Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Ogólnym celem stworzenia kompleksowej mapy czasoprzestrzennej jelit ex vivo jest zbadanie reakcji na zawartość światła poprzez obserwację szczegółowego ruchu ściany jelita w całym segmencie. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność w różnych regionach tego samego segmentu tkanki może być rejestrowana i porównywana w przestrzeni i czasie, co pozwala na identyfikację złożonych wzorców ruchliwości, a nie prostego skurczu lub rozluźnienia. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w normalną motorykę jelit, może być również stosowana do ideedyfikacji działania różnych leków i czynników śródświetlnych, takich jak składniki odżywcze lub wzorce ruchliwości.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ początkowo mapy czasoprzestrzenne mogą być trudne do interpretacji. Ale z czasem na pierwszy rzut oka można dostrzec złożone wzory. Na początek usuń okrężnicę lub jelito z poddanej eutanazji świnki morskiej.

Przypnij go do ciepłego roztworu Krebsa. Z tacki preparacyjnej usuń całą zawartość śródświetlną, delikatnie przepuszczając bufor Krebsa przez światło. Użyj strzykawki z cewnikiem z końcem i unikaj nadmiernego rozdęcia odcinka okrężnicy podczas perfuzji.

Następnie przymocuj dwa, trzymilimetrowe odcinki rurki polietylenowej do dwóch polerowanych ogniowo cewników szklanych rurek o średnicy trzech milimetrów. W podgrzewanej tacce preparacyjnej włóż jeden cewnik do ustnego końca preparatu tkankowego i zawiąż szew za małym kawałkiem rurki, otaczając cewnik za pomocą węzła chirurgicznego. Delikatnie spróbuj wyciągnąć cewnik z powrotem, aby upewnić się, że węzeł jest dobrze dopasowany.

Mały kawałek rurki polietylenowej zapobiega ślizganiu się szwu. Powtórz ten proces, używając drugiego cewnika na brzusznym końcu tkanki. Następnie usunąć krezkę z preparatu tkankowego.

Po zabezpieczeniu obu cewników przenieś preparat z tacki rozwarstwiającej do jednej z kąpieli narządowych GIMM i umieść tkankę końcem jamy ustnej skierowanym od użytkownika. Następnie przymocuj cewniki szklanej rurki do kąpieli narządowej za pomocą gliny modelarskiej, mocując koniec szklanej rurki z boku wanny lub używając plastikowych klipsów do przymocowania cewników do słupów nad wanną służących do mocowania kamer. Teraz przymocuj pięciocentymetrowy kawałek rurki do otwartego końca każdego cewnika.

W przypadku cewnika doustnego połącz krótki kawałek rurki z dłuższym kawałkiem rurki z nasadką typu luer lock. Następnie podłącz pięciomililitrową strzykawkę do złączki typu luer lock. Zostanie on wykorzystany do wstrzyknięcia buforu do preparatu tkankowego.

W przypadku cewnika brzusznego użyj rurki, aby skierować odpływ światła do pojemnika zbiorczego. Teraz, za pomocą dołączonej strzykawki, powoli przepłucz tkankę podgrzanym buforem Krebsa, aby zapewnić dobry przepływ, co widać po płynie wychodzącym z cewnika aborcowego. Kontynuuj kalibrację systemu rejestracji wideo, podczas gdy tkanka równoważy się przez 30 minut.

Skalibruj ustawienie wysokości kamery, ustawienia wideo dla jasności i kontrastu oraz odległości w poziomie za pomocą oprogramowania GIMM. Kliknij zakładkę eksperymentu, aby zainstalować kamerę, która ma zostać skalibrowana. Następnie w menu Plik kliknij polecenie Kalibruj.

Gdy wideo pojawi się w oknie stacji roboczej kalibracji, ustaw kamerę na wysokości, na której obraz obejmuje końce cewników wprowadzonych do światła okrężnicy. Następnie skalibruj odległość poziomą wyświetlaną na obrazie na ekranie za pomocą przezroczystej naklejki linijki dołączonej do każdej wanny. W tym samym oknie kalibracji stacji roboczej ustaw czerwone pionowe linie pomocnicze tak, aby były oddalone od siebie o 10 milimetrów.

Następnie wpisz tę odległość w oknie kursora odległości i kliknij przycisk Cal. Następnie dostosuj suwaki wzmocnienia, jasności i migawki w oknie kalibracji stacji roboczej, aby segment tkanki wyglądał jak ciemna sylwetka na jasnym tle. Następnie wyreguluj pokrętła ostrości i przysłony na samym aparacie, aby jeszcze bardziej poprawić obraz.

Aby zakończyć kalibrację obrazu, kliknij Zapisz, a następnie Tak na wyskakującym ekranie. Na koniec kliknij Wyjdź. Po półgodzinnym okresie równowagi rozpocznij eksperyment.

Zacznij od nazwania badania eksperymentalnego. Następnie zatkaj światło rurki wystającej z cewnika brzusznego za pomocą plastikowego zacisku. Następnie wstrzyknąć około 7 mililitrów buforu Krebsa do bliższego światła okrężnicy.

Celem jest zapewnienie wystarczającego rozdęcia, aby zainicjować skurcze napędowe. Gdy segment zostanie rozdęty przez płyn świetlny, rozpocznij nagrywanie wideo. W oprogramowaniu kliknij dwukrotnie nazwaną próbę, aby otworzyć eksperymentalny widok kamery, a następnie kliknij przełącznik w pozycji włączonej, aby wyświetlić pole kamery.

Zbierz z góry określoną długość danych wideo. Pod koniec tej wstępnej próby kontrolowanego rozdęcia poluzuj lub usuń zacisk, aby umożliwić segmentowi tkanki wypchnięcie rozszerzającego się płynu ze światła. Pozostawiono tkankę do ponownego wyrównania przez 10 do 20 minut, a następnie powtórzono procedurę przy użyciu zabiegu.

Pojedynczy preparat tkankowy może przejść nawet pięć 10-minutowych zabiegów na odpowiednie okresy odpoczynku między badaniami. Należy pamiętać o złuszczaniu się błony śluzowej, co sygnalizuje degradację tkanki. Aby przeanalizować nagranie, kliknij dwukrotnie nazwę konkretnej próby, aby otworzyć okno analizy do budowy mapy ST.

W obszarze odtwarzania wideo dostosuj suwaki kontrastu i jasności, aby obraz był odpowiedni do analizy. Stwórz czarną sylwetkę tkanki na jasnym tle. Następnie ustaw poziome i pionowe czerwone linie pomocnicze w oknie obrazu wideo, aby wyizolować obszar tkanki do analizy i usunąć obszary zawierające artefakty.

Następnie ustaw czas na analizę. Kliknij zielony przycisk A, aby wybrać punkt początkowy, a następnie kliknij żółty przycisk B dla punktu zatrzymania, gdy suwak czasu znajdzie się we właściwych pozycjach. Następnie wybierz zakładkę Motor Analysis, aby otworzyć okno mapy ST, a następnie kliknij przycisk stopera.

Rozpocznij generowanie mapy ST, klikając kursor krzyżyka w czarnej sylwetce tkanki. Generowanie mapy może potrwać kilka minut. Po utworzeniu mapy ST wybierz funkcję powiększenia, aby powiększyć obraz.

Następnie wybierz opcję koloru, aby zobaczyć obraz w kolorze, a nie w skali szarości. Następnie wybierz opcję włącz, aby kursor mógł zostać użyty do wybrania piksela do analizy. W przypadku tkanki powiązanej z wybranymi pikselami zmiana średnicy światła w czasie jest analizowana i wyświetlana jako średnica ziarna śledzona po prawej stronie mapy ST.

Po zakończeniu analiz wybierz opcję Zakończ. Teraz wyeksportuj mapę ST do innych celów, wybierając Plik, a następnie Eksportuj dane, a następnie Metaplik. Nazwij plik i zapisz go jako plik emf, klikając przycisk Zapisz.

Mapy wygenerowane tą techniką pokazują zmiany średnicy światła tkanki zarówno w odległości, jak i w czasie. Odległość pozioma znajduje się na osi X, a czas na osi Y, z czasem początkowym na górze i czasem końcowym na dole. W prawym górnym rogu znajduje się legenda, która wyświetla minimalne i maksymalne średnice światła, a także skalowanie zarówno dla osi X, jak i Y.

W związku z tym różne odcienie pikseli w obrazie w skali szarości odpowiadają różnym średnicom światła. Ciemniejsze piksele odpowiadają szerszym średnicom, a jaśniejsze piksele odpowiadają mniejszym średnicom. Fale kurczliwe mięśnia okrężnego pojawią się jako obszary jaśniejszej pikselizacji z powodu zmniejszenia średnicy światła.

Natomiast rozdęcie światła spowodowane rozluźnieniem mięśni okrężnych lub dużym bolusem płynu jest pokazane za pomocą ciemniejszych pikseli. Oprócz fal rozchodzącego się skurczu, można również uwidocznić wzorzec ruchliwości mieszania znany jako segmentacja. Małe skurcze stacjonarne występują w różnych obszarach w tym samym czasie.

Z biegiem czasu te małe skurcze przesuwają się w kierunku brzusznego końca odbytu. Krezka pozostająca na tkance może powodować artefakty, które są wyświetlane jako ciemne pionowe linie. Ruch poziomy tych sztucznych pionowych linii można wykorzystać do określenia czasu podłużnego ruchu mięśni.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować segmenty jelit do nagrywania wideo i jak wygenerować późniejszą reprezentację motoryki jelit w postaci map czasoprzestrzennych. Po tej procedurze do roztworu luminalnego można dodać różne składniki odżywcze w celu określenia, w jaki sposób naturalne składniki indukują określone wzorce ruchliwości, aby ułatwić trawienie i wchłanianie. Zastosowanie specyficznych farmakologicznych agonistów lub antagonistów receptorów dla nerwowych czynników humoralnych może być wykorzystane do określenia mechanizmów, za pomocą których ruchliwość jest inicjowana i propagowana.

Technika ta może pomóc w uzyskaniu danych przydatnych do określenia związków przydatnych w leczeniu zaburzeń motoryki.