Name: Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę mapowania czasoprzestrzennego ruchliwości jelit w preparatach ex vivo przy użyciu systemu GIMM. Technika ta umożliwia wizualizację złożonych wzorców motoryki jelitowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DMK było wspierane przez grant IRACDA od NIGMS (K12GM093857) dla Virginia Commonwealth University. Praca ta była wspierana przez grant NIDDKD DK34153 dla Johna R. Gridera.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Virginia Commonwealth zatwierdził wszystkie zwierzęta i procedury eutanazji stosowane w tym protokole.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 4 l buforu Krebsa (w składzie: [w mM]: 118 NaCl, 4,75 KCl, 1,19 KH2PO4, 1,2MgSO4, 2,54 CaCl2, 25NaHCO3, 11 glukozy). Odważ odpowiednie ilości każdej stałej substancji chemicznej, umieść w odpowiedniej objętości wody dejonizowanej i mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.</li>
	<li>Następnie napowietrzać roztwór karbtlenem (95%O2, 5% CO2) przez 30 minut, podgrzewając do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Oznaczyć pH roztworu w temperaturze 37 °C (tej samej temperatury co w łaźni organowej) i w razie potrzeby dostosować do pH 7,4 przy użyciu HCl. Utrzymywać bufor Krebsa w stanie ciągłego karbontowania i w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania doświadczenia.</li>
	<li>Umieść rurki doprowadzające i odpływowe z pomp perystaltycznych do zbiornika buforowego i włącz pompy perystaltyczne, aby rozpocząć perfuzję buforu w całym systemie rurek i kąpieli narządowych. 
	UWAGA: Bufor może być początkowo pompowany z powrotem do oryginalnego pojemnika do momentu dodania tkanki do kąpieli narządowej lub substancji chemicznych do buforu perfuzyjnego. Zmniejsza to całkowitą ilość bufora wymaganego do eksperymentowania. Następnie wychodzące linie perfuzyjne buforu należy umieścić w pustym pojemniku, tak aby przychodzące i wychodzące nie mieszały się.</li>
	<li>Skalibrować temperaturę systemu grzewczego w cyrkulatorze kąpielowym tak, aby bufor w łaźni narządowej osiągnął i pozostał na poziomie 37,0 ± 0,5 °C przez cały czas trwania eksperymentu. Potwierdzić i w razie potrzeby zmodyfikować pH buforu Krebsa co najmniej jeszcze raz przed umieszczeniem segmentów tkanek w kąpieli w kroku 2.8.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Poddaj świnkę morską eutanazji poprzez wdychanie/uduszenie dwutlenkiem węgla w szczelnej komorze lub inną metodę eutanazji zatwierdzoną przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.</li>
	<li>Po potwierdzeniu eutanazji zwierzęcia należy rozciąć ścianę brzucha wzdłużnie nożyczkami preparacyjnymi i zlokalizować jelita. Przeciąć krezkę przyczepioną do jelita cienkiego, aby odsłonić jelito ślepe. 
	UWAGA: Aby potwierdzić eutanazję, wykonaj wtórną procedurę, taką jak torakotomia obustronna, zatwierdzoną przez komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.</li>
	<li>Zlokalizuj dystalny koniec jelita ślepego i przetnij bliższą okrężnicę tuż dystalnie do jej połączenia z jelitem ślepym. Następnie ponownie przeciąć proksymalną okrężnicę ~ 8 cm dystalnie do pierwszego przecięcia.</li>
	<li>Umieść tkankę jelita grubego w podgrzanym i nawęglanym roztworze Krebsa (opisanym w sekcji 1) w celu dalszej sekcji. Przypnij okrężnicę do wanny rozwarstwiającej i użyj mniejszego zestawu nożyczek, aby usunąć jak najwięcej krezki i tłuszczu.</li>
	<li>Z podgrzewanej tacki preparacyjnej usuń całą zawartość śródświatełkową, delikatnie perfuzję buforu Krebsa przez światło za pomocą strzykawki połączonej z cewnikiem końcowym (aby zapobiec perforacji tkanki). Unikaj nadmiernego rozciągnięcia segmentu podczas tego procesu perfuzji.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w dwa cewniki szklane wypolerowane ogniowo (średnica 3 mm) i umieścić krótki kawałek rurki polietylenowej (o długości ~ 3 mm i średnicy ~ 3 mm) wokół części szklanej rurki wchodzącej w światło tkanki. 
	UWAGA: Pozwoli to na umieszczenie szwu wokół tkanki, a szklana rurka pozostanie bezpieczna i nie ześlizgnie się podczas umieszczania preparatu w kąpieli narządowej oraz podczas zmian długości tkanki.</li>
	<li>Wprowadzić jeden cewnik do ustnego końca preparatu tkankowego i zawiązać szew wokół małego kawałka rurki otaczającej cewnik za pomocą węzła chirurgicznego. Delikatnie spróbuj wyciągnąć cewnik z powrotem, aby upewnić się, że węzeł jest dobrze dopasowany. Następnie wykonaj tę samą czynność na drugim cewniku wchodzącym do brzusznego końca tkanki.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu cewników przenieś cały preparat (tkankę i cewniki) z tacki preparacyjnej do jednej z kąpieli narządowych. Umieścić preparat w kąpieli końcówką ustną skierowaną w stronę przeciwną do użytkownika.</li>
	<li>Następnie zamontuj/przymocuj cewniki szklanej rurki do kąpieli narządowej za pomocą jednej z dwóch sugerowanych metod. 
	UWAGA: Zabezpieczenie szklanych probówek zapobiega zmianie długości segmentu tkanki podczas eksperymentu lub wydostaniu się ponad poziom powierzchni buforu Krebsa w kąpieli.
	<ol>
		<li>Opcja A: Przymocuj górną część szklanej rurki do górnej części boku plastikowej wanny organowej za pomocą glinki do formowania lub plastikowego klipsa.</li>
		<li>Opcja B: Przymocuj szklane rurki do metalowych słupków, które utrzymują kamery nad przygotowaniem do kąpieli organowej za pomocą plastikowych klipsów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przymocowaniu cewników do wanny przymocuj 5-centymetrowy kawałek rurki do otwartego końca każdego cewnika. W przypadku cewnika doustnego podłącz tę rurkę do strzykawki o pojemności 10 ml, która będzie używana do wstrzykiwania buforu do światła bliższego odcinka okrężnicy. W przypadku cewnika aboralnego ten kawałek rurki pozwoli na skierowanie odpływu światła do pojemnika zbiorczego (zlewka 50 ml, zbiornik itp.).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki przymocowanej do końcówki ustnej powoli przepłucz podgrzany bufor Krebsa przez światło tkanki, aby upewnić się, że płyn może przepływać przez tkankę. Przepływ potwierdza płyn wychodzący z cewnika aborowego. Skalibrować system zapisu wideo (sekcja 3 protokołu), podczas gdy tkanka równoważy się przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Kalibracja systemu nagrywania wideo
<ol>
	<li>Skalibruj ustawienie wysokości kamery, ustawienia wideo dotyczące jasności i kontrastu oraz odległości w poziomie za pomocą oprogramowania. 
	UWAGA: Najlepsze ustawienia dla konfiguracji perfuzji śródświetlnej różnią się od ustawień używanych do określania prędkości napędu granulek 13.</li>
	<li>Kliknij zakładkę eksperymentu, aby zainstalować kamerę, która ma zostać skalibrowana. Następnie w menu "Plik" kliknij "Kalibruj".</li>
	<li>Gdy film pojawi się w oknie "kalibracja stacji roboczej", ustaw kamerę na wysokości, na której obraz obejmuje końce cewników wprowadzonych w światło okrężnicy.</li>
	<li>Następnie skalibruj odległość poziomą wyświetlaną na obrazie za pomocą przezroczystej naklejki linijki dołączonej do każdej wanny. 
	UWAGA: Ta kalibracja ma kluczowe znaczenie dla późniejszych obliczeń programowych średnicy światła i prędkości fal skurczowych.</li>
	<li>W tym samym oknie "kalibracja stacji roboczej" ustaw czerwone pionowe linie pomocnicze tak, aby były oddalone od siebie o 10 mm zgodnie z linijką na obrazie z kamery. Następnie wpisz odpowiednią odległość (10 mm) w oknie "kursory odległości" i kliknij przycisk "CAL".</li>
	<li>Następnie dostosuj suwaki wzmocnienia, jasności i migawki w oknie "kalibracja stacji roboczej", aby zmodyfikować obraz z kamery tak, aby segment tkanki wyglądał jak ciemna sylwetka na jasnym tle. 
	UWAGA: Rysunek 4 przedstawia dobre i złe przykłady tej procedury kalibracji.</li>
	<li>Aby prawidłowo wyregulować obraz, wyreguluj również pokrętła ostrości i przysłony na samym aparacie.</li>
	<li>Kalibracja została zakończona. Kliknij "Zapisz", następnie kliknij "OK" w wyskakującym okienku, a na koniec kliknij przycisk "WYJDŹ".</li>
</ol>
4. Ogólne procedury eksperymentalne
<ol>
	<li>Po zakończeniu procedur kalibracji kamery i 30 minutach równoważenia tkanek nazwij badania w każdym protokole eksperymentalnym. Nazwy badań mogą być oparte na nazwie i stężeniu związku oraz objętości płynu przenikającego śródświetlnie do segmentu tkanki podczas tej części eksperymentu.</li>
	<li>Następnie należy zatkać rurkę wystającą z cewnika brzusznego za pomocą zacisku rurkowego. 
	UWAGA: Zapobiega to wydostawaniu się cieczy luminalnej na zewnątrz końca przewodu pokarmowego podczas dalszych eksperymentów, umożliwiając użycie określonych objętości w świetle w celu wywołania różnych poziomów rozprężenia (ryc. 1).</li>
	<li>Wstrzyknąć około 0,7 ml buforu Krebsa do bliższego światła okrężnicy, aby zapewnić wystarczające rozdęcie do zainicjowania skurczów napędowych w preparacie ex vivo świnki morskiej. 
	UWAGA: Objętość ta może się nieznacznie różnić (0,1 - 0,2 ml) w zależności od całkowitej długości nienaruszonego segmentu i stopnia rozciągnięcia zastosowanego do segmentu w kąpieli narządowej.</li>
	<li>Gdy segment zostanie rozdęty przez płyn świetlny, włącz kamerę, a następnie rejestruj ruchliwość przez określony czas (np. 10 minut).
	<ol>
		<li>W szczególności kliknij dwukrotnie odpowiednio nazwaną próbę, aby otworzyć eksperymentalny widok kamery, a następnie kliknij przełącznik w pozycji "ON", aby wyświetlić pole kamery. Następnie kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie (przycisk nagrywania pozostanie czerwony, gdy kamera nagrywa) i ponownie kliknij przycisk nagrywania, aby zatrzymać nagrywanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod koniec tej wstępnej próby rozdęcia kontrolnego poluzuj/usuń zacisk zamykający cewnik brzuszny, aby umożliwić segmentowi tkanki wypchnięcie rozdętego płynu ze światła.</li>
	<li>Po 10-minutowym okresie przywracania równowagi powtórzyć tę procedurę z dowolnym z różnych składników odżywczych, środków bioaktywnych, leków lub agonistów/antagonistów w płynie luminalnym w celu modyfikacji ruchliwości układu napędowego segmentu (np. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe lub kwas dekanowy) 10,18.
	<ol>
		<li>Aby pomóc ocenić, kiedy nowy płyn eksperymentalny dostanie się do segmentu okrężnicy, pozostaw pęcherzyk powietrza w pobliżu portu strzykawki, tak aby po perfuzji nowego roztworu do światła okrężnicy postęp pęcherzyka pozwolił użytkownikowi wiedzieć, kiedy eksperymentalny płyn osiągnął światło.</li>
		<li>Kontynuować perfuzję śródświateł z otwartym cewnikiem aboralnym, aż pęcherzyk zostanie całkowicie przepchnięty przez system perfuzji światła (może wymagać 2-3 ml perfuzatu). Następnie pozwól segmentowi tkanki wydalić płyn przez otwarty cewnik brzuszny przez maksymalnie 5 minut. 
		UWAGA: Po tej procedurze światło będzie zawierało znikomą objętość płynu, co pozwoli na perfuzję znanej objętości płynu do światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zatkać rurkę cewnika światła jamy ustnej za pomocą zacisku rurkowego (jak w kroku 4.3), wstrzyknąć przez strzykawkę taką samą objętość płynu rozdętego, jak w stanie kontrolnym. Zapisz wzorce ruchliwości w okresie eksperymentalnym w celu późniejszej analizy i porównania z kontrolnym stanem Krebsa (jak w kroku 4.5).</li>
	<li>Powtórzyć sekcje 4.4 - 4.7 protokołu z różnymi związkami luminalnymi lub różnymi stężeniami tego samego związku luminalnego.</li>
</ol>
5. Budowa map czasoprzestrzennych (STmaps)
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania eksperymentu kliknij dwukrotnie nazwę konkretnego badania, aby otworzyć okno analizy do budowy STmap.</li>
	<li>W obszarze odtwarzania wideo dostosuj suwaki kontrastu i jasności w oknie analizy, aby obraz był odpowiedni do analizy (sylwetka czarnej tkanki na jasnym tle; Rysunek 4). 
	UWAGA: Jeśli kalibracja kamery nie została wykonana prawidłowo przed rozpoczęciem eksperymentu, obraz może być w tym momencie zmodyfikowany tylko w mniejszym stopniu.</li>
	<li>Po prawidłowym skontrastowaniu obrazu ustaw poziome i pionowe czerwone linie pomocnicze w oknie obrazu wideo, aby wyizolować obszar tkanki do analizy i usunąć obszary zawierające artefakty. Należy również wybrać odpowiedni segment czasu z nagrania, określając punkty czasu rozpoczęcia i zakończenia analizy.
	<ol>
		<li>W szczególności wybierz punkt początkowy i końcowy w filmie za pomocą zielonych przycisków "A" i żółtych "B" w oprogramowaniu do analizy. Ustaw suwak czasu na początku segmentu wideo do analizy, a następnie kliknij zielony przycisk "A". Następnie ustaw suwak na końcu segmentu do analizy i kliknij żółty przycisk "B".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie kliknij zakładkę "analiza silnika", aby otworzyć okno STmap i kliknij przycisk "stoper". Po kliknięciu stopera, następnie kliknij kursor krzyżyka w czarnej sylwetce tkanki w nagranym filmie, aby rozpocząć generowanie STmap.</li>
	<li>Po kliknięciu krzyża nitkowego w sylwetce tkanki, oprogramowanie generuje i wyświetla STmap dla tego regionu wideo. 
	UWAGA: Może to potrwać kilka minut w zależności od długości filmu wybranego do analizy.</li>
	<li>Kliknij "powiększenie", aby wyświetlić powiększony obraz STmap i elementy sterujące, aby dostosować obraz.
	<ol>
		<li>Kliknij opcję "kolor" w nowo utworzonym oknie, aby wyświetlić STmap jako kolor, a nie w skali szarości. Kliknij także opcję "Włącz", aby móc umieścić kursor na określonych pikselach na mapie i wyświetlić śledzenie zmiany średnicy światła dla tego konkretnego obszaru tkanki. Kliknij "Wyjdź" po zakończeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj STmap do wykorzystania w artykułach lub prezentacjach lub do dalszej analizy w ImageJ, wybierając menu "Plik", a następnie wybierz "Eksportuj dane", a następnie "Meta File". Następnie nazwij STmap, który zostanie zapisany jako plik .emf i kliknij przycisk "Zapisz".</li>
	<li>Alternatywnie zapisz obrazy STmap, przechwytując zrzut ekranu. Jest to konieczne, aby zapisać pseudo-kolorowe wersje STmap.</li>
</ol>
6. Analiza prędkości fali skurczowej w STmaps
<ol>
	<li>Aby przeanalizować prędkość propagacji skurczu lub czas trwania skurczu, najpierw przekonwertuj plik STmap .emf na formaty .tiff, .gif, .jpg lub .bmp, które są akceptowane przez ImageJ za pomocą wybranego programu do konwersji plików. 
	UWAGA: ImageJ nie otwiera wyjścia w formacie .emf STmaps z oprogramowania.
	<ol>
		<li>Alternatywnie użyj oprogramowania do przechwytywania zrzutów ekranu, aby zrobić zdjęcie STmap na ekranie i zapisać je w odpowiednim formacie pliku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie otwórz ponownie sformatowaną mapę STmap w ImageJ, a następnie otwórz wtyczkę GIMMProcessor, otwierając menu "Wtyczki" i wybierając "GIMMProcessor". Spowoduje to otwarcie okien "GIMMProcessor" i "Tabela pomiarów".</li>
	<li>Kliknij "prostokątne narzędzie do zaznaczania" w oknie ImageJ, a następnie użyj go do obrysowania, klikając i przeciągając cały obszar paska skali w prawym górnym rogu STmap. Po wybraniu tego regionu kliknij przycisk "ustaw kalibrację" we wtyczce. Na koniec włóż odpowiednią odległość (mm) i czas (s) do pola kalibracji zgodnie z wartościami na pasku skali i kliknij "Gotowe".</li>
	<li>Następnie kliknij narzędzie do rysowania linii w oknie ImageJ. Narysuj linię na STmap przechodzącą przez środek propagacji skurczu wzdłuż kąta nachylenia, klikając i przeciągając obraz STmap. Alternatywnie narysuj pionową linię przechodzącą przez pasmo nierozprzestrzeniającego się skurczu, aby określić czas trwania skurczu.</li>
	<li>Po odpowiednim narysowaniu linii (w danym momencie może być narysowana tylko jedna linia), kliknij przycisk "wykonaj pomiar" we wtyczce, aby wygenerować odczyt odległości poziomej, odległości pionowej i nachylenia linii, które odpowiadają odpowiednio długości (mm), czasowi (s) i prędkości (mm/s). Dane te są wyświetlane w oknie 'Tabela pomiarów'.</li>
	<li>Powtórz kroki rysowania linii i analizy wiele razy w ramach danej mapy STmap i zapisz dane jako plik .gmd. Kliknij przycisk "Zapisz" we wtyczce i nazwij plik. Następnie ponownie kliknij "Zapisz", aby zakończyć proces. Dane te można później porównać z innymi danymi z badania lub wykorzystać do ponownego narysowania linii na mapie STmap.</li>
</ol>

Catamount Research and Development, Inc., twórca systemu GIMM, pokrył opłaty za publikację tego manuskryptu.

Motoryka jelit została obejrzana i opisana z wielu perspektyw w oparciu o charakter rejestrowanych parametrów. Nagrywanie wideo i mapowanie czasoprzestrzenne okazały się cennym narzędziem, które umożliwia analizę ogólnego ruchu i/lub napędu na długich odcinkach jelita, a także analizę aktywności w określonych punktach wzdłuż tego segmentu. Podejście przyjęte do rejestracji wideo i mapowania czasoprzestrzennego może być dwojakie i odzwierciedla badany obszar oraz charakter zawartości światła. W odcinkach jelita, w których treść światła jest bardziej płynna, oraz w bliższej części jelita grubego, gdzie treść jest bardziej półstała, aktywność jest indukowana przez doświetlne wprowadzenie płynu za pomocą bolusa lub wlewu. Mapy czasoprzestrzenne wykonane z tych nagrań wideo są zaprojektowane tak, aby przedstawiać ruch całego segmentu, jak opisano powyżej. W przeciwieństwie do tego, w środkowej i dalszej części okrężnicy, gdzie zawartość jest bardziej stała, aktywność jest inicjowana przez wprowadzenie osadu kałowego (naturalnego granulatu pokrytego żywicą epoksydową lub sztucznego osadu), a mapy czasoprzestrzenne są zaprojektowane tak, aby odzwierciedlić ruch osadu przez okrężnicę, jak pokazano w artykule JOVE Hoffmana i wsp. 13. W związku z tym przygotowanie eksperymentu i analiza są kluczowe i zależą od rodzaju bodźca i badanego regionu. W związku z tym kluczowymi etapami generowania i analizy czasoprzestrzennych map ruchliwości jelit indukowanej płynem są: 1) prawidłowe usunięcie krezki z wypreparowanej tkanki; 2) prawidłowa kalibracja obrazu przed nagraniem; 3) prawidłowe usuwanie artefaktów podczas generowania i analizy STmap; 4) prawidłowe ustawienie systemu analizy; oraz 5) uzyskanie sprawności manualnej w zakresie cewnikowania i zszywania segmentów bez ich uszkadzania.
Podczas gdy zastosowanie STmap średnicy światła poprawiło zdolność do wizualizacji i analizy wzorców pełnej ruchliwości w regionie jelita, technika ta najlepiej sprawdza się w połączeniu z funkcjonalnymi pomiarami ciśnienia lub skurczu mięśni 2,15,20. Na przykład, podczas gdy niektóre skurcze mięśni mogą nieznacznie zmieniać średnicę światła i być widoczne na niektórych STmapach (tj. zmarszczkach miogennych), mogą w rzeczywistości nie powodować żadnego napędu ani mieszania treści jelitowej 25. Nie można tego stwierdzić bez sprzężenia tej techniki z innymi pomiarami funkcjonalnymi. Również charakter wielu preparatów tkankowych w tego typu systemie (tj. zamknięty układ luminalny lub stała perfuzja światła przez system pompy) prowadzi do artefaktów w STmaps. W związku z tym użytkownik musi być świadomy tego, w jaki sposób jego specyficzne przygotowanie narządu i eksperyment może prowadzić do artefaktów w danych oraz sposobów uniknięcia lub wykluczenia tych artefaktów w analizie danych (np. pionowe linie wywołane krezką lub ciemna pikselizacja spowodowana niezdolnością tkanki do wydalenia płynu z systemu w zamkniętym preparacie świetlnym). Istnieje wiele metod perfuzji światła nienaruszonego odcinka jelita oprócz systemu zamkniętego. Jedną z metod jest zamiast tego użycie systemu otwartego, który utrzymuje stałe ciśnienie śródświetlne/zwrotne dzięki zastosowaniu podniesionej rurki i/lub zaworu jednokierunkowego na końcu odbytu preparatu 8-10,30. Pozwala to płynowi na wydostanie się z preparatu podczas skurczów napędowych.
Ponieważ system jest skonfigurowany głównie do wykrywania zmian średnicy światła, te skurcze lub wzorce ruchliwości, które nie wpływają znacząco na średnicę światła, są często trudne do zobrazowania za pomocą tego protokołu. Ponieważ zmiany w cieniowaniu pikseli w STmap opierają się na zmianach średnicy światła, wzorce ruchliwości, które nie powodują dużych zmian średnicy, nie będą dobrze wizualizowane w tej metodzie, jeśli silne skurcze są również obecne w tym samym nagraniu. Jak opisano w przypadku wizualizacji i analizy skurczu typu tętnienia (ryc. 3), ustawienie linii analizy w nagraniu wideo bliżej ściany tkanki może zapobiec temu problemowi. Ta metoda zmniejsza maksymalną średnicę wyświetlaną w STmap, dzięki czemu można zobrazować skurcze, które tylko minimalnie zmieniają średnicę tkanki. Inną opcją rozwiązania tego problemu jest zmiana czasu trwania analizowanego segmentu wideo, aby wykluczyć skurcze, które w dużym stopniu wpływają na średnicę światła, dzięki czemu mniejsze skurcze są łatwiej uwidocznione. Prowadzi to do potencjalnego problemu ruchliwości, który minimalnie zmienia średnicę światła, co wygląda podobnie do oddzielnej STmap, gdzie skurcze znacznie zmieniły średnicę światła. Dzieje się tak dlatego, że określenie białych pikseli na mapie opiera się na najmniejszej średnicy w danym filmie. Jeśli na filmie nie ma dużej zmienności średnicy (niewielki skurcz mięśnia okrężnego lub jego brak), bardzo małe skurcze, które nie zmieniają znacznie średnicy preparatu, mogą wyglądać podobnie do skurczów perystaltycznych z innego filmu. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę legendę rysunku w prawym górnym rogu mapy. Jeśli różnica między średnicą maksymalną i minimalną jest niewielka, ważne jest, aby porównać STmap z filmem, z którego został wygenerowany, aby określić ważność zmiany odcienia pikseli przedstawionej w STmap. W związku z tym badanie skali w połączeniu z rzeczywistym zapisem ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji mapy.
Nagrywanie wideo i mapowanie czasoprzestrzenne segmentów jelita grubego i okrężnicy zastosowano do różnych gatunków, w tym danio pręgowanego 26, myszy 25,27-30, szczura 7,9,30-33, świnki morskiej 5,6,8,13-19,24,30,32,34,35, oposa zaroślowego 12,36, królika 2,30,37,38, kurczaka 39, świni 40,41 i człowieka 42. Najszerzej badanym gatunkiem jest świnka morska. Nie jest to zaskakujące, ponieważ jelitowy układ nerwowy świnki morskiej został najpełniej scharakteryzowany i historycznie był zwierzęciem najlepiej zbadanym in vitro pod względem ruchliwości układu napędowego jelita 43. Mapowanie czasoprzestrzenne było najczęściej stosowane do rurkowatych odcinków jelit małych zwierząt; Jednak badania na królikach i świniach z wykorzystaniem zmodyfikowanych systemów wykazują zastosowanie tej metodologii do większych zwierząt. W przypadku królika podejście jest identyczne jak w przypadku mniejszych zwierząt, z wyjątkiem tego, że zastosowano większe segmenty i kąpiele narządowe 30. Podejście zastosowane u świni polegało na użyciu zewnętrznej pętli jelita od znieczulonej świni, a nie na zanurzeniu wypreparowanego segmentu tkanki w kąpieli narządowej. Ponadto STmapy zostały wygenerowane przez korelację krzyżową, a nie metodę transiluminacji stosowaną w większości badań 40. Izolowany, perfuzjonowany naczyń krwionośnych preparat pętlowy do nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego został również zastosowany do mniejszych gatunków, takich jak szczur 33. Niedawne badanie przeprowadzone przez Kuizenga i wsp. jest pierwszym zastosowaniem STmap zarejestrowanych wideo wzorców ruchliwości w segmentach ex vivo ludzkiego jelita 42; chociaż podejścia STmapping zostały zastosowane do analizy zapisów manometrycznych (ciśnienia) u ludzi in vivo 3,44. Zarejestrowane wzorce ruchliwości w tkance ludzkiej są podobne do tych już zarejestrowanych w modelach zwierzęcych przy użyciu podobnych technik i potwierdzają rozszerzenie tego podejścia na tkanki ludzkie. Warto zauważyć, że w badaniu tym połączono STmapy pochodzące z nagrań wideo z pomiarem skurczu mięśni zarejestrowanym przez przetworniki siły. Pomiar ciśnienia śródświetlnego za pomocą światłowodowego cewnika manometrycznego wprowadzonego do segmentu ex vivo został również przekształcony w STmap, co pokazuje wszechstronność STmap w wizualizacji czegoś więcej niż tylko zmian średnicy światła. To połączone podejście korelujące napięcie mięśniowe, ciśnienie śródświetlne i ruchy ścian pozwala na bardziej dogłębną analizę funkcjonalną map STmaps wygenerowanych na podstawie nagrania wideo.
Badania STmap generowanych na podstawie ruchów ścian i zmian średnicy światła (zwanych również Dmapami) pozwoliły na szczegółowe opisy wzorców ruchliwości, takich jak pulsujące fale perystaltyczne i zlokalizowane skurcze segmentowe. Podczas gdy wzorce te zostały zidentyfikowane za pomocą wcześniejszych metod eksperymentalnych, obecne podejście pozwala na bardziej precyzyjną definicję zlokalizowanych ruchów skurczowych, takich jak zmarszczki i nowe skurcze antyperystaltyczne 9,24,25,30,31,42. Konstrukcja STmap i analiza zmian we wzorcu motoryki została zastosowana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące motoryki przewodu pokarmowego jelita grubego i jelita grubego. Należą do nich: różnicowanie skurczów neurogennych i miogennych oraz określenie roli komórek śródmiąższowych Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29-31,33,37-40,42, zrozumienie złożonych interakcji między kolistymi i podłużnymi warstwami mięśni 2,7,8,11,12,32,39,40, badanie wpływu śródświetlnych składników odżywczych 10,18,19, szczepów drobnoustrojów 34 i lepkości 12,36 na różnych wzorcach ruchliwości i zrozumienie roli różnych endogennych czynników neurohormonalnych i egzogennych środków farmakologicznych 2,4-7,9,10,13-17,28,35,40 w generowaniu i modyfikacji ruchliwości. Przyszłość tej techniki polega na połączeniu jej z innymi pomiarami, w tym ciśnieniem, elektrofizjologią i napięciem/kurczliwością. Ostatnie badania często obejmowały jeden lub więcej z tych pomiarów w połączeniu z zapisem wideo i mapowaniem czasoprzestrzennym, aby dostarczyć dodatkowych szczegółów korelacyjnych 2,42. Ponadto system może być używany do pomiaru ruchliwości w innych narządach rurkowych i nierurowych. Na przykład podjęto próby pomiaru motoryki żołądka za pomocą takiego systemu, ale technika i oprogramowanie wymagają udoskonalenia, aby lepiej określić ilościowo ruchliwość w takim narządzie nierurkowym 45. Nie ma wątpliwości, że zastosowanie technik mapowania czasoprzestrzennego samodzielnie i w połączeniu z bardziej tradycyjnymi metodami analizy doprowadzi w przyszłości do bardziej dogłębnego i wszechstronnego zrozumienia motoryki przewodu pokarmowego.

W ciągu ostatnich 150 lat rozwinęły się różne metody rejestrowania i analizowania motoryki jelit 1. Obejmowały one zarówno początkowe obserwacje in vivo i opisy Williama Beaumonta i Waltera Cannona, jak i nowsze metody pomiaru i interpretacji wielomiejscowego zapisu napięcia mięśniowego, ciśnienia śródświetlnego i/lub potencjału błonowego (tj. potencjałów połączeniowych) 2-6. Te ostatnie podejścia zapewniają migawkę ogólnych wzorców ruchliwości, ale są ograniczone przez liczbę miejsc rejestracji i ważność interpolacji danych do obszarów między miejscami rejestracji.
Niedawny rozwój technik nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwił obserwację i analizę złożonych wzorców ruchliwości w całych segmentach okrężnicy i jelita ex vivo. Początkowe podejścia, po raz pierwszy opisane dla segmentów jelitowych pod koniec lat 90. 7,8, opierały się na oprogramowaniu zaprojektowanym przez badaczy do analizy nagrań wideo; Kilka grup stworzyło lub zmodyfikowało oprogramowanie do tego celu 2,8-12. Podczas gdy wiele grup wygenerowało własne pakiety oprogramowania lub wtyczki, wszystkie analizują średnice segmentu tkanki i konwertują te różne średnice na reprezentację w skali szarości. Dostępny na rynku system rejestracji i analizy zwany systemem monitorowania motoryki przewodu pokarmowego (GIMM) zapewnia podejście "pod klucz", które pozwala na analizę zarówno motoryki układu napędowego poprzez określenie prędkości wypluwki kałowej w dystalnej okrężnicy świnki morskiej 13, jak i analizę wzorców motoryki napędowej i mieszającej się z bodźcem płynnym w nienaruszonych segmentach jelita 4,5,14-19. To ostatnie podejście zależy od generowania i analizy STmap i jest opisane w tym artykule. Celem tej metody jest zwiększenie zdolności do jakościowej i ilościowej analizy różnych wzorców motoryki występujących w jelicie. Podczas gdy inne grupy używały STmap do analizy ruchliwości za pomocą własnego oprogramowania, jest to pierwszy opis tego, jak używać GIMM do analizy wzorców ruchliwości poprzez generowanie STmaps. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące: przygotowania tkanek jelitowych do rejestracji wideo, prawidłowego ustawienia parametrów zapisu wideo w celu maksymalizacji możliwości wykrywania zmian średnicy tkanki, tworzenia STmap, a także interpretacji i analizy STmap za pomocą systemu GIMM i oprogramowania ImageJ.
Opisana tutaj metoda jest specyficzna dla analizy perfuzji świetlnej płynów lub półstałych zawierających związki, które wpływają na wzorce motoryki jelit. Metoda analizy napędu granulek kałowych została opisana w pracy Mawe i współpracowników 13. Opisana tutaj ogólna metoda może być zastosowana do innych rurkowatych narządów mięśni gładkich, takich jak: jelito cienkie, naczynia krwionośne, cewka moczowa, moczowody itp. Chociaż metoda ta sama w sobie nie dostarcza danych na temat zmian ciśnienia lub napięcia mięśniowego, można ją połączyć z użyciem przetworników ciśnienia, przetworników siły lub pomiarów elektrofizjologicznych, aby zapewnić pełniejszy obraz wzorców ruchliwości, jak wykazały niektóre inne grupy 2,15,20,21.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td> <td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Do bufora Krebsa.</td></tr><tr><td>Fosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>P285</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Do buforu Krebsa.</td></tr><tr><td>Karboxygen (95% O2/5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpilki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjne Tace/naczynia</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td><td>Charles River</td><td>Szczep 051</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Bezpłatnie dostępne online.</td></tr><tr><td>Monitor motoryki przewodu pokarmowego (GIMM)</td><td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td><td></td><td>Zawiera części wymienione poniżej.</td></tr><tr>Pompy <td></td><td></td><td>perystaltyczne</td><td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Kamery</td><td></td><td></td> wannowe <td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr>Podświetlenie <td></td><td></td><td>wanny TransIllumination</td><td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Kąpiele organowe</td><td></td><td></td><td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Regulacja</td><td></td><td></td> intensywności podświetlenia <td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Procesor GIMM Wtyczka</td><td></td><td></td> ImageJ <td>dołączona do GIMM.</td></tr><tr><td>Rurki</td><td></td><td></td> polietylenowe <td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Złącza rurowe</td><td></td><td></td><td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Rurki Masterflex do pomp</td><td></td><td></td> perystaltycznych <td>w zestawie z GIMM.</td></tr><tr><td>Kąpiel grzewcza/cyrkulator</td><td></td><td></td> wody <td>w zestawie z GIMM.</td></tr></tbody></table>

mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Do rejestracji i oceny motoryki przewodu pokarmowego użyto wielu podejść, w tym: rejestrowania zmian napięcia mięśniowego, ciśnienia śródświetlnego i potencjału błonowego. Wszystkie te podejścia opierają się na pomiarze aktywności w jednym lub wielu miejscach wzdłuż jelita jednocześnie, które są następnie interpretowane w celu zapewnienia poczucia ogólnych wzorców ruchliwości. Ostatnio rozwój technik nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwił obserwację i analizę złożonych wzorców w całych segmentach okrężnicy i jelita ex vivo. Po nagraniu i zdigitalizowaniu nagrania wideo można przekształcić w STmaps, w których średnica światła jest konwertowana na skalę szarości lub kolor [tzw. mapy średnic (Dmaps)]. STmaps mogą dostarczać danych na temat kierunku ruchliwości (tj. stacjonarny, perystaltyczny, antyperystaltyczny), prędkości, czasu trwania, częstotliwości i siły wzorców ruchliwości skurczu. Do zalet tego podejścia należą: analiza interakcji lub jednoczesnego rozwoju różnych wzorców ruchliwości w różnych regionach tego samego segmentu, wizualizacja zmian wzorca ruchliwości w czasie oraz analiza, w jaki sposób aktywność w jednym regionie wpływa na aktywność w innym regionie. Nagrania wideo mogą być odtwarzane z różnymi skalami czasowymi i parametrami analizy, dzięki czemu można bardziej szczegółowo analizować oddzielne mapy ST i wzorce ruchliwości. Protokół ten szczegółowo opisuje skutki rozdęcia płynu śródświetlnego i bodźców śródświetlnych, które wpływają na generowanie ruchliwości. Zastosowanie agonistów i antagonistów receptorów luminalnych dostarcza mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób inicjowane są określone wzorce i jak jeden wzór może zostać przekształcony w inny. Technika ta jest ograniczona przez możliwość pomiaru tylko ruchliwości, która powoduje zmiany średnicy światła, bez dostarczania danych na temat zmian ciśnienia śródświetlnego lub napięcia mięśni, a także przez generowanie artefaktów w oparciu o konfigurację eksperymentalną; Chociaż metody analizy mogą wyjaśnić te problemy. W porównaniu z poprzednimi technikami, nagrywanie wideo i podejście STmap zapewnia bardziej kompleksowe zrozumienie motoryki przewodu pokarmowego.

Zrozumienie map spatiotemporalnych (STmaps) jako map średnic (Dmaps)
Choć mapy generowane tą techniką mają charakter spatiotemporalny, parametrem wizualizowanym w czasie i przestrzeni jest zmiana średnicy światła tkanki. Mapa STmap przedstawia odległość poziomą wzdłuż segmentu tkanki na osi x (w mm) oraz czas na osi y (w sec), przy czym czas początkowy znajduje się na górze, a czas końcowy na dole. W prawym górnym rogu znajduje się legenda, która wyświetla minimalną i maksymalną średnicę światła, a także skalowanie dla obu osi, x i y (Ryc. 1-4). Zatem różne odcienie pikseli w obrazie w skali szarości odpowiadają różnym średnicom światła. Ciemniejsze piksele odpowiadają większym średnicom, a jaśniejsze piksele mniejszym średnicom. W związku z tym fale skurczowe mięśnia okrężnego będą widoczne jako obszary jaśniejszej pikselacji ze względu na zmniejszenie średnicy światła (Ryc. 1 czarne strzałki). Z kolei rozszerzenie światła wynikające z rozluźnienia mięśnia okrężnego lub obecności dużego bolusa płynu spowoduje zwiększenie średnicy światła i pojawienie się ciemniejszych pikseli na mapie STmap/Dmap (Ryc. 1C białe strzałki). Dalszą dyskusję na temat tworzenia i interpretacji map STmap można znaleźć w pracy grupy Lammersa11.
Propagujące się skurcze indukowane rozciągnięciem światła
Na Rysunku 1 proksymalna część okrężnicy świnki morskiej została rozciągnięta za pomocą 0,5, 1,0, 1,5 i 2,0 ml buforu Krebsa przez 5 minut dla każdej objętości. Skurcze propagujące zostały wywołane przez wszystkie objętości ≥1,0 ml i widoczne są jako cienkie białe pasy na mapie STmap (Rysunek 1). Rozciągnięcie światła jelita powoduje inicjację skurczów propagujących. Jak pokazano na Rysunku 1, średnica światła zwiększa się wraz z większymi objętościami wewnątrzluminalnymi, a piksele w mapie STmap odpowiadające tej średnicy stają się ciemniejsze, tworząc ogólnie ciemniejsze tło. Przy pewnym stopniu rozciągnięcia aktywowany jest odruch perystaltyczny (1,0 ml; Rysunek 1), który inicjuje propulsywne fale skurczu w końcu ustnym, zmniejszające średnicę światła i przemieszczające się w stronę końca odbytowego segmentu (widoczne jako białe pasy na Rysunkach 1 i 4). Białemu pasowi reprezentującemu skurcz często poprzedza ciemny pas, który reprezentuje rozkurcz aboralny przed falą perystaltyczną (Rysunek 1C, białe strzałki). Białe i ciemne piksele odpowiadają odpowiednio komponentom skurczu wstępującego i rozkurczu zstępującego odruchu perystaltycznego 22,23. Na mapie STmap na Rysunku 1, panel A, występuje 0 fal propulsywnych przy 0,0 ml, 0 fal propulsywnych przy rozciągnięciu 0,5 ml, 3 fale propulsywne przy rozciągnięciu 1,0 ml, 6 fal propulsywnych przy rozciągnięciu 1,5 ml oraz 5 fal propulsywnych przy rozciągnięciu 2,0 ml.
Skurcze stacjonarne/mieszające indukowane składnikami odżywczymi
Fale propagujących się skurczów nie są jedynym wzorcem motoryki, który można zwizualizować za pomocą map ST. W mapach ST można zaobserwować również mieszane wzorce motoryki, takie jak segmentacja, co przedstawia odpowiedni obraz (Rysunek 2A). Wzorzec ten różni się od skurczów propagujących się. Podczas wzorców mieszanych w różnych obszarach w tym samym czasie występuje wiele małych, stacjonarnych skurczów (wizualizowanych jako wiele małych białych kwadratów w tej samej linii poziomej, które się nie stykają). Choć każdy skurcz segmentowy jest stacjonarny i nie przemieszcza się w kierunku od ust do odbytu, jak opisano w przypadku skurczów propagujących się, zdolność map ST do ilustrowania złożonych wzorców skurczowych w długich okresach czasu pozwala na wizualizację powolnej progresji skurczów w kierunku analnym w czasie (Rysunek 2A, czarna strzałka). Czas trwania każdego pojedynczego skurczu można również określić, rysując linię pionową przez biały kwadrat skurczu przy użyciu programu ImageJ i powiązanego wtyku (Rysunek 2A). W tej konkretnej mapie ST, wygenerowanej z wewnątrzjelitowej perfuzji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, średni czas trwania stacjonarnego skurczu wynosi ~ 2 sec (zakres: 1.9 do 2.1 sec). Chociaż krezka pozostająca na fragmencie tkanki może powodować artefakty w analizie, pionowe artefakty generowane przez krezkę (Rysunki 1B, 2B) mogą być wykorzystane do określenia ruchów mięśni podłużnych. Na Rysunku 1B i Rysunku 2B poziomy ruch czarnej linii pionowej wynika ze skurczu i rozkurczu mięśnia podłużnego. Ten boczny ruch mięśnia podłużnego może być wizualizowany na mapach ST jako poziome ruchy pionowych pasów generowanych przez artefakty krezki (Rysunki 1B, 2B).
Analiza map ST przy użyciu programu ImageJ i wtyczek
Zarówno prędkość rozprzestrzeniania się fali (Rycina 3), jak i czas trwania skurczu (Rycina 2) mogą zostać określone przy użyciu programu ImageJ oraz wtyczki GIMMProcessor. Na Rycynie 3 prędkość rozprzestrzeniania się fal ortogradowych i retrogradowych wynosiła ~ 0.25 mm/sec (zakres: 0.21 do 0.35 mm/sec). Jak widać na obrazie wideo powyżej mapy ST, linie analizy (czerwone linie tworzące ramkę na obrazie wideo) zostały ustawione precyzyjnie wokół jednej krawędzi segmentu tkanki, a nie wokół całego segmentu. Jest to istotne zastosowanie linii pomocniczych w oprogramowaniu. Precyzyjne ustawienie tych linii jest kluczowe dla prawidłowej analizy wideo, co zostało szerzej omówione w sekcji dyskusji. Pozwala to na wygenerowanie mapy ST, która wizualizuje miogenne skurcze pofalowane 24. Skurcze te mają pochodzenie miogenne i nie powodują znacznych zmian średnicy światła. Ponadto, za pomocą tej techniki można analizować różne kierunki rozprzestrzeniania się (ortogradowy lub retrogradowy), które są powszechne dla skurczów pofalowanych (Rycina 3). Jak pokazano na Rycynie 2, czas trwania skurczu może różnić się w zależności od regionu segmentu tkanki.
Prawidłowa analiza map STmaps
Jednym z potencjalnych problemów przy tworzeniu map ST jest możliwość powstania artefaktów wynikających z metodologii eksperymentalnej. Na przykład krezka pozostawiona na zewnętrznej stronie tkanki zwiększy odczyt średnicy dla tego segmentu tkanki, tworząc pionową czarną linię na mapie ST (ryciny 1, 2B). Obecność krezki sztucznie poszerza również mapę w skali szarości poprzez zwiększenie najszerszego pomiaru światła, co skutkuje stępieniem pomiarów kontrastu skali. Z tego powodu najlepiej jest usunąć krezkę z segmentu tak całkowicie, jak to możliwe, nie perforując tkanki. Innym możliwym artefaktem mapy ST jest biała pionowa linia spowodowana pęcherzykami powietrza w płynie w świetle jelita, których nie można skontrastować z czernią (rycina 4B). Pęcherzyki te mogą sprawić, że średnica światła będzie wydawać się mniejsza dla oprogramowania analitycznego lub mogą nakładać białe/jasne obszary na wzorce motoryki na mapie ST. Dlatego też przygotowanie segmentu tkanki i właściwe kontrastowanie nagrania wideo przed analizą są absolutnie kluczowe dla sukcesu w konstruowaniu map ST (rycina 4). Prawidłowe i nieprawidłowe ustawienia kontrastowania pokazano na rycinie 4. Należy zauważyć, że regulacja wideo zarówno podczas kalibracji kamery przed eksperymentem, jak i w oknie analizy po eksperymencie, jest kluczowa dla prawidłowego generowania i analizy map ST. Nieprawidłowa kalibracja obrazu może prowadzić do powstania map ST z nieużytecznymi danymi (rycina 4A).
<img alt="Schemat skurczu krezki; rozciąganie płynem, skurcze w trzech etapach; badanie naukowe." src="/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Fale propagujące w bliższej części okrężnicy. (A) Krzywa odpowiedzi na rozciąganie (wykonana w bliższej części okrężnicy świnki morskiej) została wykorzystana do określenia odpowiedniej objętości płynu w świetle jelita w celu zainicjowania fal propagujących w tym segmencie (białe poziome pasma). Czarne strzałki ilustrują przykłady pełnowymiarowych fal propagujących. Białe strzałki ilustrują artefakty liniowe spowodowane niepełnym usunięciem krezki. (B) Powiększony widok skurczów propagujących uzyskany dzięki generowaniu mapy ST z eksperymentu podobnego do tego w panelu A, ale z nagraniem wideo o krótszym czasie trwania. Łatwiej jest zauważyć, że skurcze postępują w kierunku od strony ustnej do odbytowej oraz zidentyfikować poprzedzające je rozluźnienie aboralne, przedstawione jako ciemny obszar przed białym pasmem, w porównaniu z panelem A. Mapa ta zapewnia również inny widok artefaktów krezki. Czerwona ramka wskazuje obszar tej mapy ST powiększony w panelu C. (C) Panel ten ilustruje jeszcze większe zbliżenie tego samego wideo i mapy co w panelu B. Białe strzałki z podpisem „Fluid Distension” wskazują ciemne piksele wynikające z rozciągnięcia światła jelita przez płyn aboralnie względem fali propagującej. Są to obszary, w których dochodzi do rozluźnienia mięśni okrężnych aboralnie względem skurczu mięśni okrężnych. Należy zauważyć, że skurcze propagujące w panelu A wyglądają jak całkowicie poziome linie ze względu na długą skalę czasową mapy. W panelach B i C skale czasowe są progresywnie krótsze, dzięki czemu fala skurczowa ma nachylenie, które można zmierzyć i podać jako prędkość ruchu fali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie ultradźwiękowe, diagramy cieniowania w skali szarości falujących rzęsek, analiza ruchu płynów." src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wyznaczanie czasu trwania skurczu za pomocą STmap. (A) Proksymalna część okrężnicy świnki morskiej wykazuje wzorzec motywności mieszającej/segmentowej w odpowiedzi na wlewanie do światła krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (maślanu). Pionowe czerwone linie zostały narysowane przez okresy skurczu w celu wyznaczenia czasu trwania skurczu przy użyciu programu Image J i wtyczki GIMMProcessor. Czarna strzałka wskazuje kierunek propagacji skurczów stacjonarnych w stronę końca anにします. (B) Skurcze propagujące w jelicie cienkim myszy często wykazują obszary skurczu utrwalonego. Pionowe strzałki naniesione na tę mapę pokazują, że obszary położone bardziej proksymalnie pozostawały w stanie skurczu przez dłuższy czas. W tym preparacie koniec analny został zamknięty, aby zapobiec wypływowi płynu z zamkniętego układu podczas skurczów tkanek. Obraz na górze panelu przedstawia moment, w którym cały koniec proksymalny tkanki jest skurczony (kolor biały na STmap), podczas gdy cały koniec analny jest rozciągnięty przez płyn (kolor czarny na STmap). Poziomy/boczny ruch pionowej czarnej linii w środku STmap w panelu B wskazuje ruch warstwy mięśni podłużnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Skalowy schemat motoryki jelit z wektorami strzałek wskazującymi analizę kierunku przepływu." src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dwukierunkowe wzorce motoryki. Fale propagujące mogą przemieszczać się zarówno w kierunku ortogradowym (od ust do odbytu), jak i retrogradowym (od odbytu do ust). Pełne czarne strzałki wskazują prawidłową propagację ortogradową, a przerywane czarne strzałki propagację retrogradową. Prędkość propagacji skurczów ortogradowych i retrogradowych w tej mapie ST została określona za pomocą analizy w programie ImageJ i wynosiła ~ 0.25 mm/sec. Linie analizy obrazu (czerwone linie tworzące prostokąt na obrazie wideo powyżej mapy ST) zostały ustawione blisko jednej krawędzi tkanki, aby zwizualizować miogenne skurcze pofalowane, które są skurczami o niskiej amplitudzie i małym zasięgu, często zorientowanymi w kierunku ortogradowym, retrogradowym lub obu jednocześnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz ultrasonografii endoskopowej w skali szarości; porównanie artefaktów, odnotowano artefakt bez kontrastu, schemat." src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Znaczenie odpowiedniego kontrastu obrazu dla generowania STmap. (A) przedstawia obraz i STmap o nieprawidłowym kontraście, natomiast panel B przedstawia obraz i STmap o prawidłowym kontraście. W (A) poziome białe pasma generowane z obrazu o prawidłowym kontraście (B) nie są tak wyraźne i występuje wiele artefaktów (białe zacienienia) wynikających z faktu, że obraz początkowy był w skali szarości. W STmap wygenerowanej z obrazu o prawidłowym kontraście (B) artefakty w postaci białych zacienień ze skali szarości znikają, a rozprzestrzeniające się fale są bardziej wyraźne. Ponadto w końcowym odcinku odbytniczym STmap, przy każdej fali skurczu, widoczne jest czarne zacienienie reprezentujące rozkurcz poprzedzający przemieszczającą się falę skurczową. W panelu B białe strzałki ilustrują artefakt STmap wygenerowany przez obszar obrazu, którego nie można było prawidłowo skontrastować. Ten rodzaj artefaktu wynika głównie z pęcherzyków wewnątrzświatowych, które sporadycznie pojawiają się w preparacie w trakcie protokołu eksperymentalnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ostatnio dostępne techniki nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zarówno propagacji, jak i mieszania wzorców motoryki jelit. Celem tego protokołu jest wyjaśnienie generowania i analizy map STmap przy użyciu systemu monitorowania ruchliwości przewodu pokarmowego (GIMM).

Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Ogólnym celem stworzenia kompleksowej mapy czasoprzestrzennej jelit ex vivo jest zbadanie odpowiedzi na treść światła jelita poprzez obserwację szczegółowego ruchu ściany jelita w obrębie całego segmentu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rejestrowania i porównywania w przestrzeni i czasie aktywności w różnych obszarach tego samego segmentu tkanki, co pozwala na identyfikację złożonych wzorców motoryki, a nie tylko prostego skurczu lub rozkurczu. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat prawidłowej motoryki jelit, może być ona również zastosowana do identyfikacji efektów działania różnych leków i czynników wewnątrzświatowych, takich jak składniki odżywcze lub wzorce motoryczne.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ początkowo mapy czasoprzestrzenne mogą być trudne do interpretacji. Jednak z czasem możliwe jest szybkie rozpoznawanie złożonych wzorców. Aby rozpocząć, należy wyciąć okrężnicę lub jelito z uśpionej świnki morskiej.Przytwierdź go szpilkami w ciepłym roztworze Krebsa. W kuwecie sekcyjnej usuń całą zawartość światła jelita, delikatnie przepłukując je buforem Krebsa. Użyj strzykawki z cewnikiem o zaokrąglonym końcu i unikaj nadmiernego rozciągania segmentu jelita grubego podczas perfuzji.Następnie przymocowano dwa odcinki rurek polietylenowych o długości 2–3 mm do dwóch kaniul szklanych o średnicy 3 mm, których końce zostały wypalone nad ogniem. W podgrzewanej kuwecie sekcyjnej jedną kaniulę wprowadzono do jamowego końca preparatu tkankowego, a następnie za pomocą węzła chirurgicznego zawiązano szew za krótkim odcinkiem rurki, opasując kaniulę. Delikatnie próbowano wycofać kaniulę, aby upewnić się, że węzeł jest ciasno zaciśnięty.Mały fragment rurki polietylenowej zapobiega przesuwaniu się szwu. Powtórz ten proces, używając drugiego cewnika na końcu aboralnym tkanki. Następnie usuń krezkę z preparatu tkankowego.Po unieruchomieniu obu cewników przenieś preparat z tacy do sekcji do jednej z kąpieli organowych GIMM i ustaw tkankę tak, aby koniec jamny był skierowany w stronę przeciwną do użytkownika. Następnie przymocuj szklane cewniki do kąpieli organowej za pomocą plasteliny modelarskiej, przytwierdzając koniec szklanej rurki do boku kąpieli, lub użyj plastikowych klipsów, aby przymocować cewniki do słupków nad kąpielą, które służą do stabilizacji kamer. Teraz do otwartego końca każdego cewnika dołącz pięciocentymetrowy odcinek rurki.W przypadku cewnika doustnego należy połączyć krótki odcinek drenu z dłuższym odcinkiem drenu za pomocą złącza Luer-lock. Następnie należy podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do złącza Luer-lock. Będzie ona służyć do wstrzykiwania buforu do preparatu tkankowego.W przypadku cewnika aboralnego należy wykorzystać dren do skierowania odpływu luminalnego do naczynia zbiorczego. Następnie, używając dołączonej strzykawki, należy powoli przepłukać tkankę ogrzanym buforem Krebsa, aby upewnić się, że przepływ jest prawidłowy, co będzie widoczne poprzez wypływ cieczy z cewnika aboralnego. Następnie należy przystąpić do kalibracji systemu rejestracji wideo, podczas gdy tkanka będzie się równoważyć przez 30 minut.Skalibruj wysokość ustawienia kamery, ustawienia wideo dotyczące jasności i kontrastu oraz odległość poziomą za pomocą oprogramowania GIMM. Kliknij zakładkę eksperymentu dla kamery, która ma zostać skalibrowana. Następnie w menu Plik kliknij Kalibruj.Gdy obraz wideo pojawi się w oknie kalibracji stacji roboczej, ustaw kamerę na takiej wysokości, aby obraz obejmował końce cewników wprowadzonych do światła jelita grubego. Następnie skalibruj wyświetlaną na ekranie odległość poziomą, korzystając z półprzezroczystej naklejki z linijką przytwierdzonej do każdego kąpielowego układu. W tym samym oknie kalibracji ustaw czerwone linie pomocnicze w pionie w taki sposób, aby odległość między nimi wynosiła 10 milimetrów.Następnie wpisz tę odległość w oknie kursora odległości i kliknij przycisk Cal. Dalej, dostosuj suwaki wzmocnienia, jasności i migawki w oknie stacji roboczej kalibracji, aby segment tkanki pojawił się jako ciemna sylwetka na jasnym tle. Następnie wyreguluj pokrętła ostrości i przysłony na samej kamerze, aby dodatkowo poprawić obraz.Aby zakończyć kalibrację obrazu, kliknij Save, a następnie Yes w oknie wyskakującym. Na koniec kliknij Exit. Po półgodzinnym okresie equilibracji rozpocznij eksperyment.Zacznij od nazwania próby eksperymentalnej. Następnie zamknij światło rurki wystającej z cewnika aboralnego za pomocą plastikowego zacisku. Po tym wstrzyknij około 7 mililitrów buforu Krebsa do światła bliższej części okrężnicy.Celem jest zapewnienie wystarczającego rozciągnięcia, aby zainicjować skurcze napędowe. Gdy segment zostanie rozciągnięty przez płyn w świetle naczynia, rozpocznij nagrywanie wideo. W oprogramowaniu dwukrotnie kliknij nazwę próby, aby otworzyć widok kamery eksperymentalnej, a następnie przełącz przełącznik w pozycję włączoną, aby wyświetlić pole widzenia kamery.Należy zebrać dane wideo o określonej długości. Po zakończeniu tej wstępnej kontrolowanej próby rozszerzenia należy poluzować lub zdjąć zacisk, aby umożliwić segmentowi tkanki wypchnięcie rozszerzającego płynu z kanału. Należy pozwolić tkance na ponowną równowagę przez 10 do 20 minut, a następnie powtórzyć procedurę z zastosowaniem preparatu.Pojedynczy preparat tkankowy może zostać poddany nawet pięciu 10-minutowym zabiegom, pod warunkiem zachowania odpowiednich przerw między testami. Należy zwracać uwagę na złuszczanie śluzówki, co sygnalizuje degradację tkanki. Aby przeanalizować zapis, należy dwukrotnie kliknąć nazwę konkretnej próby, co otworzy okno analizy służące do konstrukcji mapy ST.W obszarze odtwarzania wideo dostosuj suwaki kontrastu i jasności, aby obraz był odpowiedni do analizy. Utwórz czarną sylwetkę tkanki na jasnym tle. Następnie ustaw poziome i pionowe czerwone linie pomocnicze w oknie obrazu wideo, aby wyizolować obszar tkanki do analizy i usunąć obszary zawierające artefakty.Następnie ustaw czas analizy. Kliknij zielony przycisk A, aby zaznaczyć punkt początkowy, oraz żółty przycisk B, aby zaznaczyć punkt końcowy, gdy suwak czasu znajdzie się w odpowiednich pozycjach. Następnie wybierz zakładkę Motor Analysis, aby otworzyć okno mapy ST, a następnie kliknij przycisk stopera.Rozpocznij generowanie mapy ST, klikając kursorem w kształcie celownika w obrębie czarnej sylwetki tkanki. Generowanie mapy może potrwać kilka minut. Po utworzeniu mapy ST wybierz funkcję powiększania, aby powiększyć obraz.Następnie wybierz opcję koloru, aby wyświetlić obraz w kolorze zamiast w skali szarości. Potem zaznacz opcję włącz, aby kursor mógł być użyty do wybrania piksela do analizy. Dla tkanki powiązanej z wybranymi pikselami analiza zmian średnicy światła w czasie jest prezentowana w formie wykresu średnicy ziarna po prawej stronie mapy ST.Po zakończeniu analiz wybierz Exit. Następnie wyeksportuj mapę ST do innych celów, wybierając File, potem Export Data, a następnie Metafile. Nazwij plik i zapisz go jako plik emf, klikając Save.Mapy generowane za pomocą tej techniki pokazują zmiany średnicy światła tkanki zarówno w przestrzeni, jak i w czasie. Odległość w poziomie znajduje się na osi X, a czas na osi Y, przy czym czas początkowy jest u góry, a końcowy na dole. W prawym górnym rogu znajduje się legenda, która wyświetla minimalną i maksymalną średnicę światła, a także skalowanie dla osi X i Y.Zatem różne odcienie pikseli w obrazie w skali szarości odpowiadają różnym średnicom światła. Ciemniejsze piksele odpowiadają większym średnicom, a jaśniejsze piksele mniejszym średnicom. Fale skurczowe mięśnia okrężnego będą widoczne jako obszary o jaśniejszym upikselowaniu ze względu na zmniejszenie średnicy światła.W przeciwieństwie do tego, rozszerzenie światła spowodowane rozluźnieniem mięśni okrężnych lub dużym kęsem treści płynnej jest przedstawione za pomocą ciemniejszych pikseli. Oprócz fal propagujących się skurczów, można również zaobserwować wzorzec ruchliwości mieszającej, znany jako segmentacja. Niewielkie, stacjonarne skurcze występują jednocześnie w różnych obszarach.Z biegiem czasu te niewielkie skurcze przemieszczają się w stronę aboralnego końca analnego. Pozostająca na tkance błona krezowa może powodować powstanie artefaktów, które objawiają się jako ciemne pionowe linie. Poziomym przesunięciu tych artefaktowych linii pionowych można wykorzystać do określenia czasu ruchu mięśni podłużnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania segmentów jelit do rejestracji wideo oraz sposobów generowania późniejszej reprezentacji motoryki jelit w formie map spatiotemporalnych. Zastosowanie tej procedury pozwala na dodawanie różnych składników odżywczych do roztworu w świetle jelita, aby określić, w jaki sposób naturalne komponenty indukują specyficzne wzorce motoryki w celu ułatwienia trawienia i wchłaniania. Wykorzystanie specyficznych agonistów lub antagonistów farmakologicznych receptorów dla humoralnych czynników neuronalnych może służyć do określenia mechanizmów, poprzez które motoryka jest inicjowana i propagowana.Technika ta może pomóc w uzyskaniu danych przydatnych do wyłonienia związków stosowalnych w leczeniu zaburzeń motoryki.

spatiotemporal-mapping-motility-ex-vivo-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena motoryki okrężnicy w dystalnej części jelita grubego świnki morskiej przy użyciu monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor – GIMM) jest prostym i łatwym do opanowania podejściem do ilościowej oceny motoryki propulsywnej w przewodzie pokarmowym.

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (GIMM)

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Aby zbadać, jak jelito cienkie radzi sobie z cząstkami o różnych rozmiarach, zmodyfikowaliśmy ustaloną metodę in vivo, aby określić pasaż jelita cienkiego.

Badanie mechanowykrywania cząstek świetlnych w jesionym jelicie cienkim

Poznaj metodę mapowania czasoprzestrzennego ruchliwości jelit w preparatach ex vivo przy użyciu systemu GIMM. Technika ta umożliwia wizualizację złożonych wzorców motoryki jelitowej.

Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Przeglądaj więcej filmów