Name: Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj metodę pęcherzyków jelitowych ex vivo do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego. Ta technika umożliwia badanie integralności bariery nabłonkowej w określonych odcinkach jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 oraz grant Hunter Medical Research Institute sponsorowany przez Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.

Wszystkie prace nad zwierzętami w tym protokole są wykonywane zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Newcastle.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzane podłoże 199 (TC199) lub zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do temperatury 37 °C. Wstępnie natlenić pożywkę przez bulgotanie 95% O2/5% CO2 . Sprawdzić, czy końcowe pH podłoża wynosi 7,3.</li>
	<li>Przygotuj szew, wycinając dwa odcinki po 5 cm dla każdego worka. Zapętl szwy w niezamknięty węzeł.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie i przygotowanie przewodu pokarmowego
<ol>
	<li>Odstaw pokarm stały na 12 godzin przed eutanazją. W razie potrzeby umieść w tym czasie zwierzęta na suplementach odżywczych w żelu.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitonu sodu ([200 mg / kg], wstrzyknięcie dootrzewnowe), a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi protokołami etycznymi i spryskaj 70% etanolem brzuch i klatkę piersiową.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj poziome nacięcie na środku brzucha i odsłoń otrzewną.</li>
	<li>Przystąp do oddzielenia i usunięcia przewodu pokarmowego, przecinając górne jelito cienkie od żołądka przy zwieraczu odźwiernika i przecinając jelito grube na krawędzi odbytu. Użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć krezkę. Umieść przewód pokarmowy we wstępnie podgrzanym, natlenionym podłożu.</li>
	<li>Zidentyfikuj odcinek jelita, który ma być oceniany pod kątem przepuszczalności (ryc. 1) i odetnij ten odcinek od reszty przewodu pokarmowego.
	<ol>
		<li>Aby zachować spójność między zwierzętami, zmierz odcinki dwunastnicy i jelita czczego w stosunku do żołądka oraz zmierz odcinki okrężnicy i jelita krętego w stosunku do jelita ślepego.</li>
		<li>Wybierając segmenty tkanki, zwróć uwagę na obecność tkanek limfatycznych związanych z błoną śluzową, takich jak łaty Peyera. Można je zidentyfikować jako małe guzki po surowiczej stronie światła.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie przepłukać zawartość świetlną odcinka jelitowego na szalkę Petriego z podgrzanym PBS (37 °C). Zawartość kału może być usunięta lub przechowywana w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy, zgodnie z życzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie worków jelitowych
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z objętością 300 μl badanego związku lub cząsteczki. W celu zapewnienia integralności błony śluzowej można użyć roztworu FITC-Dextran M.Wt. 4 400 o stężeniu 1 mg/ml. W celu zwiększenia czułości można zastosować sondy o wielkości od 4 400 do 70 000 Da. Bezpiecznie zamocuj cewnik naczyniowy dla małych zwierząt na strzykawce.</li>
	<li>Odmierz 5 cm od ujścia odcinka jelitowego i w tym miejscu zawiąż segment bezpiecznie zamknięty pętlą do szwów. Delikatnie umieść wstępnie zawiązaną pętlę szwów wokół otworu jelita i wprowadź stępiony cewnik. Pociągnąć pętlę tak, aby zabezpieczyć odcinek jelita i uwolnić objętość 300 μl ze strzykawki do jelita, upewniając się, że cały roztwór został wstrzyknięty.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij cewnik, jednocześnie pociągając za pętlę szwową, aby zabezpieczyć zamknięcie worka jelitowego. Odciąć worek jelitowy od jelita i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml natlenionej pożywki, podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
</ol>
4. Pomiar przepuszczalności
<ol>
	<li>Umieścić stożkowe rurki zawierające worki jelitowe w podgrzewanej łaźni wodnej nastawionej na 37 °C. W punktach czasowych 0, 30, 60, 90 i 120 min pobrać próbkę o objętości 100 μl z probówki stożkowej i przenieść na płytkę 96-dołkową, zastępując objętość 100 μl świeżej pożywki w każdym przypadku.</li>
	<li>Po pobraniu próbki końcowej należy rozciąć worki w miejscu szwu i na całej długości segmentu, odsłaniając powierzchnię błony śluzowej.</li>
	<li>Zmierz długość i szerokość każdego segmentu jelita. W razie potrzeby należy zamrozić segmenty i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy białkowej lub biochemicznej lub alternatywnie przechowywać w roztworze stabilizującym RNA do testów molekularnych.</li>
	<li>Skonstruuj standardową krzywą rozcieńczeń logarytmicznych dla cząsteczek oznaczonych FITC w zakresie od 1 do 1 x 10-6.</li>
	<li>Pomiar próbek i wzorców dla FITC na czytniku płytek fluorescencyjnych, wzbudzenie/emisja FITC: 495 nm/519 nm.</li>
</ol>
5. Obliczanie pozornej przepuszczalności dla każdego pojedynczego worka jelitowego
<ol>
	<li>Zamień jednostki czasu na sekundy</li>
	<li>Dla każdego punktu czasowego obliczyć skumulowane stężenie, Q 
	 
	Qt = (Ct*Vr) + (Qt sum* Vs), gdzie: 
	 
	Qt = skumulowane stężenie w czasie t 
	Ct = stężenie w czasie t 
	Vr = Głośność po stronie odbiornika 
	Qt sum = Suma wszystkich poprzednich Qt 
	Vs = objętość próbkowanej próbki 
	 </li>
	<li>Wykreślić Q w funkcji czasu (T) i obliczyć nachylenie: δQ/δt</li>
	<li>Obliczać przepuszczalność pozorną (Papp) 
	 
	Papp = (δQ/δt)/(A*Co), gdzie: 
	 
	A = Powierzchnia tkanki 
	C0 = Stężenie początkowe</li>
</ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy izolację i przygotowanie worków jelitowych w celu oceny funkcji bariery śluzówkowej ex vivo. Preparaty na woreczek jelitowy były przede wszystkim wykorzystywane w badaniach farmaceutycznych, badając wchłanianie potencjalnych leków przez jelito. Jednak ten test równie dobrze nadaje się do badania chorób jelit. Przepuszczalność jelit może się znacznie różnić w zależności od regionu i miejsca, ocena przepuszczalności pozwala lepiej zrozumieć regionalne znaczenie integralności bł...

Bariera nabłonkowa przewodu pokarmowego to powierzchnia błony śluzowej szacowana na 400m2 u dorosłego człowieka. W związku z tym jest stale narażony na wyzwania ze strony drobnoustrojów, spożywanych leków, składników odżywczych i toksyn bakteryjnych. Gospodarz musi nie tylko odróżniać tolerowane bakterie komensalne od potencjalnych patogenów, ale także zapobiegać przenikaniu tych gatunków i wydzielanych przez nie cząsteczek przez barierę nabłonkową, jednocześnie umożliwiając wchłanianie składników odżywczych. Tak więc rolą nabłonka jelitowego jest działanie jako selektywna bariera dla zawartości światła 1. Osiąga się to częściowo dzięki wrodzonemu nabłonkowi obronnemu błony śluzowej, który działa poprzez responsywny system biologiczny składający się z mechanizmów konstytutywnych i indukowalnych 2.
Utrata funkcji bariery nabłonkowej jest patologią charakterystyczną dla wielu chorób przewodu pokarmowego. Badanie in vivo funkcji bariery nabłonkowej można ocenić poprzez doustne zgłębnik cząsteczki znacznikowej, a następnie analizę surowicy 3. Jednak ta technika nie daje żadnych wskazówek co do miejsca dysfunkcji bariery. Ocena in vitro i ex vivo oporności przeznabłonkowej przy użyciu odpowiednio systemów Transwell3 i komór Ussinga 4,5 jest powszechnie stosowana jako zastępcze markery funkcji bariery nabłonkowej, ale brakuje fizjologii choroby przyczyniającej się do jej występowania w modelach zwierzęcych 6. W niniejszym protokole opisujemy model przygotowania tkanek ex vivo, który umożliwia bezpośrednią i miejscową ocenę integralności jelit i który może być wykorzystany do oceny funkcji bariery śluzówkowej na wielu poziomach. Co ważne, technika ta może być stosowana do zwierzęcych modeli choroby lub może być manipulowana farmakologicznie, aby umożliwić dogłębne badanie dysfunkcji bariery śluzówkowej.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&nbsp; Niewchłanialny szew jedwabny</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>Brak czerwieni fenolowej, ponieważ zakłóca ona fluorescencję</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco)</td> <td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>Brak czerwieni fenolowej, ponieważ zakłóca ona fluorescencję</td></tr><tr><td>N-acetylocysteiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Stosowanie przy 10 mM w pożywce</td></tr><tr><td>Cewnik naczyniowy dla małych zwierząt: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dekstran 4 400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dekstran 20 000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dekstran 70 000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Bariera nabłonkowa jest pierwszą wrodzoną obroną przewodu pokarmowego i selektywnie reguluje transport od światła do leżących poniżej przedziałów tkankowych, ograniczając transport mniejszych cząsteczek przez nabłonek i prawie całkowicie uniemożliwiając nabłonkowy transport makromolekularny. O tej selektywności decyduje śluzowa warstwa żelu, która ogranicza transport cząsteczek lipofilowych oraz zarówno receptorów wierzchołkowych, jak i ścisłych kompleksów białkowych nabłonka. Modele hodowli komórkowych nabłonka in vitro są wygodne, ale jako model brakuje im złożoności interakcji między mikrobiotą, żelem śluzowym, nabłonkiem i układem odpornościowym. Z drugiej strony, można przeprowadzić ocenę in vivo wchłaniania lub przepuszczalności jelitowej, ale testy te mierzą ogólne wchłanianie żołądkowo-jelitowe, bez wskazania swoistości miejsca. Testy przepuszczalności ex vivo z wykorzystaniem "worków jelitowych" są szybką i czułą metodą pomiaru ogólnej integralności jelit lub porównawczego transportu określonej cząsteczki, z dodatkową zaletą w postaci specyficzności miejsca jelitowego. W tym miejscu opisano przygotowanie worków jelitowych do badań przepuszczalności oraz obliczanie pozornej przepuszczalności (Papp) cząsteczki przez barierę jelitową. Technika ta może być stosowana jako metoda oceny wchłaniania leków lub do badania dysfunkcji regionalnej bariery nabłonkowej w zwierzęcych modelach chorób przewodu pokarmowego.

Niniejszy protokół może być wykorzystany do badania regionalnych zmian w funkcji bariery jelitowej w modelach zwierzęcych chorób przewodu pokarmowego. Poprzez pomiar przepływu sondy parakomórkowej przez powierzchnię śluzówkową w różnych obszarach przewodu pokarmowego7, można ocenić szczelność połączeń ścisłych nabłonka. Ponadto, poprzez zmianę charakterystyki sondy parakomórkowej pod względem wielkości (Rycina 2) lub hydrofobowości (Rycina 3), ...

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena zlokalizowanej szczelności jelit w modelach zwierzęcych chorób przewodu pokarmowego. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób układu pokarmowego, takie jak to, czy następuje utrata integralności błony śluzowej lub czy podczas choroby zwiększa się wchłanianie konkretnej cząsteczki bądź bakterii. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny konkretnych obszarów w obrębie przewodu pokarmowego. Aby przygotować przewód pokarmowy, należy rozpocząć od spryskania brzucha i klatki piersiowej myszy 70% etanolem, a następnie za pomocą nożyczek wykonać poziome nacięcie w środkowej części brzucha w celu odsłonięcia otrzewnej. Następnie należy odciąć górny odcinek jelita cienkiego od żołądka na wysokości zwieracza odźwiernika oraz jelito grube na wysokości brzegu odbytu. Następnie za pomocą pęsety należy delikatnie usunąć krezkę i umieścić przewód jelitowy w uprzednio ogrzanym, natlenionym medium. Należy zidentyfikować obszar, w którym będzie oceniana przepuszczalność, mierząc odcinki dwunastnicy i jelita czczego względem żołądka oraz odcinki okrężnicy i jelita krętego względem kątnicy, aby zachować spójność między

ex-vivo-intestinal-sacs-to-assess-mucosal-permeability-models

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Ten protokół opisuje platformę przesiewową wykorzystującą świeżo izolowane śluzówki błony śluzowej tkanki nabłonkowej policzka świń do oceny permeacji peptydów. Metoda integruje permeację GLP-1RA w obecności zwiększacza permeacji z roztworów, komór Hilltop oraz folii w komórkach dyfuzyjnych Franza i 3D-drukowanych wkładkach, wraz z histologiczną oceną śluzówki.

Zstandardyzowany ex vivo model świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Poznaj metodę pęcherzyków jelitowych ex vivo do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego. Ta technika umożliwia badanie integralności bariery nabłonkowej w określonych odcinkach jelit.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Przeglądaj więcej filmów