Name: Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test fluorometryczny z resazuryną do pomiaru tempa metabolizmu u larw Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie wpływu leków i genów na homeostazę energetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Rogerowi Cone'owi i Chao Zhangowi za ich wkład w walidację zastosowania tego testu w wersji wcześniej opublikowanej. Prace te były wspierane przez NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Uwaga: Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi Biura ds. Odpowiedzialnego Prowadzenia Badań Uniwersytetu w Arizonie i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt
1. Rozmnażanie danio pręgowanego i utrzymanie embrionów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę E3 dla embrionów8. Aby przygotować 60-krotny roztwór zapasowy, rozpuścić 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2●2H2O oraz 9,78 g MgCl2●6H2O w 1,95 L ddiH2O. Dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH i HCl. Uzupełnić objętość do 2 L za pomocą ddiH2O.</li>
	<li>Aby przygotować 1-krotną pożywkę E3 dla embrionów, rozcieńczyć 16,5 ml 60-krotnego roztworu zapasowego w 1 L ddiH20. Dodać 100 µl 1% błękitu metylenowego.</li>
	<li>Rozmnażanie
	<ol>
		<li>Utrzymywać samce i samice stada hodowlanego (w wieku od 7 do 18 miesięcy) osobno, aby zmaksymalizować płodność.</li>
		<li>Wyłączyć światło na 1–2 h przed planowanym dniem uzyskania ikry. Przeprowadzić kojarzenie (1 samiec i 1–2 samice) w klatkach do krzyżowania zgodnie z wcześniejszym opisem9. Klatki do krzyżowania zapobiegają drapieżnictwu, ponieważ jaja przechodzą przez perforowane dno wkładki zbiornika, w której znajdują się dorosłe ryby.</li>
		<li>Opcjonalnie: W przypadku rozmnażania synchronicznego (wymaganego np. do badań z użyciem wstrzykiwań morfolino), oddzielić samce i samice przezroczystą plastikową przegrodą. Usunąć ją rano, aby uzyskać zsynchronizowane złożenie jaj i zapłodnienie. W badaniach nad morfolino przeprowadzić obliczenia mocy statystycznej, aby ocenić liczbę embrionów ryb wymaganą dla każdej grupy badawczej. W przypadku braku szacunków dotyczących wielkości efektu lub zmienności, można przeprowadzić próbne badanie z n = 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść jaja z klatki do krzyżowania do szalki Petriego (100–150 embrionów na szalkę Petriego 10 cm). Pozostawić jaja do czasu ich opadnięcia na dno szalki, a następnie odlać wodę. Usunąć pozostałą wodę za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką. Dolać pożywkę E3 dla embrionów przygotowaną w kroku 1.1.</li>
	<li>Przygotować jednorazową pipetę polerowaną płomieniem do późniejszego przenoszenia jaj i ryb. Za pomocą nożyczek odciąć skalowaną jednorazową pipetę transferową na poziomie graduacji 0,25 ml. Aby usunąć ostre krawędzie, wypolerować odciętą końcówkę płomieniem palnika Bunsena.</li>
	<li>Utrzymywać embriony ryb do 4 dnia po zapłodnieniu (dpf) w szalkach Petriego 10 cm w pożywce E3 dla zebrafish w temperaturze 28,5 ○C. Dwa razy dziennie, używając polerowanej płomieniem skalowanej jednorazowej pipety transferowej, usuwać niezapłodnione jaja lub martwe embriony (o nieprzezroczystym białym wyglądzie). Raz dziennie wymieniać pożywkę E3. Odlać pożywkę E3, usunąć pozostały płyn za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką i dolać uprzednio ogrzaną (28,5 ○C) pożywkę E3.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu do analizy
<ol>
	<li>Przygotować roztwór analityczny zgodnie z Tabelą 1. Roztwór analityczny przefiltrować sterylnie przez filtr 0,22 µM. Przed rozpoczęciem analizy ogrzać sterylny roztwór analityczny w łaźni wodnej o temperaturze 28,5 ○C.</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >% całkowitej objętości</td>
			<td >Objętość (µl/10 ml)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >60x E3 Embryo Medium</td>
			<td >1.667</td>
			<td >166.7</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Podwójnie dejonizowana (ddi) H20</td>
			<td >96.233</td>
			<td >9623.3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Alamar Blue</td>
			<td >1</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >400 mM NaOH</td>
			<td >1</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >0.1</td>
			<td >10</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Pożywka do analizy
3. Wykonanie analizy
<ol>
	<li>Przepłukać zarodki danio pręgowanego 3 razy sterylnym, filtrowanym medium E3 dla zarodków. Przenieść wszystkie żywotne zarodki z jednej partii do zlewki. Przefiltrować sterylnie 75 ml medium E3 dla zarodków. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką usunąć z zarodków danio pręgowanego jak najwięcej medium E3. Dodać z powrotem 20 ml sterylnie filtrowanego medium E3 dla zarodków. Powtórzyć usuwanie i uzupełnianie medium E3 3 razy.</li>
	<li>Umieścić po jednej rybie w każdym z 93 dołków czarnej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Przenieść zarodki do płytki, chwytając pojedynczo każdy zarodek za pomocą polerowanej płomieniem, plastikowej, graduowanej jednorazowej pipety transferowej (krok 1.5) i delikatnie wypuszczając go do dołka. Przenieść medium E3 ze zlewki zawierającej wypłukane ryby do 3 pustych dołków. Zapewnia to, że dołki kontrolne (blanki) były narażone na dokładnie tę samą wodę co dołki zawierające ryby. Po zakończeniu tego kroku zarówno dołki z rybami, jak i dołki kontrolne powinny być wypełnione co najmniej do ½ objętości (200 µl).</li>
	<li>Zastąpić medium E3 roztworem analitycznym we wszystkich 96 dołkach, w tym w dołkach kontrolnych. Krok ten należy wykonywać kolumna po kolumnie dla każdej z 12 kolumn płytki 96-dołkowej. Używając jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką, usunąć medium E3 z każdego dołka w jednej kolumnie płytki (8 dołków). Należy uważać, aby nie dotknąć zarodka danio pręgowanego. Do każdego dołka, z którego usunięto wodę, dodać 300 µl roztworu analitycznego. Powtórzyć usuwanie medium E3 i zastępowanie go roztworem analitycznym dla wszystkich 12 kolumn płytki.</li>
	<li>Opcjonalnie: Aby przetestować zmianę tempa metabolizmu w odpowiedzi na związek, przygotować roztwór o stężeniu 100 razy większym (100X) niż pożądane stężenie traktowania. Należy pamiętać, aby roztwór 100X nie przekraczał 10% DMSO, aby ograniczyć końcowe stężenie DMSO do poziomu nie wyższego niż 0,1%. Do każdego z dołków traktowanych dodać 3 µl roztworu 100X. 
	UWAGA: Przeprowadzić obliczenia mocy testu w celu określenia liczby dołków traktowanych. Jednak bez szacunki wielkości odpowiedzi lub zmienności, można przeprowadzić wstępną próbę w 8 dołkach traktowanych związkiem i 8 dołkach kontrolnych traktowanych nośnikiem, zawierających ryby.
	<ol>
		<li>Do dołków kontrolnych (bez traktowania lekiem) zawierających ryby dodać 3 µl kontroli nośnika. Aby upewnić się, że odpowiedź fluorescencyjna na związek jest wynikiem procesów zachodzących w rybie, zastosować traktowanie lekiem i nośnikiem w 3 pustych dołkach na płytce 96-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczytać płytkę z rybami na fluorescencyjnym czytniku płytek z długością fali wzbudzenia 530 nM i długością fali emisji 590 nM.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaczem ustawionym na 28,5 ○C (płytkę należy przechowywać w ciemności przez cały czas trwania analizy, aby uniknąć fotobleachingu roztworu analitycznego). Analizę można prowadzić w czasie od 1 h do 24 h. Czas trwania analizy zależy od celu badania. W przypadku testowania odpowiedzi na krótko działający, niestabilny związek, najbardziej odpowiedni może być krótki czas trwania. Jednak w przypadku testów stabilnych związków lub testów efektów genetycznych, zaleca się maksymalizację czasu trwania analizy, aby wykorzystać korzyści związane z sygnałem kumulatywnym.</li>
	<li>W określonym punkcie czasowym (patrz krok 3.6 w celu ustalenia czasu) ponownie odczytać fluorescencję płytki z rybami przy użyciu tych samych ustawień co w kroku 3.5.</li>
</ol>
4. Ocena względnej zmiany fluorescencji związanej z traktowaniem
<ol>
	<li>Oblicz zmianę fluorescencji w każdym dołku, odejmując wartość fluorescencji w czasie 0 od fluorescencji na koniec badania. Dołki bez ryb (próby ślepe) powinny wykazywać wartości bliskie 0, znacznie niższe niż wartości w dołkach zawierających ryby. 
	        Zmiana fluorescencji = Fluorescencja na koniec - Fluorescencja w czasie 0</li>
	<li>Aby określić względną zmianę fluorescencji, oblicz średnią zmianę fluorescencji dla dołków kontrolnych, a następnie podziel zmianę fluorescencji w każdym dołku przez średnią zmianę fluorescencji w dołkach kontrolnych. Należy zauważyć, że kontrole mogą być kontrolami nośnikiem lub kontrolami genetycznymi. 
	        <img alt="Wzór na względną zmianę fluorescencji, stosunek fluorescencji dołka do kontroli, analiza równania." src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Zanieczyszczenie bakteriami lub grzybami znacznie ograniczy zastosowanie tego testu. Błękit metylenowy w pożywce zarodkowej E3 ogranicza możliwość zanieczyszczenia grzybiczym. Przez cały okres hodowli zarodków bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność w usuwaniu martwych zarodków dwa razy dziennie. Dodatkowo konieczne jest dokładne przepłukanie zarodków sterylną pożywką zarodkową E3 w dniu rozpoczęcia testu. Te 2 kroki ograniczają możliwość skażenia bakteryjnego zarodków. Włączenie ślepych studzienek opisanych w kroku 3...

Mysz jest obecnie dominującym modelem w badaniach nad otyłością. Krótki odstęp między generacjami i narzędzia genetyczne dostępne u myszy nie miały sobie równych do tej pory. Jednak danio pręgowany ma również krótki odstęp między pokoleniami (3 - 4 miesiące) i przewyższa nawet mysz pod względem łatwości manipulacji genetycznej 1,2. Danio pręgowany zachowuje prawie 90% genów ssaków, znacznie przewyższając mysz pod względem liczby potomstwa i potencjału do wykorzystania w badaniach genetycznych i przesiewowych leków3.
Aby wykorzystać potencjał modelu danio pręgowanego do badań nad otyłością, muszą zostać opracowane testy do badania czynników wpływających na regulację masy ciała, w tym wydatku energetycznego. Ponieważ metabolity są przetwarzane przez β-utlenianie i cykl kwasu trikarboksylowego, zużywany jest tlen i wytwarzany jest NADH2. Tak więc NADH2 jest bezpośrednim wskaźnikiem przepływu metabolitów przez szlaki metaboliczne (utlenianie metabolitów). W poikilotermach H+ przecieka przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, która rozprzęga utlenianie NADH2 od syntezy ATP, jest 4 - 5 razy niższe niż w hometermach 4. W związku z tym u danio pręgowanego NADH2 jest bardzo ściśle związany z produkcją ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. W niniejszym artykule opisujemy test, który mierzy produkcję NADH2 u larw danio pręgowanego jako wskaźnik zastępczy dla wydatku energetycznego5.
Zużycie tlenu to złoty standard pomiaru wydatku energetycznego. Jednak, aby jak najlepiej wykorzystać potencjał wysokiej przepustowości danio pręgowanego, testy wydatku energetycznego muszą być podatne na wysoką przepustowość. Systemy zużycia tlenu, które zależą od układu cyrkulacyjnego z zamkniętą komorą, są ograniczone pod względem przepustowości ze względu na liczbę dostępnych komór6. Testy zużyciaO2 na wolnym powietrzu/produkcji CO2 zastosowano również u danio pręgowanego5,7. Te 96-dołkowe systemy oparte na płytkach na wolnym powietrzu są przystosowane do wysokiej przepustowości. Niestety, wymiana gazowa z otoczeniem ogranicza czułość tych testów. Niedawno opublikowaliśmy zastosowanie testu, który monitoruje NADH2 za pomocą wskaźnika redoks alamarBlue5. Test ten pozwala przezwyciężyć ograniczenia w przepustowości i czułości typowe dla analiz zużycia tlenu przez danio pręgowanego.
Danio pręgowany staje się coraz ważniejszym modelem do badań homeostazy energetycznej całego ciała. Po części dlatego, że danio pręgowany jest podatny na wykorzystanie w badaniach genetycznych i badaniach przesiewowych leków. Co więcej, można szybko zastosować ukierunkowane manipulacje genetyczne, w tym knockdown i knock-in. Wcześniej wykazaliśmy, że test ten można połączyć z aplikacją leku do kąpieli i genetycznym knockdownem lub nokautem w celu zidentyfikowania związków i genów, które zmieniają tempo przemiany materii5. Co więcej, test ten ma na celu wykorzystanie zalet wysokiej przepustowości nieodłącznie związanych z danio pręgowanym.

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Wyprodukowany przez Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa z cienką końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Wyprodukowana przez Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowa pipeta transferowa z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Wyprodukowana przez Thermo Scientific</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki z przezroczystym dnem po czarnych</td> stronach<td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Wyprodukowane przez E& K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego danio rerio

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Danio pręgowany to ważny organizm modelowy z nieodłącznymi zaletami, które mogą sprawić, że danio pręgowany stanie się powszechnie stosowanym modelem do badania homeostazy energetycznej i otyłości. Niewielki rozmiar danio pręgowanego pozwala na przeprowadzanie testów na zarodkach w formacie płytki 96- lub 384-dołkowej, technologie oparte na Morpholino i CRISPR ułatwiają manipulację genetyczną, a leczenie farmakologiczne przez kąpiel jest opłacalne. Co więcej, danio pręgowany idealnie nadaje się do badań genetycznych, które pozwalają na odkrycie nowych genów. Biorąc pod uwagę względną nowość danio pręgowanego jako modelu otyłości, konieczne jest opracowanie narzędzi, które w pełni wykorzystają te korzyści. W tym artykule opisujemy metodę pomiaru wydatku energetycznego u tysięcy embrionalnych ryb pręgowanych jednocześnie. Opracowaliśmy całą platformę mikropłytek zwierzęcych, w której używamy 96-dołkowych płytek do izolowania pojedynczych ryb i oceniamy skumulowaną produkcję NADH2 za pomocą dostępnego na rynku odczynnika żywotności hodowli komórkowych alamarBlue. W poikilotermach zależność między produkcją NADH2 a wydatkiem energetycznym jest ściśle powiązana. Ten test wydatku energetycznego stwarza potencjał do szybkiego badania przesiewowego manipulacji farmakologicznych lub genetycznych, które bezpośrednio zmieniają wydatek energetyczny lub zmieniają odpowiedź na zastosowany lek (np. Leki uczulające na insulinę).

Roztwór testowy nie zwiększa fluorescencji w przypadku braku embrionów ryb (Rycina 1). Test jest jednak wysoce czuły na niewielkie zmiany tempa metabolizmu wewnątrz studzienki. Pojedyncza ryba w studzience generuje sygnał istotnie różniący się od studzienek pustych w ciągu 1 h (P&lt;0,0001). Rycina 2 przedstawia wizualną reprezentację sygnałów generowanych przez embriony ryb po 24 h inkubacji. Na potrzeby tego zdjęcia zastosowano studzienki z przeźroczystymi ściankami. Niemniej jednak, w...

Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym do badania homeostazy energetycznej. Wykorzystując czuły na NADH2 wskaźnik redoks, alamar Blue, opracowaliśmy test, który mierzy tempo metabolizmu larw danio pręgowanego w formacie 96-dołkowej płytki i może być stosowany do odkrywania leków lub genów.

Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego fluorometrycznego testu opartego na rezazurynie jest monitorowanie wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych na produkcję NADH2, która stanowi miarę tempa metabolizmu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie otyłości, takie jak wpływ danego leku lub genu na tempo metabolizmu. Dodatkowo test ten można zastosować do przesiewowego badania potencjalnych interakcji lek-lek lub lek-gen w systemie całego organizmu zwierzęcia.Główną zaletą tego testu w porównaniu z analizami zużycia tlenu jest wysoka przepustowość oraz kumulacja sygnału w czasie, co pozwala użytkownikowi wykryć niewielkie różnice w tempie metabolizmu. Procedurę tę zaprezentuje Caroline Foy, studentka studiów podyplomowych w moim laboratorium. Po przygotowaniu 60X roztworu zapasu pożywki E3 zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować pożywkę E3 o stężeniu 1X poprzez rozcieńczenie 16,5 mililitrów roztworu zapasu w jednym litrze wody dwukrotnie destylowanej.Następnie dodaj 100 µL 1% błękitu metylowego. Aby przygotować wypalaną płomieniem jednorazową pipetę do przenoszenia jaj i ryb, odetnij nożyczkami graduowaną jednorazową pipetę transferową na poziomie podziałki 0,25 mL. Następnie, w celu usunięcia ostrych krawędzi, użyj palnika Bunsena, aby wypalić płomieniem odciętą końcówkę.Po zapłodnieniu rybek zebrafish i zebraniu ikry, należy pozwolić jajom opaść na dno naczynia, a następnie odlać wodę. Pozostałą wodę należy usunąć za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką. Następnie należy ponownie dodać medium E3.Inkubuj embriony ryb w temperaturze 28,5 °C do czwartego dnia po zapłodnieniu (DPF). Dwa razy dziennie używaj polerowanej płomieniem jednorazowej pipety transferowej z podziałką, aby usunąć niezapłodnione jaja lub martwe embriony. Następnie raz dziennie odlej medium E3.Używając pipety transferowej z cienką końcówką, usuń pozostałe medium i zastąp je świeżą pożywką E3 uprzednio ogrzaną do 28,5 °C. Aby przeprowadzić test wydatku energetycznego, przygotuj roztwór analityczny zgodnie z poniższą tabelą. Przefiltruj roztwór przez filtr o rozmiarze 0,22 µm w celu sterylizacji, a następnie ogrzej go do 28,5 °C w kąpieli wodnej przed przystąpieniem do analizy.W szalce Petri połącz wszystkie żywe zarodki danio pręgowanego z jednego cyklu składania ikry. Po sterylnej filtracji 75 mililitrów medium E3, za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką usuń z szalki Petri tak dużo medium E3, jak to możliwe. Następnie dodaj 20 mililitrów sterylnego E3. Powtórz proces usuwania i zastępowania sterylnego E3 jeszcze dwukrotnie.Następnie, używając wypalanej płomieniem plastikowej jednorazowej pipety transferowej z podziałką, przenieś poszczególne zarodki ryb do studzienek płytki 96-dołkowej. Pracując na jednej kolumnie płytki w danej chwili, usuń medium E3 z ośmiu studzienek pierwszej kolumny, dbając o to, aby nie dotknąć zarodków pipetą transferową. Następnie dodaj 300 µL roztworu analitycznego do każdej studzienki.Powtórz czynność dla wszystkich 12 kolumn płytki. Aby wprowadzić badanie z zastosowaniem leku, po przygotowaniu 100X roztworu pożądanego związku, dodaj 3 µL do każdej z kolumek przeznaczonych do traktowania. Następnie dodaj 3 µL kontroli nośnika do kolumek kontrolnych z rybami.Aby upewnić się, że odpowiedź fluorescencyjna na związek jest wynikiem aktywności wewnątrz ryb, przygotuj trzy puste studzienki dla leku oraz trzy puste studzienki dla nośnika w płytce 96-dołkowej. Następnie, używając czytnika płytek fluorescencyjnych z długościami fal wzbudzenia i emisji wynoszącymi odpowiednio 530 nanometrów i 590 nanometrów, odczytaj wartości w studzienkach płytki z rybami. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.W zależności od rodzaju analizy oraz stabilności badanego związku, należy ponownie odczytać fluorescencję w określonym punkcie czasowym. Aby ocenić względną zmianę fluorescencji, oblicz średnią zmianę fluorescencji dla studni kontrolnych. Następnie podziel zmianę fluorescencji w każdej studni przez średnią zmianę fluorescencji w studniach kontrolnych.Oto przykład wykorzystania dwóch kolumn płytki 96-dołkowej. Dołków w kolumnie A użyto dla kontrolnych rybek zebrafish traktowanych nośnikiem, natomiast dołków w kolumnie B dla rybek zebrafish traktowanych insuliną. W tabeli A przedstawiono fluorescencję zmierzoną w czasie zero.Tabela B zawiera pomiary fluorescencji wykonane po 24 godzinach. W tabeli C od fluorescencji po 24 godzinach odjęto fluorescencję z czasu zero, aby ocenić zmianę fluorescencji. Następnie należy obliczyć średnią zmianę fluorescencji w dołkach kontrolnych.Tabela D przedstawia zmianę fluorescencji w każdej pojedynczej studzience, podzieloną przez średnią zmianę w studzienkach kontrolnych. Można zauważyć, że zastosowanie insuliny w stężeniu 10 µM spowodowało 2,77-krotny wzrost sygnału generowanego przez zebrafish w ciągu 24 h, przy wartości P mniejszej niż 0,0001. Jak widać, roztwór testowy nie zmienia koloru ani bezwzględnych poziomów fluorescencji w przypadku braku embrionów.Należy jednak pamiętać, że test ten jest bardzo czuły na niewielkie zmiany tempa metabolizmu w obrębie dołka. Rycina ta przedstawia sygnały generowane przez zarodki tilapia po 24-godzinnej inkubacji. Różowe dołki wskazują na ryby o wysokim tempie metabolizmu.Fioletowe dołki zawierają ryby o umiarkowanej szybkości metabolizmu, a dołki niebieskie reprezentują niską szybkość metabolizmu. Wykazuje to również wszechstronność tego testu i możliwość jego zastosowania u różnych gatunków ryb kostnoszkieletowych. Ponieważ redukcja alamar blue indukowana przez NADH2 jest nieodwracalna, sygnał kumuluje się w czasie, co pozwala na wzmocnienie niewielkich zmian.Przedstawiono tutaj względną zmianę fluorescencji indukowaną przez jedną do pięciu ryb po jednej, dwóch i czterech godzinach. Przy każdym zwiększeniu liczby ryb względna zmiana fluorescencji wzrasta znacząco wraz z upływem czasu, a im większa liczba ryb, tym większa skala zmiany fluorescencji w czasie. Po opanowaniu technika ta może być stosowana w przypadku do 5 000 embrionów ryb dziennie.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność, aby nie zranić embrionów ryb. Po przeprowadzeniu tego testu można wykonać inne procedury, takie jak pomiar lipidów neutralnych za pomocą czerwieni Nilowej lub pomiar popędu żerowania poprzez pobieranie paramecium znakowanych fluorochromami. Pozwala to na porównanie zależności między tempem metabolizmu a metabolizmem lipidów lub między tempem metabolizmu a popędem żerowania.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu metabolizmu energetycznego i chorób metabolicznych do badania wydatkowania energii u danio prążkowanego bez ograniczeń w zakresie przepustowości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać odczynnik fluorometryczny rezazurenę do pomiaru produkcji NADH2 u danio prążkowanego.

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Danio pręgowany stanowi potężny model kręgowców, który był niewystarczająco wykorzystywany w badaniach metabolicznych. W niniejszej pracy opisujemy szybką metodę pomiaru profilu metabolicznego in vivo rozwijających się rybek danio, która umożliwia porównanie różnych parametrów funkcji mitochondriów między zarodkami manipulowanymi genetycznie lub farmakologicznie, zwiększając tym samym możliwości zastosowania tego organizmu.

Analiza profilu metabolicznego embrionów rybki danio-ostrogona

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

To jest protokół żywieniowy diety wysokotłuszczowej do wywoływania otyłości u Drosophila, model do zrozumienia podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z lipotoksycznością. Zapewnia również wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy do pomiaru akumulacji tłuszczu u Drosophila i potencjalnie innych modeli (owadów) w różnych warunkach dietetycznych, środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych.

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj wysokoprzepustowy test fluorometryczny z resazuryną do pomiaru tempa metabolizmu u larw Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie wpływu leków i genów na homeostazę energetyczną.

Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio

Przeglądaj więcej filmów