Wprowadzenie do biologii komórek macierzystych
Jak sama nazwa wskazuje, komórki macierzyste są prekursorami, z których wywodzi się wiele różnych typów komórek. Charakteryzują się potencją, czyli zdolnością do różnicowania się w komórki ze wszystkich trzech listków rozrodczych, a także odnawialnością, czyli zdolnością do generowania większej liczby komórek macierzystych. W nadziei na postęp w dziedzinie biologii rozwojowej i medycyny regeneracyjnej, naukowcy zajmujący się komórkami macierzystymi pracują nad zrozumieniem, w jaki sposób te unikalne komórki dokonują tak wielkiego wyczynu.
Ten film omawia najważniejsze odkrycia w dziedzinie biologii komórek macierzystych, kluczowe pytania zadawane przez naukowców w tej dziedzinie, wybitne metody stosowane przez badaczy komórek macierzystych oraz zastosowania badań nad komórkami macierzystymi.
Teraz, gdy przedstawiliśmy koncepcję komórek macierzystych, zanurzmy się w bogatą historię badań nad komórkami macierzystymi.
W latach sześćdziesiątych XX wieku dr Ernest McCulloch i dr James Till odkryli jedne z pierwszych definitywnych dowodów na istnienie hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym dorosłych ssaków. Komórki te mają zdolność do samoodnawiania się i są multipotencjalne, co oznacza, że mogą różnicować się w wiele, ale ograniczone typy komórek, a mianowicie komórki krwi i układu odpornościowego.
W 1988 roku Irving Weissman i współpracownicy udoskonalili metodę oczyszczania hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego myszy.
W 1981 roku profesor Gail Martin ukuła termin "embrionalna komórka macierzysta". W przeciwieństwie do hematopoetycznych komórek macierzystych, embrionalne komórki macierzyste są pluripotencjalne, mają zdolność różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu. Wraz z naukowcami Martinem Evansem i Matthew Kaufmanem, równocześnie, ale oddzielnie, opracowała metody ekstrakcji wewnętrznej masy komórkowej z mysich blastocyst i hodowli ich in vitro jako komórek macierzystych.
W 1998 roku, ponad dziesięć lat po wyizolowaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy, dr James Thomson z powodzeniem stworzył pierwsze linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
W 2006 roku nastąpił duży przełom wraz z pojawieniem się indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, opracowanych przez dr Shinya Yamanaka. Opierając się na pracy Johna Gurdona, Yamanaka opracował metodę przeprogramowania zróżnicowanych komórek do stanu pluripotencjalnego poprzez użycie retrowirusa do wywołania ekspresji niewielkiego zestawu czynników transkrypcyjnych znanych obecnie jako "czynniki Yamanaka". Powstałe w ten sposób komórki nazwano "indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi" lub "iPSC". Eksperymenty te uznano za tak fundamentalnie ważne, że Yamanaka i Gurdon otrzymali Nagrodę Nobla w 2012 roku.
Obecnie dysponujemy modelami iPSC kilku chorób człowieka oraz platformami regeneracyjnymi w wielu tkankach.
Obecnie badania nad komórkami macierzystymi opierają się na kilku nadrzędnych pytaniach.
Jednym z najważniejszych z tych pytań jest: w jaki sposób komórki macierzyste utrzymują pluripotencję i odnawialność? Istnieją dwie powiązane cechy komórek macierzystych, które nadają te właściwości. Pierwszym z nich jest ekspresja specyficznych genów niezbędnych do macierzystej i samoodnowy. Drugim jest reakcja komórek macierzystych na czynniki regulacyjne, które wpływają na ekspresję tych genów.
Kolejnym logicznym pytaniem jest: w jaki sposób ukierunkowane jest różnicowanie komórek macierzystych? Gdy komórka macierzysta rozwija się w dojrzałą komórkę, aktywacja specyficznych szlaków różnicowania indukuje zmiany w ekspresji genów, wyłączając geny komórek macierzystych i włączając geny specyficzne dla tkanki, co skutkuje zwiększoną specjalizacją funkcji i morfologii komórki.
Na koniec zajmijmy się głównym pytaniem napędzającym finansowanie badań nad komórkami macierzystymi: czy komórki macierzyste mogą być stosowane w leczeniu chorób? Medycyna regeneracyjna radzi sobie z tym pytaniem na dwa sposoby: 1) poprzez odnowę narządów w laboratorium oraz 2) poprzez dostarczanie komórek macierzystych poprzez przeszczep w celu leczenia zwyrodnienia tkanek.
Teraz, gdy przedstawiliśmy niektóre z kluczowych pytań dotyczących biologii komórek macierzystych, przyjrzyjmy się niektórym z głównych metod stosowanych w celu ich rozwiązania.
Technologia mikromacierzy może zostać wykorzystana do odkrycia, które geny nadają komórkom macierzystym moc i odnawialność. W tej technice całkowite RNA jest izolowane z populacji komórek, co działa jako migawka bieżącej ekspresji genów. W serii etapów to mRNA jest przekształcane w znakowaną fluorescencyjnie sondę i hybrydyzowane z chipem zawierającym transkrypty całego ludzkiego genomu. Skanowanie tego chipa zapewnia odczyt względnych profili ekspresji genów. Jak widać, komórka macierzysta wyraża określony zestaw genów, który różni się od komórki zróżnicowanej.
Innym testem na geny pluripotencji jest system wykrywania Oct4-GFP. Oct4 jest wymagany do samoodnawiania i jest szybko regulowany w dół podczas różnicowania. Dlatego jego wyrażenie działa jako wiarygodny wskaźnik "łodygi". W tym eksperymencie komórki wyrażają białko zielonej fluorescencji pod kontrolą promotora Oct4. Komórki te mogą być następnie eksperymentalnie manipulowane, a zmiany w ekspresji GFP są analizowane w celu zidentyfikowania nowych genów lub rozpuszczalnych czynników, które modulują samoodnowę.
Aby badać komórki macierzyste in vitro, musimy najpierw zrozumieć, jak je hodować. Komórki macierzyste wymagają określonego mikrośrodowiska, aby utrzymać zdolność macierzystą. Można to osiągnąć poprzez kokulturację komórek macierzystych z komórkami odżywiającymi, takimi jak fibroblasty embrionalne myszy lub MEF. MEF wydzielają złożoną mieszaninę niezbędnych czynników pluripotencji i samoodnowy.
Czasami pożądane jest posiadanie hodowli komórek macierzystych bez karmników. Główną metodą utrzymania linii komórkowych wolnych od karmienia jest uzupełnienie pożywki do hodowli komórkowych podstawowymi odczynnikami wzrostu i hamującymi.
Różnicowanie komórek macierzystych in vitro odbywa się przy użyciu kilku metod. Różnicowa ekspresja genów jest ostatecznie odpowiedzialna za specjalizację komórek. W dwuetapowej metodzie, którą widzisz tutaj, hodowane embrionalne komórki macierzyste myszy są przygotowywane do losu neuronów, zanim zostaną dalej zróżnicowane za pomocą pożywki do indukcji neuronów ruchowych. Czynniki te aktywują specyficzne szlaki ekspresji genów, powodując zmiany morfologiczne i proteomiczne charakterystyczne dla neuronów ruchowych.
Jedną z głównych wad tradycyjnego różnicowania in vitro jest to, że płaskie płytki ograniczają wzrost komórek w 3D. Metoda wiszącej kropli i metody mikrokapsułek omijają te problemy. W technice wiszącej kropli małe krople zawiesiny komórek macierzystych są umieszczane na wieczku szalki Petriego i hodowane do góry nogami w celu utworzenia agregatów komórek macierzystych znanych jako ciała zarodkowe.
W metodach mikrokapsułkowania komórki macierzyste są mieszane z biokompatybilną półprzepuszczalną błoną zwaną alginianem i umieszczane w postaci kulek na płytkach do hodowli komórkowych. Obie metody pozwalają na dalsze różnicowanie się w wyspecjalizowane komórki, takie jak neurony dopaminergiczne i kardiomiocyty.
Wiedza o tym, jak kierować różnicowaniem, jest ważnym krokiem w kierunku wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Terapia przeszczepu komórek macierzystych ma na celu leczenie i leczenie chorób zwyrodnieniowych poprzez naprawę uszkodzonych tkanek za pomocą komórek macierzystych. W tym eksperymencie komórki somatyczne od pacjentów są przeprogramowywane w komórki iPS poprzez zakażenie soczewicowate czynnikami Yamanaka. Ze stanu pluripotencjalnego komórki różnicują się w określone typy komórek i wracają do gospodarza w celu naprawy uszkodzonej tkanki.
Teraz, gdy znasz już niektóre z metod stosowanych do badania komórek macierzystych, przyjrzyjmy się, jak te metody są stosowane w konkretnych eksperymentach.
W tym eksperymencie z wykorzystaniem mysiego modelu stwardnienia rozsianego, nerwowe komórki macierzyste są wstrzykiwane dożylnie chorym myszom. Wycinki mózgu leczonych myszy są zbierane i obrazowane pod mikroskopem w celu oceny powodzenia przeszczepu. Komórki pochodzące z neuronalnych komórek prekursorowych dawcy są śledzone za pomocą genu reporterowego LacZ. Jak widać, wiele komórek macierzystych dawcy zróżnicowało się i zintegrowało z ośrodkowym układem nerwowym chorych myszy.
Nie każdą dolegliwość można leczyć za pomocą iniekcji ogólnoustrojowych. Na przykład urazy chrząstki wymagają specjalistycznego rusztowania do odbudowy. W tym eksperymencie mieszanina mezenchymalnych komórek macierzystych i czynników krzepnięcia jest hodowana razem w celu utworzenia skrzepu. Skrzep jest następnie umieszczany w uszkodzonej chrząstce kolana królika i pozostawia się do integracji. Po tym zabiegu można zaobserwować przebudowę chrząstki kolana na gładki i funkcjonalny staw
.Czasami badacze komórek macierzystych i inżynierowie tkankowi łączą siły, aby odbudować całe narządy. W tym eksperymencie płuca naczelnych są myte w celu decelularyzacji narządu, pozostawiając tylko niekomórkowe składniki strukturalne. To "duchowe" płuco jest następnie przenoszone do bioreaktora, gdzie jest zasiewane krwionośnymi i nabłonkowymi komórkami macierzystymi. Aby jeszcze bardziej naśladować ciśnienie i zachowanie, których doświadczają naturalne płuca, bioreaktor cyrkuluje media, utrzymuje ciśnienie i poziom gazu oraz napełnia płuca.
Właśnie obejrzałeś przegląd biologii komórek macierzystych JoVE. Podsumowując, w tym filmie omówiliśmy komórki macierzyste i ich historię, metody utrzymania, różnicowania i dostarczania oraz zastosowania komórek macierzystych. Dzięki za oglądanie!
Komórki, które mogą różnicować się w różne typy komórek, znane jako komórki macierzyste, znajdują się w centrum jednej z najbardziej ekscytujących dzi…
Jak sama nazwa wskazuje, komórki macierzyste są prekursorami, z których wywodzi się wiele różnych typów komórek. Charakteryzują się potencją, czyli zdolnością do różnicowania się w komórki ze wszystkich trzech listków rozrodczych, a także odnawialnością, czyli zdolnością do generowania większej liczby komórek macierzystych. W nadziei na postęp w dziedzinie biologii rozwojowej i medycyny regeneracyjnej, naukowcy zajmujący się komórkami macierzystymi pracują nad zrozumieniem, w jaki sposób te unikalne komórki dokonują tak wielkiego wyczynu.
Ten film omawia najważniejsze odkrycia w dziedzinie biologii komórek macierzystych, kluczowe pytania zadawane przez naukowców w tej dziedzinie, wybitne metody stosowane przez badaczy komórek macierzystych oraz zastosowania badań nad komórkami macierzystymi.
Teraz, gdy przedstawiliśmy koncepcję komórek macierzystych, zanurzmy się w bogatą historię badań nad komórkami macierzystymi.
W latach sześćdziesiątych XX wieku dr Ernest McCulloch i dr James Till odkryli jedne z pierwszych definitywnych dowodów na istnienie hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym dorosłych ssaków. Komórki te mają zdolność do samoodnawiania się i są multipotencjalne, co oznacza, że mogą różnicować się w wiele, ale ograniczone typy komórek, a mianowicie komórki krwi i układu odpornościowego.
W 1988 roku Irving Weissman i współpracownicy udoskonalili metodę oczyszczania hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego myszy.
W 1981 roku profesor Gail Martin ukuła termin "embrionalna komórka macierzysta". W przeciwieństwie do hematopoetycznych komórek macierzystych, embrionalne komórki macierzyste są pluripotencjalne, mają zdolność różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu. Wraz z naukowcami Martinem Evansem i Matthew Kaufmanem, równocześnie, ale oddzielnie, opracowała metody ekstrakcji wewnętrznej masy komórkowej z mysich blastocyst i hodowli ich in vitro jako komórek macierzystych.
W 1998 roku, ponad dziesięć lat po wyizolowaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy, dr James Thomson z powodzeniem stworzył pierwsze linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
W 2006 roku nastąpił duży przełom wraz z pojawieniem się indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, opracowanych przez dr Shinya Yamanaka. Opierając się na pracy Johna Gurdona, Yamanaka opracował metodę przeprogramowania zróżnicowanych komórek do stanu pluripotencjalnego poprzez użycie retrowirusa do wywołania ekspresji niewielkiego zestawu czynników transkrypcyjnych znanych obecnie jako "czynniki Yamanaka". Powstałe w ten sposób komórki nazwano "indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi" lub "iPSC". Eksperymenty te uznano za tak fundamentalnie ważne, że Yamanaka i Gurdon otrzymali Nagrodę Nobla w 2012 roku.
Obecnie dysponujemy modelami iPSC kilku chorób człowieka oraz platformami regeneracyjnymi w wielu tkankach.
Obecnie badania nad komórkami macierzystymi opierają się na kilku nadrzędnych pytaniach.
Jednym z najważniejszych z tych pytań jest: w jaki sposób komórki macierzyste utrzymują pluripotencję i odnawialność? Istnieją dwie powiązane cechy komórek macierzystych, które nadają te właściwości. Pierwszym z nich jest ekspresja specyficznych genów niezbędnych do macierzystej i samoodnowy. Drugim jest reakcja komórek macierzystych na czynniki regulacyjne, które wpływają na ekspresję tych genów.
Kolejnym logicznym pytaniem jest: w jaki sposób ukierunkowane jest różnicowanie komórek macierzystych? Gdy komórka macierzysta rozwija się w dojrzałą komórkę, aktywacja specyficznych szlaków różnicowania indukuje zmiany w ekspresji genów, wyłączając geny komórek macierzystych i włączając geny specyficzne dla tkanki, co skutkuje zwiększoną specjalizacją funkcji i morfologii komórki.
Na koniec zajmijmy się głównym pytaniem napędzającym finansowanie badań nad komórkami macierzystymi: czy komórki macierzyste mogą być stosowane w leczeniu chorób? Medycyna regeneracyjna radzi sobie z tym pytaniem na dwa sposoby: 1) poprzez odnowę narządów w laboratorium oraz 2) poprzez dostarczanie komórek macierzystych poprzez przeszczep w celu leczenia zwyrodnienia tkanek.
Teraz, gdy przedstawiliśmy niektóre z kluczowych pytań dotyczących biologii komórek macierzystych, przyjrzyjmy się niektórym z głównych metod stosowanych w celu ich rozwiązania.
Technologia mikromacierzy może zostać wykorzystana do odkrycia, które geny nadają komórkom macierzystym moc i odnawialność. W tej technice całkowite RNA jest izolowane z populacji komórek, co działa jako migawka bieżącej ekspresji genów. W serii etapów to mRNA jest przekształcane w znakowaną fluorescencyjnie sondę i hybrydyzowane z chipem zawierającym transkrypty całego ludzkiego genomu. Skanowanie tego chipa zapewnia odczyt względnych profili ekspresji genów. Jak widać, komórka macierzysta wyraża określony zestaw genów, który różni się od komórki zróżnicowanej.
Innym testem na geny pluripotencji jest system wykrywania Oct4-GFP. Oct4 jest wymagany do samoodnawiania i jest szybko regulowany w dół podczas różnicowania. Dlatego jego wyrażenie działa jako wiarygodny wskaźnik "łodygi". W tym eksperymencie komórki wyrażają białko zielonej fluorescencji pod kontrolą promotora Oct4. Komórki te mogą być następnie eksperymentalnie manipulowane, a zmiany w ekspresji GFP są analizowane w celu zidentyfikowania nowych genów lub rozpuszczalnych czynników, które modulują samoodnowę.
Aby badać komórki macierzyste in vitro, musimy najpierw zrozumieć, jak je hodować. Komórki macierzyste wymagają określonego mikrośrodowiska, aby utrzymać zdolność macierzystą. Można to osiągnąć poprzez kokulturację komórek macierzystych z komórkami odżywiającymi, takimi jak fibroblasty embrionalne myszy lub MEF. MEF wydzielają złożoną mieszaninę niezbędnych czynników pluripotencji i samoodnowy.
Czasami pożądane jest posiadanie hodowli komórek macierzystych bez karmników. Główną metodą utrzymania linii komórkowych wolnych od karmienia jest uzupełnienie pożywki do hodowli komórkowych podstawowymi odczynnikami wzrostu i hamującymi.
Różnicowanie komórek macierzystych in vitro odbywa się przy użyciu kilku metod. Różnicowa ekspresja genów jest ostatecznie odpowiedzialna za specjalizację komórek. W dwuetapowej metodzie, którą widzisz tutaj, hodowane embrionalne komórki macierzyste myszy są przygotowywane do losu neuronów, zanim zostaną dalej zróżnicowane za pomocą pożywki do indukcji neuronów ruchowych. Czynniki te aktywują specyficzne szlaki ekspresji genów, powodując zmiany morfologiczne i proteomiczne charakterystyczne dla neuronów ruchowych.
Jedną z głównych wad tradycyjnego różnicowania in vitro jest to, że płaskie płytki ograniczają wzrost komórek w 3D. Metoda wiszącej kropli i metody mikrokapsułek omijają te problemy. W technice wiszącej kropli małe krople zawiesiny komórek macierzystych są umieszczane na wieczku szalki Petriego i hodowane do góry nogami w celu utworzenia agregatów komórek macierzystych znanych jako ciała zarodkowe.
W metodach mikrokapsułkowania komórki macierzyste są mieszane z biokompatybilną półprzepuszczalną błoną zwaną alginianem i umieszczane w postaci kulek na płytkach do hodowli komórkowych. Obie metody pozwalają na dalsze różnicowanie się w wyspecjalizowane komórki, takie jak neurony dopaminergiczne i kardiomiocyty.
Wiedza o tym, jak kierować różnicowaniem, jest ważnym krokiem w kierunku wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Terapia przeszczepu komórek macierzystych ma na celu leczenie i leczenie chorób zwyrodnieniowych poprzez naprawę uszkodzonych tkanek za pomocą komórek macierzystych. W tym eksperymencie komórki somatyczne od pacjentów są przeprogramowywane w komórki iPS poprzez zakażenie soczewicowate czynnikami Yamanaka. Ze stanu pluripotencjalnego komórki różnicują się w określone typy komórek i wracają do gospodarza w celu naprawy uszkodzonej tkanki.
Teraz, gdy znasz już niektóre z metod stosowanych do badania komórek macierzystych, przyjrzyjmy się, jak te metody są stosowane w konkretnych eksperymentach.
W tym eksperymencie z wykorzystaniem mysiego modelu stwardnienia rozsianego, nerwowe komórki macierzyste są wstrzykiwane dożylnie chorym myszom. Wycinki mózgu leczonych myszy są zbierane i obrazowane pod mikroskopem w celu oceny powodzenia przeszczepu. Komórki pochodzące z neuronalnych komórek prekursorowych dawcy są śledzone za pomocą genu reporterowego LacZ. Jak widać, wiele komórek macierzystych dawcy zróżnicowało się i zintegrowało z ośrodkowym układem nerwowym chorych myszy.
Nie każdą dolegliwość można leczyć za pomocą iniekcji ogólnoustrojowych. Na przykład urazy chrząstki wymagają specjalistycznego rusztowania do odbudowy. W tym eksperymencie mieszanina mezenchymalnych komórek macierzystych i czynników krzepnięcia jest hodowana razem w celu utworzenia skrzepu. Skrzep jest następnie umieszczany w uszkodzonej chrząstce kolana królika i pozostawia się do integracji. Po tym zabiegu można zaobserwować przebudowę chrząstki kolana na gładki i funkcjonalny staw
.Czasami badacze komórek macierzystych i inżynierowie tkankowi łączą siły, aby odbudować całe narządy. W tym eksperymencie płuca naczelnych są myte w celu decelularyzacji narządu, pozostawiając tylko niekomórkowe składniki strukturalne. To "duchowe" płuco jest następnie przenoszone do bioreaktora, gdzie jest zasiewane krwionośnymi i nabłonkowymi komórkami macierzystymi. Aby jeszcze bardziej naśladować ciśnienie i zachowanie, których doświadczają naturalne płuca, bioreaktor cyrkuluje media, utrzymuje ciśnienie i poziom gazu oraz napełnia płuca.
Właśnie obejrzałeś przegląd biologii komórek macierzystych JoVE. Podsumowując, w tym filmie omówiliśmy komórki macierzyste i ich historię, metody utrzymania, różnicowania i dostarczania oraz zastosowania komórek macierzystych. Dzięki za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Jak sama nazwa wskazuje, komórki macierzyste są prekursorami, z których wywodzi się wiele różnych typów komórek. Charakteryzują się potencją, czyli zdolnością do różnicowania się w komórki ze wszystkich trzech listków rozrodczych, a także odnawialnością, czyli zdolnością do generowania większej liczby komórek macierzystych. W nadziei na postęp w dziedzinie biologii rozwojowej i medycyny regeneracyjnej, naukowcy zajmujący się komórkami macierzystymi pracują nad zrozumieniem, w jaki sposób te unikalne komórki dokonują tak wielkiego wyczynu.
Ten film omawia najważniejsze odkrycia w dziedzinie biologii komórek macierzystych, kluczowe pytania zadawane przez naukowców w tej dziedzinie, wybitne metody stosowane przez badaczy komórek macierzystych oraz zastosowania badań nad komórkami macierzystymi.
Teraz, gdy przedstawiliśmy koncepcję komórek macierzystych, zanurzmy się w bogatą historię badań nad komórkami macierzystymi.
W latach sześćdziesiątych XX wieku dr Ernest McCulloch i dr James Till odkryli jedne z pierwszych definitywnych dowodów na istnienie hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym dorosłych ssaków. Komórki te mają zdolność do samoodnawiania się i są multipotencjalne, co oznacza, że mogą różnicować się w wiele, ale ograniczone typy komórek, a mianowicie komórki krwi i układu odpornościowego.
W 1988 roku Irving Weissman i współpracownicy udoskonalili metodę oczyszczania hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego myszy.
W 1981 roku profesor Gail Martin ukuła termin "embrionalna komórka macierzysta". W przeciwieństwie do hematopoetycznych komórek macierzystych, embrionalne komórki macierzyste są pluripotencjalne, mają zdolność różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu. Wraz z naukowcami Martinem Evansem i Matthew Kaufmanem, równocześnie, ale oddzielnie, opracowała metody ekstrakcji wewnętrznej masy komórkowej z mysich blastocyst i hodowli ich in vitro jako komórek macierzystych.
W 1998 roku, ponad dziesięć lat po wyizolowaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy, dr James Thomson z powodzeniem stworzył pierwsze linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
W 2006 roku nastąpił duży przełom wraz z pojawieniem się indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, opracowanych przez dr Shinya Yamanaka. Opierając się na pracy Johna Gurdona, Yamanaka opracował metodę przeprogramowania zróżnicowanych komórek do stanu pluripotencjalnego poprzez użycie retrowirusa do wywołania ekspresji niewielkiego zestawu czynników transkrypcyjnych znanych obecnie jako "czynniki Yamanaka". Powstałe w ten sposób komórki nazwano "indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi" lub "iPSC". Eksperymenty te uznano za tak fundamentalnie ważne, że Yamanaka i Gurdon otrzymali Nagrodę Nobla w 2012 roku.
Obecnie dysponujemy modelami iPSC kilku chorób człowieka oraz platformami regeneracyjnymi w wielu tkankach.
Obecnie badania nad komórkami macierzystymi opierają się na kilku nadrzędnych pytaniach.
Jednym z najważniejszych z tych pytań jest: w jaki sposób komórki macierzyste utrzymują pluripotencję i odnawialność? Istnieją dwie powiązane cechy komórek macierzystych, które nadają te właściwości. Pierwszym z nich jest ekspresja specyficznych genów niezbędnych do macierzystej i samoodnowy. Drugim jest reakcja komórek macierzystych na czynniki regulacyjne, które wpływają na ekspresję tych genów.
Kolejnym logicznym pytaniem jest: w jaki sposób ukierunkowane jest różnicowanie komórek macierzystych? Gdy komórka macierzysta rozwija się w dojrzałą komórkę, aktywacja specyficznych szlaków różnicowania indukuje zmiany w ekspresji genów, wyłączając geny komórek macierzystych i włączając geny specyficzne dla tkanki, co skutkuje zwiększoną specjalizacją funkcji i morfologii komórki.
Na koniec zajmijmy się głównym pytaniem napędzającym finansowanie badań nad komórkami macierzystymi: czy komórki macierzyste mogą być stosowane w leczeniu chorób? Medycyna regeneracyjna radzi sobie z tym pytaniem na dwa sposoby: 1) poprzez odnowę narządów w laboratorium oraz 2) poprzez dostarczanie komórek macierzystych poprzez przeszczep w celu leczenia zwyrodnienia tkanek.
Teraz, gdy przedstawiliśmy niektóre z kluczowych pytań dotyczących biologii komórek macierzystych, przyjrzyjmy się niektórym z głównych metod stosowanych w celu ich rozwiązania.
Technologia mikromacierzy może zostać wykorzystana do odkrycia, które geny nadają komórkom macierzystym moc i odnawialność. W tej technice całkowite RNA jest izolowane z populacji komórek, co działa jako migawka bieżącej ekspresji genów. W serii etapów to mRNA jest przekształcane w znakowaną fluorescencyjnie sondę i hybrydyzowane z chipem zawierającym transkrypty całego ludzkiego genomu. Skanowanie tego chipa zapewnia odczyt względnych profili ekspresji genów. Jak widać, komórka macierzysta wyraża określony zestaw genów, który różni się od komórki zróżnicowanej.
Innym testem na geny pluripotencji jest system wykrywania Oct4-GFP. Oct4 jest wymagany do samoodnawiania i jest szybko regulowany w dół podczas różnicowania. Dlatego jego wyrażenie działa jako wiarygodny wskaźnik "łodygi". W tym eksperymencie komórki wyrażają białko zielonej fluorescencji pod kontrolą promotora Oct4. Komórki te mogą być następnie eksperymentalnie manipulowane, a zmiany w ekspresji GFP są analizowane w celu zidentyfikowania nowych genów lub rozpuszczalnych czynników, które modulują samoodnowę.
Aby badać komórki macierzyste in vitro, musimy najpierw zrozumieć, jak je hodować. Komórki macierzyste wymagają określonego mikrośrodowiska, aby utrzymać zdolność macierzystą. Można to osiągnąć poprzez kokulturację komórek macierzystych z komórkami odżywiającymi, takimi jak fibroblasty embrionalne myszy lub MEF. MEF wydzielają złożoną mieszaninę niezbędnych czynników pluripotencji i samoodnowy.
Czasami pożądane jest posiadanie hodowli komórek macierzystych bez karmników. Główną metodą utrzymania linii komórkowych wolnych od karmienia jest uzupełnienie pożywki do hodowli komórkowych podstawowymi odczynnikami wzrostu i hamującymi.
Różnicowanie komórek macierzystych in vitro odbywa się przy użyciu kilku metod. Różnicowa ekspresja genów jest ostatecznie odpowiedzialna za specjalizację komórek. W dwuetapowej metodzie, którą widzisz tutaj, hodowane embrionalne komórki macierzyste myszy są przygotowywane do losu neuronów, zanim zostaną dalej zróżnicowane za pomocą pożywki do indukcji neuronów ruchowych. Czynniki te aktywują specyficzne szlaki ekspresji genów, powodując zmiany morfologiczne i proteomiczne charakterystyczne dla neuronów ruchowych.
Jedną z głównych wad tradycyjnego różnicowania in vitro jest to, że płaskie płytki ograniczają wzrost komórek w 3D. Metoda wiszącej kropli i metody mikrokapsułek omijają te problemy. W technice wiszącej kropli małe krople zawiesiny komórek macierzystych są umieszczane na wieczku szalki Petriego i hodowane do góry nogami w celu utworzenia agregatów komórek macierzystych znanych jako ciała zarodkowe.
W metodach mikrokapsułkowania komórki macierzyste są mieszane z biokompatybilną półprzepuszczalną błoną zwaną alginianem i umieszczane w postaci kulek na płytkach do hodowli komórkowych. Obie metody pozwalają na dalsze różnicowanie się w wyspecjalizowane komórki, takie jak neurony dopaminergiczne i kardiomiocyty.
Wiedza o tym, jak kierować różnicowaniem, jest ważnym krokiem w kierunku wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Terapia przeszczepu komórek macierzystych ma na celu leczenie i leczenie chorób zwyrodnieniowych poprzez naprawę uszkodzonych tkanek za pomocą komórek macierzystych. W tym eksperymencie komórki somatyczne od pacjentów są przeprogramowywane w komórki iPS poprzez zakażenie soczewicowate czynnikami Yamanaka. Ze stanu pluripotencjalnego komórki różnicują się w określone typy komórek i wracają do gospodarza w celu naprawy uszkodzonej tkanki.
Teraz, gdy znasz już niektóre z metod stosowanych do badania komórek macierzystych, przyjrzyjmy się, jak te metody są stosowane w konkretnych eksperymentach.
W tym eksperymencie z wykorzystaniem mysiego modelu stwardnienia rozsianego, nerwowe komórki macierzyste są wstrzykiwane dożylnie chorym myszom. Wycinki mózgu leczonych myszy są zbierane i obrazowane pod mikroskopem w celu oceny powodzenia przeszczepu. Komórki pochodzące z neuronalnych komórek prekursorowych dawcy są śledzone za pomocą genu reporterowego LacZ. Jak widać, wiele komórek macierzystych dawcy zróżnicowało się i zintegrowało z ośrodkowym układem nerwowym chorych myszy.
Nie każdą dolegliwość można leczyć za pomocą iniekcji ogólnoustrojowych. Na przykład urazy chrząstki wymagają specjalistycznego rusztowania do odbudowy. W tym eksperymencie mieszanina mezenchymalnych komórek macierzystych i czynników krzepnięcia jest hodowana razem w celu utworzenia skrzepu. Skrzep jest następnie umieszczany w uszkodzonej chrząstce kolana królika i pozostawia się do integracji. Po tym zabiegu można zaobserwować przebudowę chrząstki kolana na gładki i funkcjonalny staw
.Czasami badacze komórek macierzystych i inżynierowie tkankowi łączą siły, aby odbudować całe narządy. W tym eksperymencie płuca naczelnych są myte w celu decelularyzacji narządu, pozostawiając tylko niekomórkowe składniki strukturalne. To "duchowe" płuco jest następnie przenoszone do bioreaktora, gdzie jest zasiewane krwionośnymi i nabłonkowymi komórkami macierzystymi. Aby jeszcze bardziej naśladować ciśnienie i zachowanie, których doświadczają naturalne płuca, bioreaktor cyrkuluje media, utrzymuje ciśnienie i poziom gazu oraz napełnia płuca.
Właśnie obejrzałeś przegląd biologii komórek macierzystych JoVE. Podsumowując, w tym filmie omówiliśmy komórki macierzyste i ich historię, metody utrzymania, różnicowania i dostarczania oraz zastosowania komórek macierzystych. Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two key characteristics that allow stem cells to maintain pluripotency and self-renewal?
Stem cells maintain pluripotency and self-renewal through two related characteristics. First, they express specific genes essential for stemness and self-renewal. Second, stem cells are responsive to regulatory factors that affect the expression of these genes, allowing them to sustain their unique properties and capacity to generate more stem cells.
Q2: How do microarray technology and Oct4-GFP detection systems help researchers study stem cell gene expression?
Microarray technology isolates total RNA from cells and converts mRNA into fluorescently labeled probes hybridized to chips containing the entire human genome, revealing gene expression profiles. The Oct4-GFP detection system uses green fluorescent protein under Oct4 promoter control, since Oct4 is quickly down-regulated during differentiation, making it a reliable indicator of stemness for identifying genes that modulate self-renewal.
Q3: What is the difference between hematopoietic stem cells and embryonic stem cells?
Hematopoietic stem cells, discovered in the 1960s, are multipotent and can differentiate into limited cell types of the blood and immune systems. Embryonic stem cells, identified in 1981, are pluripotent and can differentiate into all cell types of the body. This fundamental difference makes embryonic stem cells more versatile for regenerative medicine applications.
Q4: How do feeder cells and feeder-free culture methods maintain stem cell stemness in vitro?
Feeder cells, such as mouse embryonic fibroblasts, secrete a complex mixture of pluripotency and self-renewal factors necessary for maintaining stemness. Feeder-free cultures achieve this by supplementing cell culture media with stock reagents of growth and inhibitory factors. Both approaches provide the particular microenvironment stem cells require to maintain their unique properties.
Q5: What breakthrough did Shinya Yamanaka achieve with induced pluripotent stem cells?
Shinya Yamanaka developed a method to reprogram differentiated cells to a pluripotent state using retrovirus to induce expression of transcription factors now called the Yamanaka factors. This breakthrough, building on John Gurdon's work, created induced pluripotent stem cells, or iPSCs, which can now model human diseases and support regeneration platforms in multiple tissues.
Q6: How do hanging drop and microencapsulation methods improve stem cell differentiation compared to traditional flat plate cultures?
Traditional flat plate cultures restrict three-dimensional cell growth. The hanging drop method forms embryoid bodies by culturing stem cell suspensions upside down in petri dish drops. Microencapsulation methods mix stem cells with alginate, a biocompatible semipermeable membrane, and deposit them as beads. Both techniques enable three-dimensional differentiation into specialized cells like dopaminergic neurons and cardiomyocytes.
Q7: How are stem cells being applied in regenerative medicine to treat degenerative diseases?
Regenerative medicine uses two main approaches: regrowing organs in the lab and delivering stem cells via transplantation to treat tissue degeneration. Somatic cells are reprogrammed into iPSCs, differentiated into specific cell types, and returned to patients to repair damaged tissue. Examples include neural stem cell injections for multiple sclerosis and mesenchymal stem cells with coagulation factors for cartilage repair.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:58
A Brief History of Stem Cell Research
3:22
Key Questions in Stem Cell Biology
4:46
Prominent Methods
9:01
Applications
10:56
Summary