Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie przebiegu cyklu komórkowego posortowanych neuralnych komórek macierzystych oraz ich potomstwa wyizolowanych ze strefy podkomorowej transgenicznym myszy z fluorescencyjnym markerem cyklu komórkowego (FCI). Jest to realizowane poprzez wycięcie strefy podkomorowej z mózgów dorosłych myszy transgenicznych. Drugim krokiem jest dysocjacja tkanki neuronalnej do postaci zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu papainy.

Następnie różne populacje komórek neurogennych strefy podkomorowej są znakowane za pomocą przeciwciał w celu zidentyfikowania spoczynkowych komórek macierzystych układu nerwowego, aktywowanych komórek macierzystych układu nerwowego, komórek przejściowo amplifikujących oraz niedojrzałych i migrujących neuroblastów. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie FACS do bezpośredniego sortowania komórek do świeżej pożywki hodowlanej przed ich wysianiem na płytki pokryte poli-D-lizyną. W końcowym etapie stosuje się ciągłą mikroskopię wideo time-lapse, aby badać progresję cyklu komórkowego wysianych komórek, ponieważ różne komórki transgeniczne fluorescują w różnych punktach czasowych swojego cyklu komórkowego.

Połączenie techniki sortowania komórek z technologią Fuji pozwala na wizualizację i izolację różnych populacji komórek z strefy podkomorowej, co umożliwia badanie właściwości i dynamiki w dorosłym mózgu w ruchu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w kontekście starzenia się i patologii mózgu. Dzień przed eksperymentem należy dodać około 200 µL roztworu poli-D-lizyny o stężeniu 10 µg/mL do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach, aby pokryć dno studzienek, a następnie przykryć i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia.

Usunąć roztwór poli-L-lizyny i przepłukać dołki trzy razy sterylną wodą destylowaną, a następnie pozostawić płytkę do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez co najmniej dwie godziny. Jeśli płytka nie zostanie użyta natychmiast, wysuszoną i pokrytą płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie siedem dni.

Następnie należy przygotować roztwór dysocjujący z papainą i wysterylizować go, przepuszczając mieszaninę przez filtr 0,2 mikrona. Przed użyciem roztwór należy podgrzać do 37°C. Należy również przygotować roztwór inhibitora proteazy, dodając 0,7 mg/ml trypsyny w inhibitorze typu dwa do sterylnego medium TM F 12.

Przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 mikrona i podgrzej go wstępnie do 37 °C przed użyciem. Świeżo wyizolowaną strefę podkomorową z mózgu dorosłej myszy fucci red umieść w szalce Petriego zawierającej 0,6% Glucose w PBS i rozdrobnij tkankę, aż do całkowitego usunięcia dużych fragmentów. Następnie przenieś całość do probówki 15 ml i wiruj przy 200 ×g przez pięć minut.

Po zcentrygowaniu tkanki należy odlać nadsącz i zawiesić tkankę w jednym mililitrze podgrzanej papainy, uzupełnionej o 0,01 mg/ml DNase I. Mieszaninę należy inkubować przez 10 minut w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.

Następnie ponownie odwiruj próbkę przy 200 ×g przez pięć minut i odlej nadsącz. Dodaj 1 mL podgrzanego roztworu OVO MOID, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Następnie, używając końcówki do mikropipety P 1000, delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół 20 razy, aby mechanicznie rozbić posiekaną tkankę do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.

Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszaniny, co mogłoby spowodować dodatkowy stres komórek. Przenieść zawiesinę komórek przez sterylny filtr 20 µm do nowej probówki 15 ml. Przepłukać filtr komórkowy dwiema mililitrami PBS zawierającego 0,15% BSA, aby zapobiec utracie komórek.

Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przy 200 ×g przez 10 minut. Odlej nadsącz. Przeprowadź barwienie, wprowadzając najpierw komórki od każdej myszy do 100 µL PBS zawierającego 0,15% BSA.

Użyj jednej dziesiątej komórek z jednej z myszy, aby przygotować każdą z czterech kontroli zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Do każdej z probówek użytych do sortowania komórek dodaj wymienione tutaj przeciwciała pierwotne i inkubuj mieszaniny przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi przemyj komórki jednym mililitrem PBS zawierającego 0,15% BS, A, a następnie odwiruj komórki przy 200×g przez 10 minut.

Resuspenduj komórki w 200 µL PBS zawierającego 0,15% BSA na jeden mózg i przenieś je do odpowiednich probówek do sortowania. Umieść probówki do sortowania komórek na lodzie, a bezpośrednio przed sortowaniem dodaj do komórek barwnik żywotności, taki jak barwnik Hoechst 33342 w stężeniu 2 µg/mL, aby odróżnić komórki żywe od martwych.

Następnie poddaj komórki z probówki kontroli negatywnej analizie w cytometrze przepływowym i wyselekcjonuj komórki, wykorzystując parametry rozproszenia bocznego (side scatter) oraz rozproszenia przedniego (forward scatter). Wyklucz martwe komórki, bramkując jedynie frakcję negatywną, oraz dublety, wybierając impuls z frakcją negatywną. Przeprowadź analizę kontroli jednobarwnych i w razie potrzeby dostosuj napięcia fotopowielaczy.

Przeprowadź kompensację barw w oknie kompensacji oprogramowania. Uruchom trzy kontrole fluorescencji minus jedna i wyznacz bramki sortowania. Po ustawieniu wszystkich bramek posortuj znakowane komórki bezpośrednio do 100 µL pożywki.

Świeżo posortowane komórki wysiej na płytki 96-dołkowe pokryte poli-D-lizyną z gęstością od 1000 do 3000 komórek na dołek w 300 µL pożywki hodowlanej. Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej jedną godzinę.

Aby umożliwić adhezję komórek, przygotuj konfokalny skaningowy mikroskop laserowy do obrazowania, wstępnie podgrzewając dołączoną komorę z kontrolą temperatury do 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Umieść płytkę 96-dołkową w wstępnie ogrzanej komorze mikroskopu i ustaw ostrość na pierwszym dołku. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym oknie, aby wybrać acquire acquisition controls oraz DEAC acquisition.

Aby otworzyć panel TI i wybrać obiektyw plan A PO VC 20 XDIC, kliknij w elementy sterujące akwizycją (acquire acquisition controls), a następnie otwórz opcje time-lapse. Ustaw środek każdej studni jako pozycję stolika i wybierz opcję dużego obrazu (large image) o rozmiarze 7x7 mm². Obserwuj obraz mozaikowy wokół centrum każdej z nich.

Następnie ustawimy zakładkę obrazu dla dużego mozaikowego obrazu na 5% oraz ustawimy częstotliwość tak, aby zdjęcia były wykonywane co 20 minut przez 24 godziny. W ustawieniach one plus wybierz poziom napięcia fotopowielacza dla każdego rodzaju fluorescencji wymienionego na pasku menu. Wybierz akwizycję obrazów przy użyciu szybkiego skanera rezonansowego w formacie 512 na 512 pikseli i użyj DIC do wizualizacji komórek.

Następnie wybierz folder, w którym zostaną zapisane pliki danych. Kliknij przycisk run now w oknie akwizycji ND, aby rozpocząć pomiary. Śledź pracę komputera przez co najmniej jeden pełny cykl, aby upewnić się, że wszystko działa prawidłowo.

Do śledzenia fazy G1 za pomocą czerwonej fluorescencji z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse użyto myszy Fuji red. Izolowane komórki wykazują czerwoną fluorescencję podczas pierwszej fazy wzrostu i tracą kolor podczas syntezy, drugiej fazy wzrostu oraz mitozy. Lex pozytywne eeg FR pozytywne i eeg.

Komórki FR-dodatnie od myszy młodych dorosłych i w średnim wieku wysiano i śledzono za pomocą mikroskopii. Długość faz S oraz G2/M nie wykazała różnic między komórkami Lex-dodatnimi EGFR-dodatnimi a komórkami EG FFR-dodatnimi, zarówno u myszy młodych, jak i u tych w średnim wieku. Stwierdzono jednak, że długość kolejnej fazy wzrostu – od pierwszego podziału do momentu wygaśnięcia czerwonej fluorescencji – była dłuższa w starszych komórkach ze względu na wydłużenie fazy G1.

Neurosfery uzyskane pięć dni po wysiewie są mniejsze w przypadku komórek Lex-dodatnich i EGFR-dodatnich pochodzących od starszych myszy. Cały protokół nie powinien przekraczać trzech godzin w przypadku sekcji i przygotowania zawiesiny oraz kolejnych trzech godzin na sortowanie komórek przy pracy z 12 myszami. Należy pamiętać, że praca ze zbyt dużą liczbą myszy w tym samym dniu doprowadzi do wydłużenia czasu sortowania komórek, co może skutkować zwiększoną śmiertelnością lub różnicowaniem komórek.