności i bezpieczeństwa biologicznego.