Name: Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia domózgowo-komorowego peptydów β amyloidu u myszy bez użycia stereotaksji. Technika ta pozwala na ostre wywołanie deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera i wspiera odkrywanie nowych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych przez Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: H14C04660000).

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, wersja z 1978 r.) oraz za zgodą Animal Care and Use Committee w ramach Institutional Animal Care and Use Committee KIST (Seul, Korea).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotuj grupę 7-tygodniowych samców myszy ICR (lub C57BL/6).</li>
	<li>Pozostaw myszy na proces aklimatyzacji przez 3-7 dni po transporcie w celu przywrócenia homeostazy. Zasadniczo umieść grupę 4-5 myszy w każdej klatce i utrzymuj je w temperaturze 22-23 °C i wilgotności 40%, przy 12/12 h cyklu światło/ciemność. Zapewnij wodę i pokarm ad libitum. 
	Uwaga: Proces aklimatyzacji jest kluczowy dla regeneracji po stresie transportowym oraz adaptacji do nowych warunków bytowania, pokarmu, wody i zapachu, a także nowej klatki i cyklu oświetlenia. W tym eksperymencie myszy były utrzymywane w klatkach z indywidualną wentylacją (IVC) znajdujących się w pomieszczeniu klasy SPF (Specific Pathogen Free).</li>
	<li>Zważ każdą mysz i wyklucz osobniki, których waga odbiega o ± 10% od średniej.</li>
	<li>Podziel osobniki na dwie grupy: grupę wstrzykniętą nośnikiem (Aβ(-)) oraz grupę wstrzykniętą Aβ (Aβ(+)). Jeśli eksperyment ma na celu przetestowanie skuteczności konkretnego kandydata na lek, podziel myszy na cztery grupy: (1) Aβ(-)/lek(-), (2) Aβ(-)/lek(+), (3) Aβ(+)/lek(-) oraz (4) Aβ(+)/lek(+).</li>
</ol>
2. Przygotowanie peptydu Aβ
<ol>
	<li>Peptydy Aβ, otrzymane w drodze syntezy chemicznej5 lub z źródeł komercyjnych, traktować schłodzonym 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolem (HFIP), aby rozpuścić wszelkie agregaty i uzyskać homogenny roztwór peptydów6.
	<ol>
		<li>Roztwór Aβ/HFIP poddać sonikacji w kąpieli wodnej przez 5 min (w temperaturze pokojowej), delikatnie wymieszać w wortexie, a następnie inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. HFIP całkowicie usunąć poprzez odparowanie strumieniem azotu, a homogenny Aβ przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować monomery Aβ: sporządzić roztwór stokowy Aβ w dimetylosulfotlenku (DMSO) o stężeniu 1 mM, a następnie rozcieńczyć go 10-krotnie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (100 µM Aβ, 10% DMSO, 90% PBS).</li>
	<li>Przygotować oligomery Aβ.
	<ol>
		<li>Roztwór monomeru Aβ (zawierający Aβ(1-42) lub Aβ(1-40)) (krok 2.2.) inkubować w temperaturze 37 °C odpowiednio przez 3 lub 7 dni.</li>
		<li>Probtkę z roztworem Aβ umieścić w szczelnym probówce, a następnie w woreczku strunowym z mokrym ręcznikiem papierowym, aby zapewnić wilgotne środowisko zapobiegające odparowywaniu wody podczas okresu inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzić obecność przygotowanych oligomerów Aβ za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) z wykorzystaniem fotoindukowanego sieciowania niezmodyfikowanych białek6.</li>
	<li>Przygotować kontrolny roztwór PBS zawierający 10% DMSO do wstrzyknięć dokanałowych (ICV) jako nośnik.</li>
</ol>
3. Przygotowanie strzykawki
<ol>
	<li>Przygotować mikrosstrzykawkę z igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 G do wtryskiwania dokomorowego (ICV).</li>
	<li>Strzykawkę wysterylizować w autoklawie wraz z pozostałym sprzętem, który zostanie użyty podczas procedury chirurgicznej. Po autoklawowaniu umieścić sprzęt pod lampą UV na 20 min.</li>
	<li>Owiniąć igłę mikrosstrzykawki folią Parafilm, aby dostosować jej długość do 3,8 mm, co zapewni maksymalną dokładność głębokości wstrzyknięcia do mózgu (Rysunek 1A). (W przypadku myszy B6 dostosować igłę strzykawki do 3,6 mm). 
	Uwaga: Ściśnięcie folii Parafilm spowoduje przekroczenie głębokości wstrzyknięcia powyżej 3,6 mm w kierunku brzuchowym. Aby zapobiec ściskaniu folii Parafilm podczas wprowadzania igły, należy owinąć ją gęsto i wielokrotnie.</li>
	<li>Przepłukać wnętrze strzykawki 70% etanolem dwukrotnie.</li>
	<li>Poddać strzykawkę i igłę działaniu myjki ultradźwiękowej w kąpieli wodnej przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przepłukać wnętrze strzykawki 70% etanolem dwukrotnie.</li>
	<li>Opłukać strzykawkę wodą destylowaną i całkowicie wysuszyć w dygestorium przez ponad 30 min. Przed rozpoczęciem wtryskiwania Aβ pozostawić czystą strzykawkę pod lampą UV przez 20 min.</li>
</ol>
4. Przygotowanie modelu mysiego z wstrzykniętym Aβ
Uwaga: Pole operacyjne należy oczyścić środkiem dezynfekującym w celu zachowania warunków sterylnych, a wszystkie instrumenty chirurgiczne do iniekcji ICV należy wysterylizować, używając 70% etanolu i naświetlania UV.
<ol>
	<li>Przed wstrzyknięciem dobowodowym (ICV) znieczuli mysz poprzez dokonać dostępu dootrzewnowego mieszaniny ksylazyny (20 mg/kg) oraz tiletaminy·HCl/zolazepamu·HCl (80 mg/kg). Umieść mysz na ogrzewanej macie, aby utrzymać temperaturę ciała podczas znieczulenia, i potwierdź skuteczność znieczulenia, oceniając odruch na uciśnięcie łapy.</li>
	<li>Nanieś sterylne krople PBS do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas procedury (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przygotuj dwa lustra, rysując na ich powierzchniach kilka prostych linii pionowych na wypadek trudności z ustawieniem strzykawki prostopadle.</li>
	<li>Umieść jedno lustro (M1) bezpośrednio obok ciała myszy, a drugie (M2) przed głową. Ustaw M1 równolegle do wyimaginowanej linii środkowej między oczami myszy, a M2 prostopadle do M1, tak aby obie płaszczyzny tworzyły kąt 90° (Rysunek 1C). Jeśli badacz jest praworęczny, umieść M1 po lewej stronie myszy. Jeśli badacz jest leworęczny, umieść M1 po prawej stronie myszy.</li>
	<li>Spryskaj środek czoła myszy 70% etanolem i przetrzyj suchymi patyczkami bawełnianymi. Nie zwilżaj zbyt dużego obszaru czoła, aby uniknąć obniżenia temperatury ciała na skutek odparowania alkoholu.</li>
	<li>Przetrzyj ten sam obszar czoła 2% roztworem chlorheksydyny, używając czystych patyczków bawełnianych. Powtórz przemywanie alkoholem i chlorheksydyną łącznie po trzy razy każda substancja. 
	Uwaga: Jeśli jest to konieczne, ogól włosy na czole myszy, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.</li>
	<li>Zlokalizuj bregma.
	<ol>
		<li>Używając kciuka i palca wskazującego, mocno dociśnij skórę czoła bezpośrednio nad oboma oczami do stopnia, w którym oczy zaczną wystawać. Odciągnij skórę do tyłu, aby napiąć czoło i zminimalizować ruchy czaszki pod skórą.</li>
		<li>Wyznacz niewidzialny trójkąt, określając trzy wierzchołki: oba oczy myszy oraz punkt, w którym spotykają się kciuk i palec wskazujący – bregma (Rysunki 1B, czerwona strzałka: bregma).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz punkt wstrzyknięcia za pomocą miarki: -1,0 ± 0,06 mm tylnie od bregma, 1,8 ± 0,1 mm bocznie od szwu strzałkowego i 2,4 mm głębokości (Rysunek 1D, niebieskie gwiazdki: punkty wstrzyknięcia w każdej półkuli). (Dla myszy B6: -0,9 mm tylnie, 1,7 mm bocznie i 2,2 mm głębokości).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę 10 µl roztworu Aβ lub nośnika, dodając nadmiar roztworu, aby uniknąć przypadkowego wstrzyknięcia powietrza.</li>
	<li>Umieść strzykawkę w punkcie wstrzyknięcia (opisanym w protokole 4.7). Ustaw strzykawkę prostopadle do płaszczyzny punktu wstrzyknięcia. Z ustalonej perspektywy wyrównaj odbicia strzykawki w obu lustrach z narysowanymi na nich liniami (Rysunek 1C).</li>
	<li>Zacznij wprowadzać igłę, aż owijka z parafilmu dotknie skóry.</li>
	<li>Utrzymuj dłoń trzymającą strzykawkę nieruchomo i drugą ręką wstrzyknij 5 µl roztworu Aβ lub nośnika powoli w ciągu 5 s, bez przerw. Upewnij się, że strzykawka pozostaje prostopadle przez cały czas. Po zakończeniu wstrzykiwania odczekaj od 3 do 5 s przed wyjęciem strzykawki, aby umożliwić dyfuzję.</li>
	<li>Przyjmując pierwotną pozycję trójkąta, wywrzyj umiarkowany nacisk, aby zabezpieczyć czaszkę przed niepożądanymi ruchami. Wyjmij strzykawkę bez jej przechylania.</li>
	<li>Umieść mysz po wstrzyknięciu Aβ na ogrzewanej podkładce do rekonwalescencji, utrzymując ją w pozycji brzusznej. Nie zostawiaj myszy bez nadzoru, dopóki nie odzyska przytomności, i nie wracaj jej do klatki z myszami nieoperowanymi do czasu pełnego wyzdrowienia.</li>
	<li>Umyj strzykawkę zgodnie z krokami 3.3-3.6.</li>
	<li>Po operacji monitoruj mobilność myszy i sprawdzaj pod kątem jakichkolwiek oznak infekcji lub choroby przez okres 5-7 dni.</li>
</ol>
<img alt="Obrazy z procedury chirurgicznej u gryzoni; iniekcje, diagramy anatomiczne, pomiary kątów, narzędzia mikrochirurgiczne." src="/files/ftp_upload/53308/53308fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Iniekcja Aβ do obszaru ICV. (A) Igła strzykawki owinięta Parafilmem w porównaniu z niezmodyfikowaną igłą strzykawki; (B) Krople PBS na oczy w celu zapobiegania wysychaniu; trójkąt wyznaczony na czole myszy za pomocą kciuka, palca wskazującego oraz obu oczu myszy, a także wyimaginowana linia środkowa równoodległa od każdego oka; (C) dwa lustra (M1 i M2) z naniesionymi na powierzchnie wieloma liniami pionowymi, ułatwiającymi prostopadłe wprowadzenie igły strzykawki; (D) trójkąt z punktami iniekcji, zaznaczonymi niebieskimi gwiazdkami (-1,0 ± 0,06 mm od bregmy i 1,8 ± 0,1 mm w płaszczyźnie strzałkowej) w każdej półkuli myszy; Zielona strzałka: Parafilm, Czerwona strzałka: bregma <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53308/53308fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Potwierdzenie wstrzyknięcia Aβ za pomocą labiryntu w kształcie litery Y oraz analiz mózgu
<ol>
	<li>Ocena pamięci operacyjnej u myszy po wstrzyknięciu Aβ za pomocą testów w labiryncie w kształcie litery Y3,7,8
	<ol>
		<li>Odczekać 3 dni po wstrzyknięciu do momentu wystąpienia deficytów pamięci.</li>
		<li>Przeprowadzić testy w labiryncie Y, używając czarnego plastikowego labiryntu z trzema identycznymi ramionami oznaczonymi jako A, B i C, z których każde odgałęzia się pod kątem 120° od centrum labiryntu (szerokość x długość x wysokość, 10 cm x 40 cm x 12 cm).</li>
		<li>Umieścić mysz w ramieniu startowym (ramię A) i pozwolić zwierzęciu na swobodną eksplorację labiryntu przez 8 min.</li>
		<li>Zmierzyć liczbę wejść do każdego ramienia i obliczyć współczynnik alternacji dla każdego osobnika3,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednie badanie mózgów po śmierci w celu sprawdzenia, czy wstrzyknięcie zostało odpowiednio skierowane do obszaru ICV.
	<ol>
		<li>Zanestetyzować mysz zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 4.1. Następnie uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie szyi.</li>
		<li>Odciąć głowę myszy i usunąć skórę, aby odsłonić czaszkę, używając nożyczek chirurgicznych. Usunąć tkanki i mięśnie z czaszki.</li>
		<li>Wyonać nacięcia na szwie jagodowym (między kością ciemieniową a międzyciemieniową), nie uszkadzając mózgu. Usunąć kość potyliczną i międzyciemieniową, a następnie kości ciemieniowe i czołowe. Usunąć kość czaszki za pomocą pęsety i wyizolować mózg z czaszki, unosząc opony mózgowe.</li>
		<li>Przemyć mózg w schłodzonej sterylnej soli fizjologicznej i przeciąć obszar ICV mózgu w kierunku coronalnym za pomocą noża chirurgicznego (Rycina 2).</li>
		<li>Potwierdzić miejsce wstrzyknięcia na podstawie śladu po wprowadzeniu igły w tkance mózgowej (Rycina 2). Sprawdzić, czy ślad igły dotarł do jednego z komór. Jeśli ślad igły nie dotarł do komór lub przez nie nie przeszedł, wykluczyć dane tego osobnika z analizy wyników eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kam, T. I., Gwon, Y., Jung, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+receptors+responsible+for+neurotoxicity+and+cellular+defects+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta receptors responsible for neurotoxicity and cellular defects in Alzheimer's disease.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 4803-4813 (2014).</li>
<li>Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse models of Alzheimer's disease.</a> Mt Sinai J Med. 77, 69-81 (2010).</li>
<li>Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBryan%2C+KJ+%22Methods+of+Behavior+Analysis+in+Neuroscience+Frontiers+in+Neuroscience%22">Methods of Behavior Analysis in Neuroscience Frontiers in Neuroscience</a>. Buccafusco, J. J. , (2009).</li>
<li>Van Dam, D., De Deyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+the+drug+discovery+pipeline+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models in the drug discovery pipeline for Alzheimer's disease.</a> Br J Pharmacol. 164, 1285-1300 (2011).</li>
<li>Choi, J. W., Kim, H. Y., Jeon, M., Kim, D. J., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+access+to+highly+pure+beta-amyloid+peptide+by+optimized+solid-phase+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Efficient access to highly pure beta-amyloid peptide by optimized solid-phase synthesis.</a> Amyloid. 19, 133-137 (2012).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Kim, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+Alzheimer%27s+disease+by+neuroprotective+effect+of+sulforaphane+in+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amelioration of Alzheimer's disease by neuroprotective effect of sulforaphane in animal model.</a> Amyloid. 20, 7-12 (2013).</li>
<li>Jackson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VTE+on+an+elevated+T-maze%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Psychol%22%5BJournal%5D)">VTE on an elevated T-maze.</a> J Comp Psychol. 36, 9(1943).</li>
<li>Kim, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taurine+in+drinking+water+recovers+learning+and+memory+in+the+adult+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Taurine in drinking water recovers learning and memory in the adult APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Sci Rep. 4, 7467(2014).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2nd+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ledo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+oligomers+link+depressive-like+behavior+and+cognitive+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta oligomers link depressive-like behavior and cognitive deficits in mice.</a> Mol Psychiatry. 18, 1053-1054 (2013).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> J Pharmacol Methods. 16, 355-357 (1986).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Figueiredo, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memantine+rescues+transient+cognitive+impairment+caused+by+high-molecular-weight+abeta+oligomers+but+not+the+persistent+impairment+induced+by+low-molecular-weight+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Memantine rescues transient cognitive impairment caused by high-molecular-weight abeta oligomers but not the persistent impairment induced by low-molecular-weight oligomers.</a> J Neurosci. 33, 9626-9634 (2013).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> Br J Pharmacol Chemother. 12, 12-15 (1957).</li>
<li>Harkany, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+approaches+in+experimental+models+of+beta-amyloid+neurotoxicity%3A+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective approaches in experimental models of beta-amyloid neurotoxicity: relevance to Alzheimer's disease.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 23, 963-1008 (1999).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allosteric+potentiation+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+galantamine+ameliorates+the+cognitive+dysfunction+in+beta+amyloid25-35+i.c.v.-injected+mice%3A+involvement+of+dopaminergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The allosteric potentiation of nicotinic acetylcholine receptors by galantamine ameliorates the cognitive dysfunction in beta amyloid25-35 i.c.v.-injected mice: involvement of dopaminergic systems.</a> Neuropsychopharmacology. 32, 1261-1271 (2007).</li>
<li>Yamada, K., Nabeshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer%27s+disease+and+evaluation+of+anti-dementia+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of anti-dementia drugs.</a> Pharmacol Ther. 88, 93-113 (2000).</li>
<li>Cho, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+of+amyloid-beta+concentrations+between+CSF+and+plasma+in+acute+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Correlations of amyloid-beta concentrations between CSF and plasma in acute Alzheimer mouse model.</a> Sci Rep. 4, 6777(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest wstrzyknięcie ICV Aβ. Protokół ten jest przeznaczony do wstrzykiwania Aβ do regionu ICV myszy bez instrumentów stereotaktycznych11,12. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przeprowadzić wstępny okres ćwiczeń wstrzykiwań z niebieskim barwnikiem zamiast Aβ, aby osiągnąć wystarczającą zręczność. Bezpośrednio po iniekcji należy sprawdzić, czy iniekcja pigmentu została wykonana prawidłowo. Ostrożnie wyjmij mózg i sprawdź, czy odpowiedni obszar został zabarwiony na niebi...

Biorąc pod uwagę, że β amyloidu (Aβ) jest patologicznym znakiem rozpoznawczym choroby Alzheimera (AD), rozwój modeli zwierzęcych AD skupił się na neuronalnej nadekspresji Aβ. Ponieważ mutacje w białku prekursorowym amyloidu (APP) lub presenilinie (PS) prowadzą do zaburzenia równowagi Aβ i ostatecznie do patogenezy rodzinnej AD1, modele mysie obejmujące mutacje genu APP lub PS są ogólnie akceptowane. Wśród szerokiej gamy myszy transgenicznych, prototypowe modele myszy obejmują: TG2576, PDAPP, APP/PS1 i APP23. W mózgu myszy te na ogół wykazują agregację Aβ i ostatecznie blaszki starcze; Po tworzeniu się blaszek miażdżycowych następuje znaczne upośledzenie funkcji poznawczych, tak że wykazują słabe wyniki w behawioralnych testach uczenia się i pamięci. Pokolenie wykorzystujące myszy transgeniczne, które w naturalny sposób naśladują ludzką patologię AD, przyczyniło się zatem do rozwoju społeczeństwa badawczego nad chorobą Alzheimera, umożliwiając nam monitorowanie postępu choroby. Jednak używanie myszy transgenicznych jest nieekonomiczne i czasochłonne, ponieważ potrzeba miesięcy, aby rozwinąć blaszki Aβ, a nawet dłużej, aby wykazać nieprawidłowości synaptyczne lub behawioralne wywołane przez Aβ2,3. Pierwotnie opracowane jako alternatywa w celu przezwyciężenia wad transgenicznych modeli myszy, modele nietransgeniczne są również powszechnie stosowane ze względu na ich wyraźne zalety. Modele choroby Alzheimera wywołane przez patogeny mogą być wytwarzane przez bezpośrednie wstrzyknięcie Aβ do mózgu, podczas gdy deficyty poznawcze podobne do AD mogą być również wywoływane przez inne środki chemiczne i fizyczne, takie jak wstrzyknięcie związków neurotoksycznych, takich jak skopolamina, indukcja zmian w obszarach związanych z funkcjami poznawczymi, takich jak hipokamp, lub przez uszkodzenie kory mózgowej4. Jednak niepatogenna indukcja upośledzenia funkcji poznawczych nie odzwierciedla dokładnie podstawowej patofizjologii AD; zamiast tego naśladuje tylko jego symptomatyczne wyniki. W przeciwieństwie do tego, model AD wywołany przez patogen, mysi model z wstrzyknięciem Aβ, może nie tylko wykazywać nieprawidłowości behawioralne podobne do AD, ale może również wykazywać patologię Aβ, wspólną cechę wspólną dla rodzinnej i sporadycznej AD.
Pomimo trudności z wizualizacją blaszek Aβ w tkance mózgowej, największą zaletą modelu z wstrzyknięciem Aβ, która czyni go atrakcyjnym do badań nad AD, jest jego kontrolowalność. Naukowcy mogą wyeliminować indywidualne różnice w modelach mysich, które mogą prowadzić do błędnych danych w badaniach związanych z lekami. Terminowe leczenie farmakologiczne jest możliwe w zależności od mechanizmu działania leku kandydującego; aby opracować, inhibitor agregacji Aβ można zastosować przed wstrzyknięciem Aβ. Ponadto badacze mogą założyć, że patogenna transformacja, która powstaje po wstrzyknięciu Aβ, wynika z ekspozycji na Aβ, ponieważ inne czynniki są ściśle kontrolowane, w tym różnice indywidualne.
W tym protokole przedstawiono żywy opis, jak wywołać fenotyp podobny do AD u normalnych myszy poprzez wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych. Minimalizacja uszkodzeń tkanki mózgowej spowodowanych przez wprowadzenie jest niezbędna, aby zapobiec możliwości uszkodzenia strukturalnego i zapalenia wywołanego zmianami chorobowymi. Brak umiejętności posługiwania się myszą prowadzi do nieoczekiwanego uszkodzenia neuronów. Ponadto techniki, które umożliwiają uzyskanie odpowiedniego kąta i głębokości podczas iniekcji, są szczególnie ważne dla uniknięcia częstych błędów. Oprócz szczegółowego, żywego wyjaśnienia wstrzykiwania ICV, w poniższych sekcjach zilustrowano również niezawodność modelu wytworzonego przez poniższy protokół. Poniższy protokół może być niezawodnym i łatwo zrozumiałym narzędziem, które przyczyni się do badań nad chorobą Alzheimera, zapewniając tym samym krok naprzód, który ostatecznie może doprowadzić do znaczącego odkrycia dla społeczeństwa AD.

<table><tbody><tr><td>ICR mysz</td><td>Orientbio</td><td></td><td>samiec, 6-8 tygodni, 27-29 g masy ciała</td></tr><tr><td>C57BL/6 mysz</td><td>Orientbio</td><td></td><td>samiec, 6-8 tygodni, 21-23 g masy ciała</td></tr><tr><td>Amyloid-beta1-42</td><td>w syntezie domowej</td><td></td><td>stężenie zapasowe: 1 mM/DMSO, stężenie po wstrzyknięciu: 100 &mu; Strzykawka iniekcyjna M / 10% DMSO i 90% PBS</td></tr><tr><td>ICV (rozmiar 26s)</td> <td>Hamilton</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski barwnik Evans (EBD)</td><td>abcamBIochemikalia</td><td>ab120869</td><td>1% EBD w PBS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy gradientu PAGE Gradi-GelTM II</td><td>ELPiS Biotech</td><td>EBS-1056</td><td>15% żel</td></tr><tr><td>Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0377</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1150-01</td><td></td></tr><tr><td>LabDiet</td><td>Orientbio</td><td>5053</td><td></td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby alzheimera

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-β (Aβ) jest głównym patologicznym mediatorem zarówno rodzinnej, jak i sporadycznej choroby Alzheimera (AD). W mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera obserwuje się postępującą akumulację oligomerów i blaszek Aβ. Uważa się, że takie nieprawidłowości Aβ blokują długotrwałe wzmocnienie, upośledzają funkcję synaps i wywołują deficyty poznawcze. Dowody kliniczne i eksperymentalne wykazały, że ostry wzrost poziomu Aβ w mózgu umożliwia rozwój fenotypów podobnych do choroby Alzheimera. W związku z tym w wielu przypadkach konieczny jest szczegółowy protokół opisujący, jak ostro wygenerować mysi model choroby Alzheimera poprzez wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV). W tym protokole uwzględniono etapy eksperymentu z myszą z wstrzyknięciem Aβ, od przygotowania peptydów po testowanie nieprawidłowości behawioralnych. Proces przygotowania narzędzi i zwierząt przed wstrzyknięciem, wstrzykiwania Aβ do mózgu myszy za pomocą iniekcji ICV oraz oceny stopnia upośledzenia funkcji poznawczych jest łatwo wyjaśniony w całym protokole, z naciskiem na wskazówki dotyczące skutecznego wstrzykiwania ICV Aβ. Naśladując pewne aspekty choroby Alzheimera za pomocą wyznaczonego zastrzyku Aβ, naukowcy mogą ominąć proces starzenia i skupić się na dalszej patologii nieprawidłowości Aβ.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać poprzez potwierdzenie agregacji Aβ oraz ocenę deficytów pamięci w teście labiryntu w kształcie litery Y (Y-maze). Wykorzystując pełnowymiarowy peptyd Aβ(1-42) składający się z 42 aminokwasów, otrzymano mieszaninę monomerów, oligomerów i fibryli Aβ (Rycina 3). Dzięki etapowi monomeryzacji indukowanej HFIP uzyskano stosunkowo jednorodnie monomery (ścieżka B). Po 7-dniowej inkubacji rozwinęły się agregaty Aβ o...

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Ogólnym celem tej procedury chirurgicznej jest przeprowadzenie wewnątrzkomorowego wstrzyknięcia beta-amyloidu bez użycia instrumentów stereotaktycznych w celu ostrego wywołania zaburzeń behawioralnych przypominających chorobę Alzheimera u prawidłowych myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, takie jak poszukiwanie leków na chorobę Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego wstrzyknięcia A beta do obszaru komór mózgowych myszy bez pomocy instrumentów stereotaktycznych, co pozwala na naśladowanie zaburzeń behawioralnych typowych dla choroby Alzheimera u myszy bez konieczności oczekiwania na proces starzenia.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę choroby Alzheimera, ponieważ może ona służyć do badania patologii downstream amyloidu beta oraz do przesiewu kandydatów na leki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, gdyż precyzyjne zlokalizowanie punktu bregma na czaszce zwierzęcia może być wymagające. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 1 mM A-beta w DMSO.Następnie rozcieńcz go dziesięciokrotnie w PBS. Kolejnym krokiem jest przygotowanie roztworu PBS zawierającego 10% DMSO jako nośnika do iniekcji do Cisterny Ventriculi (ICV). Po tym etapie owiń mikrosτρzykawkę z igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26G paskami Parafilmu, aby dostosować długość igły do iniekcji z kontrolą głębokości.Owiń strzykawkę ciasno kilkakrotnie, tak aby Parafilm nie został ściśnięty podczas wkładania igły, a długość igły pozostała stała. Następnie odetnij warstwy pasków Parafilmu, aby dostosować długość igły do 3,8 mm między końcówką igły a Parafilmem. Następnie przemyj strzykawkę dwukrotnie 70% ethanol.Następnie przepłucz strzykawkę wodą destylowaną. Osusz ją całkowicie w dygestorium przez co najmniej 30 minut, a następnie pozostaw czystą strzykawkę pod lampą UV na kolejne 20 minut przed wykonaniem iniekcji. Na tym etapie umieść znieczuczoną siedmiotygodniową mysz na ciepłej macie.Następnie, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas procedury, należy nanieść do obu oczu krople sterylnego PBS lub maść. Po tym kroku należy potwierdzić skuteczność znieczulenia, oceniając odruch wycofania prostowników po uciśnięciu palca u nogi. Następnie należy przygotować dwa lustra z narysowanymi na powierzchniach wieloma pionowymi liniami, które będą służyć jako punkty odniesienia dla prostopadłego wstrzyknięcia za pomocą strzykawki.Umieść jedno lustro bezpośrednio obok ciała myszy, a drugie przed jej głową. Utrzymaj lustro M1 równolegle do wyimaginowanej linii środkowej między oczami myszy i ustaw lustro M2 prostopadle do M1, tak aby obie płaszczyzny tworzyły kąt 90 stopni. Następnie spryskaj czoło myszy 70% etanolem i przetrzyj je suchymi patyczkami bawełnianymi.Aby zlokalizować bregma, należy umieścić kciuk i palec wskazujący bezpośrednio nad oczami i lekko docisnąć czoło do momentu, aż oba oczy lekko wystaną. Jednocześnie należy przesunąć skórę czoła do tyłu, aby zminimalizować ruch czaszki pod nią. Miejsce wstrzyknięcia należy wyznaczyć za pomocą centymetra krawieckiego w odległości 2.4 mm pod czaszką.Napełnij strzykawkę 10 µL roztworu A-beta lub nośnika. Umieść strzykawkę tak, aby była prostopadła do płaszczyzny miejsca wstrzyknięcia. Następnie wyrównaj odbicia strzykawki w obu lustrach z liniami narysowanymi na lustrach.Zacznij wprowadzać igłę, aż owijka z Parafilmu dotknie skóry. Trzymając strzykawkę jedną ręką, wstrzyknij drugą ręką pięć µL roztworu A-beta lub nośnika, powoli w ciągu pięciu sekund bez przerw, upewniając się, że strzykawka przez cały czas pozostaje prostopadle. Po zakończeniu wstrzykiwania odczekaj od trzech do pięciu sekund przed wyjęciem strzykawki.Ponownie umieść kciuk i palec wskazujący na głowie i przytrzymaj ją, aby zapobiec niepotrzebnym ruchom czaszki. Następnie wyjmij strzykawkę, nie przechylając jej. Po tym czasie umieść mysz na ciepłej podkładce w celu rekonwalescencji.Aby potwierdzić, czy A-beta została wstrzyknięta do docelowego obszaru ICV, należy sprawdzić ślad po wprowadzeniu igły w tkance mózgowej, aby zweryfikować, czy dotarła ona do jednego z komór. Jeśli wstrzyknięcie nie powiodło się, należy wykluczyć dane tego osobnika z analizy wyników eksperymentalnych. W tym eksperymencie do wytworzenia mieszaniny monomerów, oligomerów i włókien A beta wykorzystano pełnowymiarowy peptyd A-beta składający się z 42 aminokwasów.Dzięki etapowi monomeryzacji indukowanej HFIP otrzymano względnie jednorodne monomery. Po siedmiodniowej inkubacji powstały agregaty A-beta o różnych rozmiarach, wśród których trymery i tetramery były dominującymi gatunkami spośród oligomerycznych form A-beta. W niniejszym badaniu oceniono przestrzenną pamięć roboczą u myszy wstrzykniętych A-beta w teście labiryntu w kształcie litery Y, w którym rejestrowano sekwencję wyborów ramion oraz całkowitą liczbę wejść do ramion, podczas gdy każda mysz mogła swobodnie eksplorować labirynt.Grupa myszy z wstrzykniętym A-beta wykazała istotnie niższy wskaźnik naprzemienności, co wskazuje na rozwój deficytów poznawczych. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w 20 minut, wliczając procedury znieczulenia, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tych procedur należy pamiętać o ustawieniu igły prostopadle do płaszczyzny iniekcji.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się poszukiwaniem leków na chorobę Alzheimera do prowadzenia badań przesiewowych kandydatów na leki in vivo w tych łatwo dostępnych gryzoniach będących modelami choroby Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić iniekcję dokomorową bez użycia instrumentów stereotaktycznych.

intracerebroventricular-injection-amyloid-peptides-normal-mice-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Transgeniczne (Tg) modele mysie w chorobie Alzheimera (AD) stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) zmieniają się wraz z postępem choroby u pacjentów. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu seryjnego pobierania próbek CSF od myszy.

Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Ten film demonstruje technikę ciągłego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu beta-amyloidu (Aβ) do hipokampa szczura. W badaniu zastosowano implantację obustronnego systemu kaniuli w celu kontrolowanego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu Aβ w połączeniu z infuzją rozpuszczalnych oligomerów Aβ (Aβo) do hipokampa szczura w celu zbadania interakcji między oligomerami a przeciwciałami.

Kontrolowany wlew przeciwciał swoistych dla peptydu Aβ i oligomerów Aβ do hipokampa szczura

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania peptydów beta amyloidu, chlorku glinu i neurozapalnego czynnika wzrostu, które wspólnie pomagają w tworzeniu toksycznych blaszek amyloidowych w okolicy hipokampa. Powoduje to upośledzenie pamięci u szczura, charakterystyczne dla choroby Alzheimera.

Ustalenie modelu szczurzego choroby Alzheimera poprzez wstrzyknięcie peptydu beta-amyloidu

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

To jest protokół do naśladowania choroby Alzheimera u szczurów poprzez ocenę upośledzenia pamięci przestrzennej, zmian patologicznych neuronów, obciążenia neuronalnym białkiem beta amyloidu (Aβ) i agregacji splątków neurofibrylarnych, indukowanej przez wstrzyknięcie Aβ25-35 w połączeniu z trichlorkiem glinu i rekombinowanym ludzkim transformującym czynnikiem wzrostu-β1.

Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

Poznaj metodę wstrzyknięcia domózgowo-komorowego peptydów β amyloidu u myszy bez użycia stereotaksji. Technika ta pozwala na ostre wywołanie deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera i wspiera odkrywanie nowych leków.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera (Wideo) | JoVE Journal

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Przeglądaj więcej filmów