Name: Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę przygotowania makrofagów zawierających nanopręty złota do fotoakustycznego obrazowania nowotworów. Protokół wykorzystuje naturalne tropizm komórek do docelowego dostarczania cząstek plazmonicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Regione Toscana i Wspólnotę Europejską w ramach projektów ERANET+, LUS BUBBLE i BI-TRE.

Uwaga: Wszystkie stężenia nanoprętów złota są wyrażone w nominalnych molarnościach Au. Dla porównania z innymi pracami zauważ, że 1 M Au odpowiada w przybliżeniu 20 μM złotym nanoprętom, w naszym przypadku.
1. Przygotowanie nanoprętów ze złota kationowego
Uwaga: Metoda rozpoczyna się od syntezy nanoprętów złota pokrytych bromkiem cetrimonium (CTAB) poprzez autokatalityczną redukcję HAuCl4 kwasem askorbinowym, zgodnie z protokołem wprowadzonym przez Nikoobakht et al.25 i dostosowane zgodnie z Ratto i wsp.26. Następnie te złote nanopręty są modyfikowane w celu uzyskania większej biokompatybilności i powinowactwa do błon plazmatycznych, poprzez połączenie nici glikolu polietylenowego 10,11,27,28 i czwartorzędowych związków amoniowych22.
<ol>
	<li>Oczyścić 24 ml złotych prętów pokrytych CTAB w stężeniu 450 μM Au przez dwa cykle wirowania (12 000 x g, 30 min) i dekantacji. Upewnij się, że stosunek objętości martwej do objętości początkowej wynosi około 1/200 lub mniej dla wszystkich etapów wirowania w tym protokole. Użyć wodnego roztworu CTAB o stężeniu 500 μM jako roztworu myjącego, a na koniec przenieść cząstki do 6 ml buforu octanowego 100 mM o pH 5 zawierającego 500 μM CTAB i 0,005% (v/v) polisorbatu 20.</li>
	<li>Dodać 30 μl 10 mM wodnego roztworu alfa-metoksy-omega-merkapto-poli(glikolu etylenowego) (MW ~ 5 000) i pozostawić do reakcji na 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 30 μl 100 mM (11-merkaptoundecylo)-N,N,N-trimetyloamoniowego bromku dimetylosulfotlenku i pozostawić w spoczynku na 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnie dodać 18 ml polisorbatu 20 o stężeniu 0,005% (v/v) w wodzie i oczyścić te cząstki w czterech cyklach wirowania (12 000 x g, 30 min) i dekantacji. Użyj 0,005% (v/v) polisorbatu 20 w wodzie jako roztworu myjącego, a na koniec przenieś cząstki do 2,4 ml sterylnego PBS o pH 7,4. Końcowe nominalne stężenie złota wynosi 4,5 mM.</li>
</ol>
2. Ładowanie mysich makrofagów złotymi nanoprętami
<ol>
	<li>Jako pożywkę hodowlaną należy użyć monocytów/makrofagicznej linii komórkowej J774a.1 i DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Płytka 5 x 105 komórek na czterech płytkach Petriego o średnicy 60 mm i pozostawić im do wzrostu przez 24 godziny, tak aby w momencie oderwania uległy subkonfuzji (patrz krok 2.2).
	<ol>
		<li>Przez cały czas trwania protokołu utrzymuj komórki w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2, 95% powietrza i 100% wilgotności względnej). Do manipulowania komórkami należy używać komory z przepływem laminarnym i odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 godzinach załaduj komórki nanoprętami ze złota kationowego i przygotuj je do zatopienia w foliach chitozanu:
	<ol>
		<li>Aby umożliwić wchłonięcie cząstek przez komórki, do każdej płytki Petriego dodać podwielokrotność 4,5 mM Au kationowych nanoprętów złota w PBS, tak aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM Au. Pozostaw szalki Petriego w inkubacji na 24 godziny.</li>
		<li>Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym, aby potwierdzić ich dobry stan i przesłanie. Komórki powinny wykazywać normalną morfologię i szereg ciemnych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. Odłączyć komórki za pomocą skrobaka, połączyć je z dwiema płytkami Petriego, aby uzyskać odpowiednią ilość komórek do wykonania kolejnych etapów (co najmniej 2 x 106 komórek) i odwirować je (120 x g, 6 min) w celu usunięcia nadmiaru nanoprętów złota kationowego. Granulka komórkowa powinna wyglądać prawie na czarną.</li>
		<li>Zawiesić osad w 2 ml PBS i policzyć komórki za pomocą komory Bürker. Odwirować zawiesinę zawierającą 2 x 106 komórek (120 x g, 6 min) i utrwalić ich osady w 2 ml 3,6% (m/v) formaldehydu w PBS przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj ten granulat trzy razy przez odwirowanie (120 x g, 6 min) w celu usunięcia utrwalacza. Użyj PBS jako roztworu myjącego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Osadzanie makrofagów w filmach chitozanowych
Uwaga: Szczególne właściwości chitozanu 26,27,28,29 są wykorzystywane do produkcji biomimetycznych fantomów zawierających makrofagi barwione nanoprętami złota kationowego. W porównaniu z innymi hydrożelami, takimi jak agaroza, chitozan umożliwia tworzenie znacznie mocniejszych i cieńszych warstw, co ma kluczowe znaczenie dla mikroskopii PA6. Wytwarzanie tych fantomów odbywa się zgodnie z poprzednimi protokołami29,30,31 z pewnymi modyfikacjami, jak przewidziano w następnych30.
<ol>
	<li>Przygotować zakwaszony (pH 4,5, otrzymany przez dodanie kwasu octowego) i lepki 3% (w/v) niskocząsteczkowy roztwór chitozanu (średnia MW 120 kDa), dokładnie go wymieszać i pozostawić do homogenizacji przez 24 godziny w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Następnie wymieszaj mysie makrofagi zawierające nanopręty złota kationowego (2 x 106 komórek) z 500 μl roztworu chitozanu.</li>
	<li>W celu uzyskania fantomów o grubości ~50 μm należy wsypać 250 mg mieszaniny do foremek styropianowych o grubości 1,91cm2 i pozostawić je pod strumieniem azotu na 24 godziny. Następnie należy potraktować te próbki 500 μl 1 M NaOH w celu wywołania sieciowania i przepłukać je 10 ml ultraczystej wody.</li>
</ol>
4. Test stabilności konwersji fotoakustycznej
Uwaga: Stabilność konwersji PA jest badana za pomocą eksperymentów PA z domowym układem, który jest opisany w odnośniku 6.
<ol>
	<li>Zawiesić film chitozanowy zawierający makrofagi w wodzie demineralizowanej, na przykład za pomocą plastikowego uchwytu zanurzonego w szalce Petriego, tak aby zachować odległość ~5 mm od dna płytki. Umieścić tę płytkę na mikrometrycznym stoliku XY w celu kontrolowania położenia próbki.</li>
	<li>Skoncentruj wiązkę laserową o czasie trwania impulsu ~5 ns w rezonansie z podłużnym pasmem plazmonicznym złotych nanoprętów (np. z optycznego oscylatora parametrycznego pompowanego przez trzecią harmoniczną lasera Nd:YAG z przełączaniem Q o zakresie długości fali 400 - 2,500 nm i czasie trwania impulsu 5 nsec) prostopadle do powierzchni filmu o średnicy plamki ~300 μm.
	<ol>
		<li>Umieść tłumik przed wyjściem lasera, aby dostroić fluencję lasera i użyj rozdzielacza wiązki, aby skupić część wiązki laserowej na liczniku energii (np. detektorze piroelektrycznym) i monitorować fluktuacje. Utrzymuj fluencję optyczną poniżej ~1 mJ/cm2 na impuls podczas wyrównywania. Używaj odpowiednich okularów ochronnych do lasera, gdy laser jest włączony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz przetwornik ultradźwiękowy (zakres częstotliwości 1 - 20 MHz) w szalce Petriego ~ 2 mm od powierzchni folii i dostosuj jego położenie za pomocą translacji mikrometrycznych i etapów obrotowych, aby zmaksymalizować sygnał PA emitowany przez folię.</li>
	<li>Określić fluencję sondy FLO, która nie uszkadza próbki6:
	<ol>
		<li>Naświetlić losowy punkt próbki z fluencją około 1 mJ/cm2 na impuls przez co najmniej 500 impulsów. Dla każdego impulsu należy uzyskać odpowiedni sygnał PA z przetwornika ultradźwiękowego i fluencję lasera z licznika energii za pomocą oscyloskopu. Nazwij średnią fluencję jako próbę FLO.</li>
		<li>Oblicz intensywność sygnału PA jako jego amplitudę międzyszczytową w funkcji liczby impulsów. Aby zrównoważyć wahania intensywności lasera, należy znormalizować amplitudę każdego sygnału PA do stosunku jego własnej fluencji do próby FLO. Przeanalizuj trend znormalizowanej intensywności PA w funkcji liczby impulsów i zweryfikuj jego stabilność w czasie.</li>
		<li>W przypadku niestateczności powtórzyć kroki 4.4.1-4.4.3 z niższą wartością próby FLO. W przypadku stabilności powtarzaj je z wartością FLOwyższą o ~10%, aż do wystąpienia utraty stabilności. Ustaw fluencję sondy FLO jako drugą najwyższą wartość próby FLO, która zapewnia stabilność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz płynność progu przekształcania:
	<ol>
		<li>Wybierz inny losowy punkt próbki i zmierz średnią intensywność PA (ILOa) ponad 500 impulsów przy FLO.</li>
		<li>Ustaw nominalną fluencję większą niż FLO i dostarcz 50 impulsów. Nazwij ich średnią płynność jako Fexc.</li>
		<li>Ponownie zbadaj średnią intensywność PA (ILOb) ponad 500 impulsów przy FLO. Obliczyć stosunek R = ILOb / ILOa. Wartość R poniżej jedności świadczy o nieodwracalnej zmianie właściwości optycznych próbki.</li>
		<li>Użyj mikrometrycznego stolika XY, aby przesunąć folię i losowo zmienić punkt próbki. Powtórzyć kroki od 4.5.1 do 4.5.4 z różnymi wartościami Fexc, tak aby przyjąć kilka wartości R poniżej, wokół i powyżej jedności. 15 punktów jest rozsądnych.</li>
		<li>Wykreśl R jako funkcję Fexc i zidentyfikuj fluencję progu przekształcania Fth jako tę wartość, gdy R zaczyna różnić się od jednej poza niepewnością statystyczną. 6</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+new+nanochromophores+for+photothermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies.</a> J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+golden+age%3A+gold+nanoparticles+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).</li>
<li>Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+Contrast+Agents+for+in-Vivo+Bioimaging%3A+Current+Status+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+gold+nanoparticles+in+targeted+cancer+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery.</a> Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).</li>
<li>Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+molecular+contrast+agents+in+photoacoustic+imaging%3A+The+promises+and+the+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).</li>
<li>Cavigli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+Affects+the+Stability+of+the+Photoacoustic+Conversion+of+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).</li>
<li>Chen, L. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+photoacoustic+stability+of+gold+nanorods+by+silica+matrix+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010(2010).</li>
<li>Ratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CW+laser-induced+photothermal+conversion+and+shape+transformation+of+gold+nanodogbones+in+hydrated+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films.</a> J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).</li>
<li>Mercatelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+readout+of+optically+encoded+gold+nanorods+using+an+ordinary+dark-field+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope.</a> Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).</li>
<li>Von Maltzahn, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+guided+photothermal+tumor+therapy+using+long-circulating+gold+nanorod+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas.</a> Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).</li>
<li>Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+for+ovarian+cancer+detection+with+photoacoustic+imaging+and+resection+guidance+via+Raman+imaging+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice.</a> ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reexamination+of+active+and+passive+tumor+targeting+by+using+rod-shaped+gold+nanocrystals+and+covalently+conjugated+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands.</a> ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).</li>
<li>Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods%3A+Their+potential+for+photothermal+therapeutics+and+drug+delivery%2C+tempered+by+the+complexity+of+their+biological+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).</li>
<li>Centi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+antibody-conjugated+gold+nanorods+for+systemic+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections.</a> J. Nanobiotechnology. 12, 55(2014).</li>
<li>Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+in+nanorod+assemblies%3A+Optical+absorption%2C+discrete+dipole+approximation+simulation%2C+and+exciton-coupling+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model.</a> J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+of+gold+nanorods+at+short+distances+and+in+different+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries.</a> Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
<li>Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+Decoupling+in+Aggregates+of+Silanized+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).</li>
<li>Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+laser+nano-thermolysis+of+human+leukemia+cells+with+microbubbles+generated+around+clusters+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles.</a> Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).</li>
<li>Choi, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+trojan+horse+for+delivery+of+therapeutic+nanoparticles+into+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors.</a> Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).</li>
<li>Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-gold+nanorod+conjugates+selectively+target+and+induce+macrophage+cytotoxicity+towards+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells.</a> Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).</li>
<li>Yang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+phase-contrast+imaging+of+photothermal+treatment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+an+in+vitro+study+of+macrophages+as+a+vector+for+the+delivery+of+gold+nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells.</a> J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003(2012).</li>
<li>Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Replacement+of+Cetyl+Trimethylammonium+Bromide+by+Cationic+Thiol+Ligands+on+the+Surface+of+Gold+Nanorods+and+Their+Extremely+Large+Uptake+by+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).</li>
<li>Richard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).</li>
<li>Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+for+specific+intracellular+delivery+and+targeting+of+nanoparticles%3A+implications+for+developing+nanoparticle-mediated+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery.</a> Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).</li>
<li>Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+growth+mechanism+of+gold+nanorods+%28NRs%29+using+seed-mediated+growth+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method.</a> Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).</li>
<li>Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+control+in+the+overgrowth+of+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).</li>
<li>Niidome, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-modified+gold+nanorods+with+a+stealth+character+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications.</a> J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).</li>
<li>Tatini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+biological+profiles+of+PEGylated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+films+doped+with+gold+nanorods+as+laser-activatable+hybrid+bioadhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives.</a> Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanocomposite+films+for+laser-activated+tissue+bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding.</a> J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).</li>
<li>Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+photothermal+switch+for+controlled+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Graphene as a photothermal switch for controlled drug release.</a> Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).</li>
<li>Ratto, F., Witort, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmonic+Particles+that+Hit+Hypoxic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells.</a> Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).</li>
<li>Chithrani, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+uptake%2C+transport%2C+and+processing+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures.</a> Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+anticancer+therapies+with+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages.</a> J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).</li>
<li>Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+to+combat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer.</a> Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+fate+of+PEGylated+gold+nanoparticles+is+dependent+on+both+cell-penetration+peptides+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size.</a> ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).</li>
<li>Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+peptide-functionalized+gold+nanostars%3A+Enhanced+intracellular+delivery+and+efficient+NIR+photothermal+therapy+using+ultralow+irradiance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).</li>
<li>Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-membrane+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-membrane hydrogels.</a> Nature. 452, 76-79 (2008).</li>
<li>Matteini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermally+activated+hybrid+films+for+quantitative+confined+release+of+chemical+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).</li>
<li>Khor, E., Lim, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+applications+of+chitin+and+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable applications of chitin and chitosan.</a> Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).</li>
<li>Kennedy, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+enhance+gold+nanoparticle+delivery+to+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res.+Lett%22%5BJournal%5D)">T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo.</a> Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283(2011).</li>
<li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+destruction+of+murine+macrophage+cells+with+bioconjugated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).</li>
<li>Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+of+mesenchymal+stem+cells+in+living+mice+via+silica-coated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods.</a> ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+coated+with+multilayer+polyelectrolyte+as+contrast+agents+for+multimodal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+laser+assisted+microvascular+repair+and+end-to-end+anastomosis+by+means+of+indocyanine+green-infused+chitosan+patches%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study.</a> Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Koncepcja celowania w makrofagi związane z nowotworem staje się potężną koncepcją walki z rakiem 34,35,36. Tutaj, zamiast ich niszczenia, komórki te są rekrutowane jako wehikuły komórkowe do wprowadzania złotych nanoprętów do guza, poprzez wykorzystanie ich tropizmu. Ta perspektywa wymaga przemyślanego projektowania cząstek, ich integracji z komórkami i ich charakterystyki. Odkryliśmy, że fotostabilność mysich makrofagów obciążonych nanoprętami złota kationowego nie ...

W ciągu ostatniej dekady, różne plazmoniczne cząstki, takie jak złote nanopręty, nanopowłoki i nanocage'y, zyskały znaczną uwagę do zastosowań w optyce biomedycznej 1,2,3,4. W przeciwieństwie do standardowych nanosfer złota, te nowsze cząstki rezonują w oknie bliskiej podczerwieni (NIR), które zapewnia najgłębszą penetrację optyczną przez ciało i najwyższy kontrast optyczny w stosunku do składników endogennych1. Cecha ta wzbudziła zainteresowanie innowacyjnymi zastosowaniami, takimi jak obrazowanie fotoakustyczne (PA) i fototermiczna ablacja nowotworów. Jednak kilka problemów ogranicza kliniczną penetrację tych cząstek. Na przykład, ich aktywacja optyczna ma tendencję do wywoływania ich przegrzania i modyfikowania ich kształtów funkcjonalnych w kierunku bardziej sferycznych profili, co napędza fotoniestabilność 5,6,7,8,9. Inną kwestią, która dominuje w debacie naukowej, jest ich ogólnoustrojowe dostarczanie do nowotworów. W szczególności złote nanopręty łączą rozmiary, które są idealne do przenikania guzów, które wykazują zwiększoną przepuszczalność i retencję oraz łatwość koniugacji ze specyficznymi sondami markerów złośliwych. Dlatego ich przygotowanie do bezpośredniego wstrzyknięcia do krwiobiegu jest postrzegane jako wykonalny schemat 10,11,12,13. Jednak ta droga pozostaje problematyczna, ponieważ większość cząstek zostaje wychwycona przez jednojądrzasty system fagocytów 10,11,12. Ponadto kolejnym problemem jest stabilność optyczna i biochemiczna cząstek po cyrkulacji w organizmie14. Kiedy cząstki tracą swoją stabilność koloidalną i agregują się, ich cechy plazmoniczne i dynamika wymiany ciepła mogą ucierpieć z powodu sprzężenia plazmonicznego15,16,17 i przegrzania krzyżowego18.
Ostatnio pojawiła się koncepcja wykorzystania tropizmu makrofagów związanych z nowotworem jako inteligentna alternatywa 19,20,21. Komórki te mają wrodzoną zdolność do wykrywania i przenikania nowotworów z wysoką specyficznością. Dlatego jedną z perspektyw może być wyizolowanie tych komórek od pacjenta, naładowanie ich złotymi nanoprętami in vitro, a następnie wstrzyknięcie ich z powrotem pacjentowi, z zamiarem wykorzystania ich jako nośników komórkowych odpowiedzialnych za poród. Kolejną zaletą byłoby uzyskanie większej kontroli nad stabilnością optyczną i biochemiczną cząstek, ponieważ ich biologiczny interfejs byłby konstruowany in vitro. Mimo to wydajność tych nośników komórkowych jako optycznych środków kontrastowych wymaga krytycznej analizy.
W tej pracy opisujemy przygotowanie i krytyczne problemy z nośnikami komórkowymi zawierającymi złote nanopręty do obrazowania PA raka. Pegylowane nanopręty złota są modyfikowane czwartorzędowymi związkami amoniowymi22 w celu uzyskania profilu kationowego, który ma sprzyjać ich interakcjom z błonami plazmatycznymi 23,24. Cząstki te są poddawane wydajnemu i niespecyficznemu pobieraniu przez większość rodzajów komórek, miejmy nadzieję, że bez zbytniego ingerowania w ich funkcje biologiczne. Mysie makrofagi są obciążone nawet 200 000 nanoprętów złota kationowego na komórkę, które zostają zamknięte w ciasnych pęcherzykach endocytarnych. Taka konfiguracja powinna budzić niepokój ze względu na zagrożenie sprzężenia plazmonicznego i przegrzania krzyżowego wewnątrz tych pęcherzyków. Dlatego makrofagi są osadzone w biopolimerowych hydrożelach, które naśladują tkanki biologiczne, w celu sprawdzenia, czy większość stabilności konwersji PA cząstek jest zachowana podczas przenoszenia z pożywki wzrostowej do pęcherzyków endocytarnych. Opracowywane są skuteczne kryteria pomiarowe w celu zmierzenia stabilności konwersji PA w warunkach bezpośredniego zainteresowania obrazowaniem PA. Próg przekształcania jest ustalany na samym początku niestabilności optycznej po ciągu 50 impulsów laserowych z typową częstotliwością powtarzania 10 Hz.
Jesteśmy przekonani, że te wyniki mogą dać impuls do rozwoju nowych strategii dostarczania cząstek plazmonicznych do nowotworów.

<table><tbody><tr><td>Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Do syntezy nanoprętów złota</td></tr><tr><td>Trójwodzian chlorku złota(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Do syntezy nanoprętów złota</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Do syntezy nanoprętów złota</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Do syntezy nanoprętów złota</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Do syntezy nanonasion złota</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>To PEGylate złotych nanoprętów. Masa cząsteczkowa około 5,000 Da.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Do PEGylacji nanoprętów złota i solubilizowania chitozanu</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Do PEGylowania nanoprętów złota</td></tr> <tr><td>(11-merkaptoundecylo)-N,N,N-bromek trimetyloamoniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>Do modyfikacji złotych nanoprętów czwartorzędowymi związkami amoniowymi</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Do solubilizacji (11-merkaptoundecylu)-N,N,N-trimetyloamoniowego bromku</td></tr><tr><td>Polisorbat 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Do wirowania pegylowanych nanoprętów złota</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Do zawieszania nanoprętów złota przed inkubacją z komórkami i do traktowania osadów komórek</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Mysia linia komórkowa monocytów/makrofagów</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Do dodania do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td></td><td>Lonza BE17-605E</td><td>Do dodania do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Do dodania do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Hodowla komórkowa danie</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Chitozan, niskocząsteczkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% deacetylowany. Masa cząsteczkowa około 120 000 Da.</td></tr><tr><td>Hydroksyd sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Do nierozpuszczalności chitozanu i generowania hydrożelu</td></tr><tr><td>Polistyrenowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Używane jako formy do wytwarzania hydrożeli chitozanowych</td></tr><tr><td>Optyczny oscylator parametryczny pompowany przez trzecią harmoniczną lasera Nd:YAG z przełączaniem Q</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Źródło wzbudzenia optycznego do badań fotoakustycznych</td></tr><tr><td>Detektor piroelektryczny&nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Kanada</td><td>QE8SP</td><td>Do monitorowania fluencji optycznej w testach fotoakustycznych</td></tr><tr><td>Hydrofon igłowy ze wstępnie wzmocnionym</td><td>precyzyjną akustyką, Dorset, Wielka Brytania</td><td>Model z czujnikiem o średnicy 1 mm i zakresie częstotliwości 1-20 MHz</td><td>Do pomiaru sygnałów fotoakustycznych</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Złote nanopręty są atrakcyjne dla szeregu zastosowań biomedycznych, takich jak ablacja fototermiczna i obrazowanie fotoakustyczne raka, dzięki ich intensywnej absorbancji optycznej w oknie bliskiej podczerwieni, niskiej cytotoksyczności i potencjałowi do dominowania w nowotworach. Jednak ich dostarczanie do nowotworów nadal pozostaje problemem. Innowacyjne podejście polega na wykorzystaniu tropizmu makrofagów związanych z nowotworem, które mogą być obciążone złotymi nanoprętami in vitro. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i kontrolę fotoakustyczną pojazdów komórkowych zawierających złote nanopręty. Pegylowane nanopręty złota są modyfikowane czwartorzędowymi związkami amoniowymi, w celu uzyskania profilu kationowego. W kontakcie z mysimi makrofagami na zwykłych szalkach Petriego okazuje się, że cząstki te ulegają masowemu wchłanianiu do pęcherzyków endocytarnych. Następnie komórki te są zatopione w biopolimerowych hydrożelach, które służą do sprawdzenia, czy stabilność konwersji fotoakustycznej cząstek jest zachowana w ich włączeniu do nośników komórkowych. Jesteśmy przekonani, że wyniki te mogą stanowić nową inspirację do opracowania nowych strategii dostarczania cząstek plazmonicznych do nowotworów.

W niniejszym materiale wykazano wykonalność zastosowania nośników komórkowych zawierających nanopręty złota do obrazowania PA w nowotworach, wraz z typowymi wynikami protokołu.
Obrazy TEM na Rysunku 1 przedstawiają typowy wygląd cząstek po kroku 1 oraz ich nośników komórkowych po kroku 2. Przygotowanie cząstek i komórek do obrazowania TEM opisano w innym opracowaniu17. Kationowe złote nanopręty ulegaj...

Pokazujemy przygotowanie i zajmujemy się wykonalnością nośników komórkowych zawierających złote nanopręty do fotoakustycznego obrazowania raka.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie nośników komórkowych zawierających nanopręty złota jako innowacyjnej strategii dostarczania cząsteczek plazmonicznych do guzów. Nasz protokół może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju podejść fotoakustycznych i fototermicznych w obrazowaniu i leczeniu raka przy użyciu egzogennych środków kontrastowych. Metoda ta opiera się na tropizmie makrofagów związanych z guzem w celu dostarczenia cząsteczek plazmonicznych do nowotworów.Koncepcja polega na wyizolowaniu tych komórek od pacjenta, załadowaniu ich cząstkami plazmonicznymi in vitro, a następnie ponownym wstrzyknięciu do organizmu gospodarza w celu wykorzystania ich jako nośników estrogenu. Jedną z zalet tego podejścia jest możliwość uzyskania większej kontroli nad stabilnością optyczną i biochemiczną cząstek, ponieważ ich interfejs biologiczny jest w pełni konstruowany in vitro. W pierwszej kolejności należy oczyścić sześć mililitrów nanoprętów złota stabilizowanych cetrymoniem o stężeniu złota 450 µM, wykorzystując dwie centrifugacje, a następnie dekantowanie i przemywanie w 500 µM wodnym roztworze bromku cetrymonyum.Następnie do naczynia zawierającego osad cząsteczek złota należy dodać 1,5 ml 100 mM buforu octanowego z bromkiem cetrymonium i polisorbatem 20. Potem dodaje się 7,5 µl 10 mM alfa-metoksy-omega-merkapto glikolu polietylenowego w wodzie i pozostawia do reakcji na 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaje się 7,5 µl 100 mM bromku merkaptoundecylotrimetyloamoniowego w dimetylosulfoksydzie.Następnie pozostawić mieszaninę reakcyjną na 24 godziny w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach dodać 4,5 ml 0,005% polysorbate 20 w wodzie. Następnie, wykorzystując ten łagodny roztwór polysorbate 20, oczyścić cząsteczki, przeprowadzając cztery cykle wirowania i dekantacji.Na koniec przenieś cząstki do 600 µL sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Nominalne stężenie złota powinno teraz wynosić 4,5 mM. Aby przygotować komórki, wysiej do dwóch szalek o średnicy 60 mm po pół miliona komórek makrofagów monocytarnych w uzupełnionym pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium i inkubuj je przez 24 godziny.Po 24 godzinach należy wymienić pożywkę komórkową na świeżą, uzupełnioną o przygotowane kationowe nanopręty złota, aby uzyskać końcowe stężenie 100 micromolar złota i roztworu w każdej szalce Petriego. Następnie inkubację należy kontynuować przez kolejne 24 godziny. Następnego dnia należy sprawdzić komórki pod mikroskopem.Komórki powinny mieć prawidłową morfologię oraz liczne ciemne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe. Jeśli komórki wyglądają prawidłowo, należy je wypłukać świeżą pożywką, odjąć za pomocą skrobaka i połączyć komórki z dwóch szalek, aby uzyskać co najmniej dwa miliony komórek w jednej próbce. Następnie próbki należy odwirować przy 120 Gs przez 6 minut w celu usunięcia nadmiaru kationowych nanoprętów złota.Odcentrygowane nadsączone należy usunąć. Osady komórkowe powinny mieć niemal czarny kolor. Osady należy zawiesić w dwóch mililitrach soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, a następnie policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera.Następnie zmieszać zawiesiny zawierające dwa miliony komórek i odwirować je przy 120 Gs przez sześć minut. Resuspender osady w dwóch mililitrach 3,6% formaldehydu i soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie inkubować komórki w celu utrwalenia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec usunąć utrwalacz, wykonując trzy przemycia solą fizjologiczną buforowaną fosforanem.Na dzień przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować 500 µL zakwaszonego 3% w/v roztworu niskocząsteczkowego chitosanu. pH 4.5 należy uzyskać poprzez dodanie kwasu octowego. Aby dokładnie zmieszać roztwór, należy pozostawić go do homogenizacji przez 24 godziny w temperaturze 40 °C.Następnego dnia zmieszaj przygotowane makrofagi mysie z nanoprętami złota z wszystkimi 500 µL roztworu chitosanu. Aby uzyskać fantomy o grubości 50 µm, nanieś 250 mg mieszaniny do form polistyrenowych o powierzchni 1,9 cm². Próbki pozostaw w dygestorium na 24 godziny.Następnego dnia potraktuj próbki 500 µL 1 M wodnego wodorotlenku sodu w celu wywołania sieciowania, a następnie przemyj je 10 mL ultra-czystej wody. Przeanalizuj stabilność konwersji fotoakustycznej za pomocą zmodyfikowanego mikroskopu fotoakustycznego, który jest wyposażony w oscylator parametryczny, tłumik do regulacji fluencji optycznej oraz przetwornik ultradźwiękowy. Rozpocznij od zawieszenia filmu z chitozanu zawierającego makrofagi w wodzie dejonizowanej, używając plastikowego uchwytu zanurzonego w zbiorniku z wodą.Należy określić taką fluencję wiązki sondującej, która nie uszkodzi próbki i zapewni emisję fotoakustyczną o wystarczającym stosunku sygnału do szumu. Należy ustawić próbny poziom fluencji oraz parametry akwizycji. Dla każdego impulsu lasera należy zarejestrować odpowiadający mu sygnał fotoakustyczny z przetwornika ultradźwiękowego.Obliczyć stosunek natężenia fotoakustycznego do fluencji lasera dla każdego impulsu. Przeanalizować trend tej wartości w zależności od numeru impulsu i zweryfikować jej stabilność w czasie. W przypadku niestabilności powtórzyć pomiar przy niższej fluencji próbnej.W przypadku badania stabilności, fluencję próbną można wykorzystać jako fluencję sondowania, pod warunkiem, że jej emisja fotoakustyczna wykazuje odpowiedni stosunek sygnału do szumu. Następnie należy zmierzyć fluencję progu zmiany kształtu. Wybierz losowy punkt próbki, ustaw laser na fluencję sondowania i zmierz średnią intensywność fotoakustyczną, A, dla 500 impulsów.Następnie należy zwiększyć nominalną fluencję powyżej fluencji sondy i dostarczyć 50 impulsów. Średnią fluencję tych impulsów oznaczamy jako F excitation. Należy zresetować laser do fluencji sondy i powtórzyć pomiar, wyznaczając średnią intensywność fotoakustyczną, B, z 500 impulsów.Następnie oblicz stosunek R wartości B do A. Wartość R mniejsza od jedności wskazuje na wystąpienie nieodwracalnej zmiany właściwości optycznych próbki. Dalej, za pomocą stolika mikrometrycznego przesuń film, aby w losowych miejscach zmienić punkt pomiarowy próbki. Następnie powtórz pomiar R dla różnych wartości wzbudzenia F, aby uzyskać kilka wartości R w okolicach jedności oraz poniżej niej.Zbiór około 15 punktów R stanowi rozsądną ilość danych. Następnie należy wykreślić R jako funkcję wzbudzenia F i zidentyfikować próg zmiany kształtu jako taką fluencję, przy której R odbiega od jedności poza zakres niepewności. Zazwyczaj kationowe nanopręty złota ulegają masywnej akumulacji w makrofagach, które zachowują swoją normalną morfologię.Stwierdzono, że cząsteczki są zamknięte w ciasnych pęcherzykach endocytarnych. W dalszej fazie procesu włączenie w hydrożel chitosanowy nie wydaje się wpływać na morfologię komórkową. Komórki są dobrze rozproszone w całej próbce, co widać na mikrografii.Kontrole w postaci błon chitozanowych zawierających nanopręty złota bez komórek są jednorodne. Pasma plazmonowe nanoprętów złota zostają zachowane w ich nośnikach komórkowych. Efekty takie jak sprzęganie plazmonowe lub zróżnicowany pobór cząsteczek o różnej wielkości i kształcie nie odgrywały istotnej roli w tych protokołach.Po zebraniu danych, trend R w funkcji wzbudzenia F pozwala na wstępną ocenę danych oraz analizy wymaganej do wyznaczenia progu F. W tym przypadku próg F wyniósł około 11 mJ/cm². Pomiary fotoakustyczne charakteryzowały się wysoką dokładnością, z stosunkiem sygnału do szumu przekraczającym 20 w ciągu 500 impulsów.Nasz protokół jest innowacyjny w stosunku do istniejących metod pod względem konstrukcji cząstek oraz badania ich fotostabilności. Modyfikacja pegylowanych złotych nanoprętów kationami amoniowymi czwartorzędowymi zapewnia wysoką wydajność pobierania komórkowego przy zachowaniu stabilności koloidalnej. Pomiar stabilności konwersji fotoakustycznej poprzez zdefiniowanie progu zmiany kształtu jest ilościowy i powtarzalny.Ponieważ cząstki te są przeznaczone jako środki kontrastowe do obrazowania fotoakustycznego, sonda fotoakustyczna jest idealnym narzędziem do testowania ich właściwości funkcjonalnych. Komórkowe nośniki cząstek plazmonicznych są widoczne jako środki kontrastowe w obrazowaniu fotoakustycznym. Ich fotostabilność jest taka sama, jak w przypadku wolnych cząstek plazmonicznych.Celem naszych obecnych prac jest analiza fizjologii tych komórek, ze szczególnym uwzględnieniem ich żywotności oraz aktywności chemotaktycznej.

preparation-photoacoustic-analysis-cellular-vehicles-containing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zsyntetyzowaliśmy złote nanogwiazdy o kształcie gwiazdy, wykorzystując metodę wzrostu wspomaganego srebrnymi zarodkami. Średnica nanogwiazd wynosi od 200 do 300 nm, a liczba ramion waha się od 7 do 10. Nanocząstki wykazują szeroki mod powierzchniowego rezonansu plazmonowego z maksimum w bliskiej podczerwieni.

Synteza nanogwiazd złota metodą wzrostu sterowanego srebrnymi nasionami

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii ciemnego pola (DFM) połączoną z analizą śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w celu monitorowania interakcji plazmonicznych nanoprętów złota z błoną komórkową określonej linii komórkowej. Połączona analiza DFM i SPT pozwala na wizualizację ruchu nanoprętów przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Mikroskopia ciemnego pola do wizualizacji dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów na błonie komórkowej

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Ten protokół opisuje, jak wykorzystać przejściowe ogrzewanie związane z optyczną absorpcją nanoprętów złota do stymulowania różnicowania i wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia w komórkach neuronalnych. Wyniki te potencjalnie otwierają nowe zastosowania w protezach neuronalnych i podstawowych badaniach w neurobiologii.

Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana złotem nanoprętami

Opisujemy prostą metodę wytwarzania wysoce stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota poprzez redukcję kwasu chloroaurowego (HAuCl4) tiocyjanianem sodu (NaSCN). Oligoklastry mają wąski rozkład wielkości i mogą być produkowane w szerokim zakresie rozmiarów i powłok powierzchniowych.

Prosta metoda kontrolowanej wielkości syntezy stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota w warunkach otoczenia

Ten protokół opisuje prostą metodę przygotowania zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło z dostępnymi na rynku materiałami. Pokazuje również, jak zmierzyć proces kawitacji mikropęcherzyków zsyntetyzowanych liposomów po leczeniu laserem impulsowym.

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

Ten artykuł opisuje protokół syntezy nanoprętów złota, oparty na użyciu hydrochinonu jako środka redukującego, a także różne mechanizmy kontroli ich wielkości i proporcji.

Synteza nanoprętów złota oparta na hydrochinonach

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Plazmoniczne nanopręty złota mogą być uwięzione w cieczach i obracane z częstotliwością kHz za pomocą pęsety optycznej o polaryzacji kołowej. Wprowadzenie narzędzi do analizy dynamiki Browna i spektroskopii rozpraszania światła prowadzi do powstania potężnego systemu do badań i zastosowań w wielu dziedzinach nauki.

Budowa i działanie napędzanego światłem układu silnika obrotowego Gold Nanorod

Opisana jest niezawodna i łatwo odtwarzalna metoda przygotowania funkcjonalnych, emitujących światło podczerwone fotoluminescencyjnych nanoklastrów złota i ich bezpośredniego wykrywania wewnątrz komórek HeLa za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Synteza nanoklastrów złota emitujących promieniowanie bliskiej podczerwieni do zastosowań biologicznych

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Poznaj metodę przygotowania makrofagów zawierających nanopręty złota do fotoakustycznego obrazowania nowotworów. Protokół wykorzystuje naturalne tropizm komórek do docelowego dostarczania cząstek plazmonicznych.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Przeglądaj więcej filmów