Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie progresji cyklu komórkowego posortowanych nerwowych komórek macierzystych i ich potomstwa wyizolowanych ze strefy podkomorowej cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji transgenicznej, znanego jako myszy FCI. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie strefy podkomorowej transgenicznych mózgów dorosłych myszy transgenicznych. Drugim krokiem jest dysocjacja tkanki neuronalnej na zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą leczenia papajanem.

Następnie różne populacje komórek neurogennych strefy podkomorowej są znakowane za pomocą przeciwciał w celu identyfikacji nerwowych komórek macierzystych w stanie spoczynku, aktywowanych nerwowych komórek macierzystych, komórek wzmacniających tranzyt oraz niedojrzałych i migrujących neuroblastów. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie faktów do posortowania komórek bezpośrednio na świeżej pożywce hodowlanej przed posiewem ich na płytkach pokrytych lizyną poliD. Ostatecznie ciągła mikroskopia wideo poklatkowego służy do badania progresji cyklu komórkowego posianych komórek, gdy różne komórki transgeniczne fluoryzują w różnych punktach czasowych podczas swojego cyklu komórkowego.

Połączenie techniki sortowania komórek z technologią Fuji pozwala na wizualizację i izolację różnych populacji komórek ze strefy podkomorowej, umożliwiając badanie właściwości i dynamiki w mózgu poruszającym się u dorosłych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kontekście starzenia się i patologii mózgu Dzień przed eksperymentem. Przy około 200 mikrolitrach 10 mikrogramów na mililitr roztworu lizyny poli D do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach w celu pokrycia dna studzienek przykryj i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia.

Usuń roztwór poli D lizyny i przepłucz studzienki trzy razy sterylną wodą destylowaną przed pozostawieniem płytki do wyschnięcia w okapie przy przepływie laminarnym przez co najmniej dwie godziny. Jeśli nie zostanie natychmiast użyty. Wysuszoną powlekaną płytkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do siedmiu dni.

Następnie przygotuj roztwór dysocjacyjny papainy i wysterylizuj go, przepuszczając mieszaninę przez filtr 0,2 mikrona. Podgrzej roztwór do 37 stopni Celsjusza przed użyciem. Przygotuj również roztwór inhibitora proteazy, dodając 0,7 miligrama na mililitr trypsyny w inhibitorze typu drugiego do TM F 12 średnio sterylnego.

Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,2 mikrona i podgrzej roztwór do 37 stopni Celsjusza przed użyciem. Umieść świeżo wypreparowaną strefę podkomorową z dorosłego mózgu myszy czerwonej fucci na szalce Petriego zawierającej 0,6% glukozy w PBS, zmiel tkankę, aż nie pozostaną żadne duże kawałki. Następnie przenieś wszystko do 15-mililitrowej probówki i wiruj przy 200 razy G przez pięć minut.

Po ogarnięciu tkanki wyrzuć snat i resus. Zawieś tkankę w jednym mililitrze wstępnie rozgrzanej papainy, uzupełnionej 0,01 miligrama na mililitr DNA. Jeden. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie ponownie odwirować w temperaturze 200 razy G przez pięć minut i wyrzucić snat. Dodaj jeden mililitr roztworu Prewarm OVO MOID, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Następnie za pomocą końcówki mikropipety P 1000 delikatnie pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby mechanicznie zdysocjować zmieloną tkankę na zawiesinę jednokomórkową podczas pipetowania.

Unikaj wprowadzania do mieszaniny pęcherzyków powietrza, które spowodowałyby dodatkowy stres dla komórek. Przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr 20 mikronów w nowej 15-mililitrowej probówce. Umyj filtr komórkowy dwoma mililitrami PBS zawierającymi 0.15% BSA, aby uniknąć utraty komórek.

Następnie odwirować zawiesinę komórkową o temperaturze 200 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Wykonaj barwienie faktów, najpierw zawieszając komórki każdej myszy w 100 mikrolitrach PBS zawierających 0,15% BSA.

Użyj jednej dziesiątej komórek jednej z myszy, aby przygotować każdą z czterech kontrolek, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Dodaj wymienione tutaj przeciwciała pierwszorzędowe do każdej z probówek używanych do sortowania komórek i inkubuj mieszaniny przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyj komórki jednym mililitrem PBS zawierającego 0,15% BS, A, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G przez 10 minut.

Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach PBS zawierających 0,15% BSA na mózg i przenieść je do odpowiednich efektów. Rurki do sortowania. Umieść probówki do sortowania komórek na lodzie i dodaj niezbędny barwnik, taki jak haczykowate 3 3 2 5 8 barwienie w ilości dwóch mikrogramów na mililitr do komórek bezpośrednio przed sortowaniem komórek, aby odróżnić żywe komórki od martwych.

Następnie przeprowadź komórki w probówce kontroli ujemnej przez fakty i wybierz komórki za pomocą parametrów rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu. Wyklucz martwe komórki, bramkując tylko haki do frakcji ujemnej i dublety, wybierając impuls z frakcją ujemną. Uruchom pojedyncze elementy sterujące kolorem i w razie potrzeby dostosuj napięcia lampy powielacza zdjęć.

Wykonaj kompensację kolorów w oknie kompensacji oprogramowania. Uruchom trzy kontrolki fluorescencji minus jeden i narysuj bramki sortujące. Po ustawieniu wszystkich bramek posortuj oznakowane komórki bezpośrednio do 100 mikrolitrów kultury.

Pożywkę należy rozłożyć świeżo posortowane komórki o gęstości od 1000 do 3000 komórek na studzienkę pokrytą polipolilicyną. 96-dołkowe płytki z 300 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę.

Aby umożliwić adhezję komórek, przygotuj konfokalny laserowy mikroskop skaningowy do obrazowania, podgrzewając dołączoną komorę o kontrolowanej temperaturze do 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Umieść 96-dołkową płytkę w wstępnie rozgrzanej komorze mikroskopu i ustaw ostrość w pierwszym dołku. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie głównym, aby wybrać opcję Uzyskaj kontrolę akwizycji i Akwizycję DEAC.

Aby otworzyć pad TI i wybrać cel plan A PO VC 20 XDIC, kliknij na Przejmij kontrolę nad akwizycją, a następnie otwórz opcje poklatkowe. Ustaw środek każdej studni jako pozycję stołu montażowego i wybierz opcję dużego obrazu na siedem na siedem milimetrów kwadratowych. Obserwuj mozaikowy obraz wokół środka każdego z nich.

Dobrze ustaw nakładanie się dużego obrazu mozaiki na 5% i ustaw częstotliwość tak, aby zdjęcia były robione co 20 minut przez 24 godziny. W ustawieniach jeden plus wybierz poziom napięcia lampy powielacza zdjęć dla każdej fluorescencji wymienionej na pasku menu. Wybierz tę opcję, aby uzyskać obrazy za pomocą szybkiego skanera rezonansowego w formacie pięć 12 na pięć 12 pikseli i użyć DIC do wizualizacji komórek.

Następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wybierz przycisk Uruchom teraz w oknie Pobieranie ND, aby rozpocząć pobieranie. Śledź pracę komputera przez czas trwania co najmniej jednej pętli, aby upewnić się, że wszystko działa poprawnie.

Czerwone myszy Fuji wykorzystano do śledzenia pierwszej fazy G z czerwoną fluorescencją za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Wyizolowane komórki są czerwoną fluorescencyjną w pierwszej fazie wzrostu i naszą listę kolorów podczas syntezy, drugiej fazy wzrostu i mitozy. Lex dodatni, eeg, FR dodatni i eeg.

Komórki FR dodatnie od młodych dorosłych i myszy w średnim wieku zostały posiane i śledzone za pomocą mikroskopii. Długość fazy S i G two M nie wykazała różnicy między komórkami Lex dodatnimi EGFR i EG FFR dodatnimi zarówno u myszy, jak i myszy w średnim wieku. Stwierdzono jednak, że długość następnej fazy wzrostu od pierwszego podziału do wyłączenia czerwonej fluorescencji jest dłuższa w starszych komórkach ze względu na wzrost G o jedną fazę.

Neurosfery uzyskane pięć dni po posiewie są mniejsze w Lex dodatnich komórkach EGFR uzyskanych od starszych myszy. Cały protokół nie powinien przekraczać trzech godzin w przypadku sekcji i przygotowania faksu oraz kolejnych trzech godzin w przypadku sortowania komórek w przypadku pracy z 12 myszami. Należy pamiętać, że nasza praca ze zbyt dużą liczbą myszy tego samego dnia doprowadzi do wydłużenia czasu sortowania komórek i prawdopodobnie spowoduje zwiększoną śmierć komórek lub różnicowanie komórek.