Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalne odtworzenie kanałów mezcalu w interfejs kropelkowy, system dwuwarstwowy oraz zbadanie reakcji tych wrażliwych na mechaniczne kanały na harmoniczne bodźce mechaniczne. Metoda ta umożliwia badanie aktywności mechanicznej meskalowej mutanta V 23 T w odpowiedzi na harmoniczne wzbudzenie mechaniczne po rozpuszczeniu do granicy faz kropel za pomocą systemu warstwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona zalety techniczne zarówno techniki zacisku krosowego, jak i interfejsu kropel za pomocą metod warstwowych z możliwością miniaturyzacji, a także możliwością kontrolowania składu chemicznego każdej strony membrany.

Aby sformułować liposomy, przygotuj 10 mililitrów roztworu lipidowego o stężeniu dwóch miligramów na mililitr, dodając 10 mililitrów buforu chlorku potasu do 20 miligramów syntetycznych lipidów D-P-H-P-C zakupionych w postaci liofilizowanego proszku. Upewnij się, że zarówno nośniki lipidowe, jak i roztwór buforowy są dokładnie wymieszane. Mieszanina powinna wyglądać na jednorodną i zamgloną, gdy wszystko się rozpuści.

Zamroź mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, teraz całkowicie rozmrozić nową mieszaninę lipidów, pozwalając mieszaninie rozmrozić się w temperaturze pokojowej, a nie w ogrzewanym środowisku. Po łącznie sześciu cyklach zamrażania i rozmrażania użyj dostępnej na rynku wytłaczarki do wytłaczania lipidów, przetłaczając całą zawiesinę lipidową najpierw przez filtr membranowy z poliwęglanu o grubości 0,4 mikrona, a następnie sześciokrotnie przez filtr membranowy o grubości 0,1 mikrona. W wyniku tego procesu powstają cząstki o średnicach bliskich 100 nanometrów.

Aby wyprodukować zbiornik oleju, wywierć dwa przeciwległe otwory w ściance akrylowego cylindra o średnicy dwóch cali i długości 1,5 centymetra. Otwory powinny mieć średnicę jednego milimetra i jeden centymetr od dołu. Następnie wywierć dwa czteromilimetrowe otwory koncentryczne do wcześniej wywierconych otworów o długości jednego milimetra.

Głębokość otworów powinna wynosić jeden milimetr każdy. Uważaj, aby nie przewiercić ich do końca. Otwory te są wykonane tak, aby pasowały do gumowych uszczelek.

Umieść i przyklej dwie gumowe uszczelki o średnicy wewnętrznej jednego milimetra w większych otworach, aby zapobiec wyciekaniu oleju. Następnie przyklej maszynę do cylindra do cienkiego arkusza akrylowego o wymiarach 10 na 10 centymetrów za pomocą dowolnej uniwersalnej żywicy epoksydowej w dniu eksperymentu, przytnij siedmiocentymetrowe srebrne druty o średnicy 2 250 mikronów, a następnie zanurz ich końcówki w wybielaczu na dwie godziny. Aby utworzyć powłokę chlorku srebra, szary kolor wskazuje, że powstała powłoka chlorku srebra.

Za pomocą noża do szkła podziel 10-centymetrową kapilarnę ze szkła krzemianowego o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej 58 milimetrów na dwie pięciocentymetrowe kapilary. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki z igłą o końcówce o rozmiarze 18 napełnij naczynia włosowate hydrożelem P-E-G-D-M-A, aby zapobiec pęcznieniu uwodnionego hydrożelu z kapilary. Zachowaj trzymilimetrowy odstęp na końcach i upewnij się, że w naczyniach włosowatych nie ma pęcherzyków powietrza.

Włóż srebrne elektrody chlorku srebra do kapilar wypełnionych hydrożelem. Utwardź hydrożel P-E-G-D-M-A poprzez fotopolimeryzację wolnych rodników po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego przez dwie minuty przy jednym wacie za pomocą plamki ultrafioletowej, eksperyment umieszcza się pod klatką Faradaya uziemioną do połączenia uziemiającego na wzmacniaczu krosowym. Podłącz jedną z mikropipet do prostego uchwytu mikroelektrody z męskim złączem.

Następnie podłącz uchwyt mikroelektrody do stopnia głównego wzmacniacza krosowego. Aby podłączyć stopień główny do uziemienia, izolowany drut miedziany o średnicy 18 do odpowiedniego złącza dla stopnia głównego, zamontuj stopień główny na trzyosiowym ręcznym mikromanipulatorze, najpierw mocując płytę montażową stopnia głównego do mikromanipulatora, a następnie podłączając stopień głowicy do płyty montażowej. Za pomocą odpowiednich przymocuj drugą mikropipetę do siłownika liniowego za pomocą złącza wykonanego w laboratorium, a następnie zamontuj obie na drugim manipulatorze mikrom.

Mikropipety powinny być ustawione naprzeciw siebie i wypoziomowane w poziomie. Następnie w szklanej fiolce wymieszaj 0,1 mililitra liposomów D-P-H-P-C z 0,01 mililitra roztworu liposomu mescal protea V 23 T. Za pomocą igły do mikronapełniania o rozmiarze 34 napełnij końcówki obu mikropipet roztworem proteosomu.

Umieść zbiornik na górze pionowego mikroskopu i przeprowadź mikropipety przez przeciwległe otwory o średnicy jednego milimetra. Następnie napełnij zbiornik do powierzchni hexa dekanem, aby uformować kuliste kropelki na końcach mikropipet. Użyj trzeciej mikropipety ze szkła krzemianowego o średnicy 10 mikronów, zamontowanej na trzecim manipulatorze mikrom, aby dozować rozcieńczony roztwór liposomu meskalowego protei V 23 T na końcówki mikropipet i uformować kropelki.

Kontroluj wielkość kropel, zmniejszając lub zwiększając objętość zgodnie z potrzebami i pozwól im odpocząć przez 10 minut, aby monowarstwy całkowicie się uformowały. Następnie doprowadź kropelki do kontaktu warstwami. Formacja nastąpi w ciągu jednej do dwóch minut.

Po skonfigurowaniu oprogramowania i sprzętu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj BNC, aby podłączyć wyjście generatora przebiegów do zewnętrznego przełącznika czołowego wejścia poleceń. Wyślij trójkątny przebieg o częstotliwości 10 Hz, 500 miliwoltów do stopnia głównego. Korzystanie z manipulatora mikrom.

Przesuń szklane mikropipety poziomo, aby doprowadzić do kontaktu kropel, aż lekko się zetkną, i poczekaj, aż nastąpi rozrzedzenie dwuwarstwowe. Postęp procesu tworzenia dwuwarstw można zobaczyć wizualnie przez mikroskop i można go monitorować za pomocą pomiarów prądu. Dostosuj rozmiar dwuwarstwy do około 250 mikronów średnicy, kontrolując położenie kropli zamontowanej na siłowniku za pomocą manipulatora, rozmiar dwuwarstwy można oszacować wizualnie za pomocą mikroskopu.

Gdy dwuwarstwa utworzy się i jest stabilna, stymuluj kropelki, wysyłając sygnał sinusoidalny za pomocą generatora funkcyjnego, aby stymulować białko meskalowe włączone do dwuwarstwy. Wyślij sinusoidalny kształt fali z amplitudą od szczytu do szczytu 175 mikronów, częstotliwością 0,2 herca i 50% cyklem pracy do sterownika serwera elektrycznego Pieto. Pokazano tutaj nietypowy zapis prądu w czasie rzeczywistym.

Zmierzona pojemność dwuwarstwy nagle wzrasta, wskazując na dwuwarstwowe przerzedzenie i powstawanie, zanim osiągnie stan ustalony. Dwuwarstwa może być kontrolowana poprzez zmianę położenia kropel, gdy DIB jest stymulowany mechanicznie, przy jednoczesnym utrzymaniu stałego potencjału prądu stałego w poprzek membrany. Mutant V 23 T mezcalu generuje niezawodne działania, w tym głównie stany podprzewodzące, a czasami pełne zdarzenia otwarcia.

Bramkowanie występuje głównie przy ściskaniu szczytowym, co wskazuje, że jest to związane ze wzrostem napięcia dwuwarstwowego, jak pokazano na wykresie biegunowym. W tym miejscu podkreślono zdolność tej techniki do wykorzystania do testowania innych typów biomolekuł. Ethin, który jest kanałem jonowym bramkowanym napięciem, zwiększa przepuszczalność membrany po zastosowaniu wzorca o potencjale transbłonowym DC.

Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby przypadkowo nie rozbić szklanych naczynek lub w inny sposób. Musisz ponownie uruchomić konfigurację i upewnić się, że wszystkie przewody są podłączone po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się kanałami aktywowanymi rozciąganiem do zbadania nowych metod, za pomocą których siły zewnętrzne mogą być przenoszone do bramki kanałów wrażliwych na wbudowany mechanizm DIB. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć interfejs kropelkowy za pomocą warstw, włączać wrażliwe kanały mechaniczne do sztucznych błon i stymulować te kanały mechanicznie.