Name: Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę wprowadzania bakteryjnych kanałów mechanowrażliwych do dwuwarstw interfejsu kropelkowego z wykorzystaniem mikropipet. Technika umożliwia precyzyjną stymulację mechaniczną i badanie aktywności mechanoelektrycznej kanałów MscL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji są wspierane przez Grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-12-1-0464.

<ol><li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22P+NATL+ACAD+SCI+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li>
<li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ANAL+CHEM%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li>
<li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+AM+CHEM+SOC%22%5BJournal%5D)">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+AM+CHEM+SOC%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li>
<li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+APPL+MATER+INTER%22%5BJournal%5D)">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li>
<li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22ANAL+CHEM%22%5BJournal%5D)">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li>
<li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarles%2C+SA+%22Physical+Encapsulation+of+Interface+Bilayers%22">Physical Encapsulation of Interface Bilayers</a>. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).</li>
<li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-based+biomolecular+smart+materials%5BTitle%5D)+AND+%22SMART+MATER+STRUCT%22%5BJournal%5D)">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018(2011).</li>
<li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22SMART+MATER+STRUCT%22%5BJournal%5D)">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023(2013).</li>
<li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Smart+Structures+and+Materials%2B+Nondestructive+Evaluation+and+Health+Monitoring%22%5BJournal%5D)">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626(2011).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22MOL+BIOSYST%22%5BJournal%5D)">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BIOPHYS+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432(1972).</li>
<li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization%3A+from+soap+bubbles%2C+kitchen+sink%2C+to+bilayer+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+MEMBRANE+SCI%22%5BJournal%5D)">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li>
<li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22NAT+REV+MOL+CELL+BIO%22%5BJournal%5D)">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li>
<li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels+in+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22ANNU+REV+MICROBIOL%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li>
<li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077(2012).</li>
<li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels%3A+identification+of+genes+required+for+MscS+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li>
<li>Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ%3A+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses%5BTitle%5D)+AND+%22BIOPHYS+J%22%5BJournal%5D)">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li>
<li>Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22J+GEN+PHYSIOL%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li>
<li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel%2C+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22J+GEN+PHYSIOL%22%5BJournal%5D)">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li>
<li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+COMPUT+BIOL%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+ion+channels+and+their+eukaryotic+homologs%22">Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs</a>. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).</li>
<li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis%3A+a+gated+mechanosensitive+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li>
<li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteinbacher%2C+S+%22Mechanosensitive+Ion+Channels%2C+Part+A%22">Mechanosensitive Ion Channels, Part A</a>. , 1-24 (2007).</li>
<li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22BIOPHYS+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22NAT+STRUCT+MOL+BIOL%22%5BJournal%5D)">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li>
<li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+structure%2C+orientation%2C+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22BIOPHYS+J%22%5BJournal%5D)">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834(2014).</li>
<li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120(2010).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li>
<li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li>
<li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-%E2%84%AB+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li>
<li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mechanosensacja oznacza jedną z pierwszych ścieżek transdukcji sensorycznej, które wyewoluowały w organizmach żywych. Wykorzystanie tego zjawiska do badania i zrozumienia właściwości mechanoelektrycznych DIB jest kluczowym krokiem w kierunku funkcjonalnych materiałów reagujących na bodźce. Polega na włączeniu i aktywacji mechanowrażliwego kanału, MscL, w DIB jako przetwornika mechanoelektrycznego i tensometru do wykrywania wzrostu napięcia na granicy faz dwuwarstwowych lipidów. Z drugiej strony, funkcja kanałów MS może być regulowana przez podstawowe właściwości materiałowe dwuwarstw lipidowych, w tym grubość, wewnętrzną krzywiznę i ściśliwość. W związku z powyższym, technika oparta na mikropipetach stanowi cenne narzędzie pozwalające badaczowi na badanie kanałów SM w DIB i dostarcza informacji na temat struktury dwuwarstwy lipidowej, a także interakcji lipid-białko.
W ciągu ostatnich trzech dekad patch-clamp był podstawową metodą badania kanałów MS, ponieważ umożliwia zaciskanie zarówno napięcia, jak i napięcia. Jednak zacisk krosowy wymaga nieporęcznego sprzętu i nie nadaje się do miniaturyzacji, co jest właściwością wymaganą do inżynierii urządzeń sensorycznych i konwersyjnych. DIB ze względu na swoją prostotę, stabilność i kompaktowość stanowią odpowiednie środowisko do badania aktywności MscL. W tym miejscu rozszerzamy wcześniejsze postępy w technikach tworzenia DIB, proponując technikę opartą na mikropipetach, z możliwością kontrolowania wielkości kropelek i granicy faz dwuwarstwowych, składu chemicznego każdej kropli oraz napięcia na granicy faz poprzez dynamiczną stymulację. Technika ta polega na zakotwiczeniu kropelek wody wodnej, zawierających proteoliposomy, do końcówek współosiowo przeciwstawnych szklanych naczyń włosowatych. Kropelki umieszcza się w kąpieli z rozpuszczalnikiem organicznym, a po wejściu w kontakt na granicy faz tworzy się dwuwarstwa lipidowa.
Mikropipety są przymocowane do oscylatorów piezoelektrycznych, co umożliwia poziome przemieszczanie kropel. Dynamiczne ściskanie kropel powoduje wzrost napięcia międzyfazowego na granicy faz wodno-olejowych, a tym samym wzrost napięcia dwuwarstwowego. Dwa główne aspekty odróżniają tę metodę od podobnej i niedawno opublikowanej techniki dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych (CBB)37. Za pomocą przedstawionej tu techniki wielkość dwuwarstwy jest kontrolowana za pomocą mikromanipulatorów, dzięki czemu objętości kropel pozostają stałe, w przeciwieństwie do metody CBB. Ponadto technika CBB wymaga zastosowania pomp ciśnieniowych, które nie są potrzebne w metodzie przedstawionej w tym artykule, co upraszcza i ułatwia budowę.
Jesteśmy w stanie wprowadzić i stymulować bakteryjną MscL po raz pierwszy bez użycia pipety z plastrem lub modyfikacji chemicznych38. Ponieważ system ułatwia tworzenie wytrzymałych asymetrycznych dwuwarstwowych błon lipidowych, bardziej naśladuje asymetrię lipidów występującą w błonach biologicznych. Pozwala nam to na badanie wpływu kontrolowanego składu lub asymetrii błony na aktywność MscL. Dodatkowo, dzięki technikom przetwarzania obrazu, metoda ta pomaga oszacować napięcie na granicy faz dwuwarstwowych. Technika ta pomaga w zrozumieniu zasad wzajemnej konwersji między siłami masowymi i powierzchniowymi w DIB, ułatwia pomiary podstawowych właściwości membrany i poprawia zrozumienie odpowiedzi MscL na napięcie membrany.
Chociaż ta metoda przybliża nas o krok w kierunku biomolekularnego systemu materiałowego reagującego na bodźce i do innego środowiska fizjologicznego do badania MscL, istnieją ograniczenia systemu. Napięcie w tym układzie nie może być zaciśnięte ze względu na obecność rezerwuaru lipidów w postaci liposomów w każdej kropli, który ma tendencję do zmniejszania napięcia na granicy faz olej/woda. Dlatego obecnie kanały mechanowrażliwe mogą być stymulowane w DIB tylko w reżimie dynamicznym. Obecność pęcherzyków powietrza w systemie znacząco wpływa na precyzję i powtarzalność eksperymentów. Pęcherzyki powietrza obecne w hydrożelach mogą spowodować utratę połączenia elektrycznego.
Chociaż opisujemy zastosowanie metody opartej na mikropipetach do stymulacji MscL, technika ta może być wykorzystana do badania innych typów kanałów SM i ma potencjał, aby zostać wykorzystana przez naukowców do badania różnych biomolekuł. Na przykład, podobny układ został wykorzystany w naszym laboratorium do zbadania odpowiedzi mechanoelektrycznej dwuwarstwowej membrany z interfejsem kropelkowym bez kanałów. Różne białka mogą być odtwarzane i aktywowane przy użyciu tego wysoce kontrolowanego układu, biorąc pod uwagę, że środowiska rekonstytucji każdej biomolekuły są różne. Opisana w artykule metoda dotyka znacznie szerszego potencjału aplikacyjnego, który ogranicza się jedynie do wyobraźni badacza.

W ciągu ostatniej dekady, montaż sztucznych dwuwarstw lipidowych został znacznie zaawansowany dzięki rozwojowi metody dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego. Znane jako stabilne i wytrzymałe, DIBy narzuciły się jako alternatywne systemy modelowe dla klasycznych malowanych (Mueller) i składanych (Montal-Mueller) płaskich dwuwarstw1. Chociaż pomysł wykorzystania kropelek do tworzenia dwuwarstw lipidowych sięga lat 60. XX wieku2, do niedawna nie zyskał na popularności. Pierwsza udana próba została zgłoszonaprzez grupę Takeushi 3, po której nastąpiło kilka badań demonstrujących tworzenie się dwuwarstw przy użyciu sieci kropel przez grupę Bayleya4-6. Ostatnio techniki enkapsulacji zostały zaproponowane przez grupę7-9 Lwa, która zapoczątkowała koncepcję wykorzystania DIB jako elementów budulcowych nowych systemów materialnych reagujących na bodźce10. W poprzednich badaniach DIB udowodniły swoją zdolność do reagowania na bodźce elektryczne9,11, chemiczne10,12 i optyczne13. Różne biomolekuły o różnych funkcjach reagujących na bodźce zostały skutecznie stymulowane po rozpuszczeniu w DIB10,14. W świetle tych udanych prób nasuwa się ważne pytanie: czy DIB może reagować na bodziec mechaniczny, gdy włączy się odpowiednie biomolekuły? Siły międzyfazowe działające na DIB różnią się od tych występujących w innych układach dwuwarstwowych15,16. W związku z tym napięcie w dwuwarstwie utrzymywane przez kropelki można kontrolować poprzez regulację napięcia na granicy faz woda-lipid-olej; Koncepcja ta nie ma zastosowania w przypadku malowanych lub składanych systemów dwuwarstwowych.
Kanały MscL, powszechnie znane jako zawory spustowe osmolitu i podstawowe elementy bakteryjnej błony cytoplazmatycznej, reagują na zwiększone napięcie błony17,18. W przypadku wstrząsów hipoosmotycznych kilka kanałów znajdujących się w błonie małej komórki19 może wygenerować potężną odpowiedź przepuszczalności, aby szybko uwolnić jony i małe cząsteczki, ratując bakterie przed lizą20. Biofizycznie MscL jest dobrze zbadany i scharakteryzowany przede wszystkim za pomocą techniki wydatnego zacisku punktowego21-23. Wiarygodne modele strukturalne wyjaśniające mechanizm bramkowania MscL24,25 są proponowane na podstawie struktury krystalicznej jego homologu26,27, modelowania28 i wyników szeroko zakrojonych eksperymentów 24,29-31. Pod przyłożonym napięciem ~10 mN/m, zamknięty kanał, który składa się ze ciasnego wiązki helis transbłonowych, przekształca się w pierścień bardzo nachylonych helis, tworząc ~28 A wypełniony wodą przewodzący por21,24,32. Ustalono również, że hydrofobowość ciasnej bramki, umieszczonej na przecięciu wewnętrznych domen TM1, określa próg aktywacji kanału33. W związku z tym stwierdzono, że zmniejszając hydrofobowość bramy, można obniżyć próg naprężenia22. Ta właściwość MscL umożliwiła zaprojektowanie różnych zaworów sterowalnych34, głównie do celów dostarczania leków. Pomimo wszystkich wyżej wymienionych właściwości i w oparciu o swoją fundamentalną rolę polegającą na przekształcaniu nadmiernych napięć błony komórkowej w czynności elektrofizjologiczne, MscL doskonale nadaje się jako przetwornik mechanoelektryczny w DIB.
W tym artykule prezentujemy oryginalną metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach i mierzenia aktywności włączonych kanałów MscL pod wpływem stymulacji mechanicznej. Po raz pierwszy donosimy o odpowiedzi DIB na bodziec mechaniczny i funkcjonalnej rekonstytucji niskoprogowego mutanta V23T MscL w DIBs35.
System eksperymentalny składa się z zamkniętych w lipidach kropelek wodnych zakotwiczonych na końcach dwóch przeciwległych mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Kiedy kropelki stykają się z dwuwarstwowym interfejsem lipidowym. Technika ta zapewnia kontrolę nad składem chemicznym i wielkością każdej kropli (masy), a także nad wymiarami granicy faz dwuwarstwowych. Ponadto można łatwo utworzyć asymetryczne błony o różnym składzie lipidowym w każdej ulotce. Posiadanie jednej z mikropipet podłączonych do harmonicznego siłownika piezoelektrycznego zapewnia możliwość zastosowania zaprogramowanego bodźca jednocyklowego lub oscylacyjnego. Napięcie jest dostarczane do sztucznej membrany poprzez ściskanie obu podtrzymujących ją kropel. W wyniku deformacji kropel zwiększają się obszary granicy faz woda-lipid-olej, a jednocześnie zmniejsza się kąt między kropelkami, powodując wzrost napięcia błony i przejściową aktywację MscL. Poprzez analizę kształtów kropel podczas odkształcania można było oszacować naprężenie powstające na granicy faz. Chociaż w tym artykule skupiamy się na właściwościach mechano-transdukcji DIB, podkreślamy również, że inne rodzaje biomolekuł, takie jak alatetycyna, mogą być aktywowane przez tę wielofunkcyjną platformę. Poniżej krok po kroku przedstawiamy wszystkie aspekty techniczne przygotowania, montażu i wykonywania pomiarów tą nową metodą.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr</td><td>Corning</td><td>430624</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Zakupiony jako liofilizowany proszek</td></tr><tr><td>Microfil o grubości 34 World</td><td>Precision Instruments</td><td>MF24G-5</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Butelki wirówki</td><td>ThermoFisher</td><td>3141</td><td>Generator funkcji Agilent Nalgene</td></tr><tr><td>/Generator przebiegów arbitralnych, 20 MHz</td><td>Keysight Technologies</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillian</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1760</td><td>ACS Klasa</td></tr><tr><td>Avanti&reg; Mini-ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Carl</td> <td>Zeiss-AxioCam</td><td></td></tr> <tr><td>HSm</td> Wzmacniacz <td>Carl Zeiss-Axopatch</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200B&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne-Zestaw</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Generator przemiatania/funkcyjny</td><td>Digi-Key</td><td>BK4017B-ND</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy</td><td>7 Spectra/Por</td><td>132113</td><td>MWCO 8000, średnica 7,5 mm</td></tr><tr><td>System DigiData 1440A</td><td>Urządzenia molekularne-DNAse</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Serwosterownik Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>E-625 PZT&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>E-526</td><td></td></tr><tr><td>FPLC System</td><td>Pharmacia Biotech-HCl</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecane, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td></td></tr><tr><td>Homoginizator</td><td>Wheaton</td><td></td><td>357426 15 mL</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Affymetrix</td><td>17886</td><td></td></tr><tr><td>IRGACURE&reg; 2959</td><td>IRGACURE&reg;</td><td></td><td></td>555047962</tr><tr><td>Filtry membranowe izoporowe&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>VCTP02500</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACS Klasa</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7100</td><td>ACS Grade</td></tr><tr><td>Kimble-Chase</td><td>Kontes</td><td>420401-1515</td><td>Flex-Column</td></tr><tr><td>LED-100 Utwardzanie punktowe UV System</td><td>Electro-Lite, korporacja</td><td>81170</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Ręczne mikromanipulatory z zaciskiem krosowym</td><td>Thorlabs</td><td>PCS-520N</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td> Uchwyt mikroelektrody <td>klasy ACS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH1S</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS, minimalna 99,5% miareczkowanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td></td><td>Airgas UN1066</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD</td><td>SX0420-1</td><td>ACS Grade</td></tr><tr><td>Ni NTA koraliki agarozowe</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>1000632</tr><tr><td>optycznie przezroczysta odlewana rura akrylowa, 2-1/2 "OD x 2" ID</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K545</td><td></td></tr><tr><td>P-601 Siłownik liniowy sterowany flexure PiezoMove</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-601</td><td></td></tr><tr><td>PAGE żel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9033</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M&reg; Uniwersalna folia laboratoryjna</td><td>Parafilm&reg;</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)1000 dimetakrylan</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe z poliwęglanu (PCTE), czarne, 0,4 mikrona, 25mm, 100/pk</td><td>Sterlitech Corporation</td><td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bezpudrowe miękkie nitrylowe rękawice diagnostyczne&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>CA89-38-272</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka zamienna 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>GO1-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5750</td><td></td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>GoodFellow</td><td>147-346-94</td><td>W zależności od zastosowania można zastosować różne średnice&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki z azydkiem sodu</td><td>Affymetrix</td><td>21610</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>14-961-27</td><td>12 x 130 mm</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>Ultracal 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td>Amicore Ultra 30 MWCO</td></tr><tr><td>VWR Lekkie wycieraczki do tkanek</td><td>VWR International</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>VWR Scientific 50D Ultradźwiękowe Środek czyszczący</td><td>VWR International</td><td>13089</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczacz wody</td><td>Barnstead</td><td>D11931</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-oktylglukopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>O311S</td><td></td></tr></tbody></table>

wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MscL, duży kanał mechanowrażliwy na przewodnictwo (MSC), to wszechobecny zawór uwalniający osmolit, który pomaga bakteriom przetrwać nagłe wstrząsy hipoosmotyczne. Został odkryty i rygorystycznie badany przy użyciu techniki patch-clamp przez prawie trzy dekady. Jego podstawowa rola polegająca na przekształcaniu napięcia przyłożonego do błony komórkowej na odpowiedź przepuszczalności sprawia, że jest silnym kandydatem do pełnienia funkcji przetwornika mechanoelektrycznego w urządzeniach biomolekularnych opartych na sztucznej membranie. Służąc jako elementy składowe takich urządzeń, dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB) mogą być używane jako nowa platforma do włączania i stymulacji kanałów MscL. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na mikropipetach do tworzenia DIB i pomiaru aktywności wbudowanych kanałów MscL. Metoda ta składa się z kropelek wodnych pokrytych lipidami zakotwiczonych na końcach dwóch przeciwległych (współosiowo ustawionych) mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Kiedy kropelki stykają się, tworzy się dwuwarstwowy interfejs lipidowy. Technika ta zapewnia kontrolę nad składem chemicznym i wielkością każdej kropli, a także wymiarami dwuwarstwowego interfejsu. Posiadanie jednej z mikropipet podłączonych do harmonicznego siłownika piezoelektrycznego zapewnia możliwość dostarczenia pożądanego bodźca oscylacyjnego. Poprzez analizę kształtów kropel podczas odkształcania można oszacować naprężenie powstające na granicy faz. Za pomocą tej techniki raportowana jest pierwsza aktywność kanałów MscL w systemie DIB. Oprócz kanałów MS, za pomocą tej metody można badać aktywność innych typów kanałów, co dowodzi wielofunkcyjności tej platformy. Przedstawiona tutaj metoda umożliwia pomiar podstawowych właściwości błony, zapewnia większą kontrolę nad powstawaniem błon symetrycznych i asymetrycznych oraz jest alternatywnym sposobem stymulacji i badania kanałów mechanowrażliwych.

Ryciny 1 i 2 przedstawiają układ doświadczalny oraz sprzęt wykorzystany do rejestracji aktywności białek podczas mechanicznej stymulacji błony lipidowej. Aby zminimalizować szumy elektryczne w pomiarach, stanowisko badawcze umieszczono w klatce Faradaya wykonanej w laboratorium, uziemionej poprzez połączenie z uziemieniem wzmacniacza AxoPatch 200 B.
Utworzenie stabilnej izolującej lipidowej dwuwarstwy jest kluczowym etapem w tym badaniu. W tej konfiguracji monowarstwa lipidowa gromadzi się na granicy faz olej/woda w kropelkach wodnych zanurzonych w kąpieli z rozpuszczalnikiem organicznym. Gdy kropelki zostaną ze sobą zetknięte, nadmiar oleju zostaje usunięty, a przeciwstawne monowarstwy lipidowe zwężają się do lipidowej dwuwarstwy o grubości dwóch cząsteczek. Najczęstszą techniką stosowaną w charakterystyce dwuwarstw jest clamp napięciowy (voltage-clamp). W metodzie clamp napięciowego napięcie w poprzek dwuwarstwy jest utrzymywane na stałej wartości, podczas gdy mierzy się przepływ prądu. Rysunek 4 przedstawia typowy zapis prądu w czasie rzeczywistym podczas początkowego tworzenia się dwuwarstwy. Znając pojemność właściwą (~0,6 μF/cm2)5 lipidowej dwuwarstwy DPhPC, można obliczyć powierzchnię utworzonej dwuwarstwy. Powierzchnią dwuwarstwy można sterować poprzez zmianę położenia kropelek (Rysunek 4A). Przy użyciu aktuatora piezoelektrycznego można przykładać do kropelek różne typy przebiegów (sinusoidalne, prostokątne, trójkątne, itp) o różnych częstotliwościach, amplitudach i cyklach pracy, aby wywołać ich oscylacje w płaszczyźnie poziomej i osiowej, a tym samym modyfikować napięcie i powierzchnię dwuwarstwy (Rysunek 4B).
Podczas mechanicznej stymulacji DIB, przy zachowaniu stałego potencjału DC w obrębie błony, mutant V23T kanału MscL o niskim progu aktywacji (gain-of-function) generuje powtarzalną aktywność, obejmującą głównie stany podprzewodzące i sporadycznie zdarzenia pełnego otwarcia (Rysunek 5). Zdarzenia te są identyczne z tymi zarejestrowanymi techniką patch-clamp z nienaruszonych błon wewnętrznych E. coli oraz liposomów zrekonstytuowanych z oczyszczonym białkiem V23T MscL. Wyniki przedstawione na Rysunku 5 dowodzą, że bramkowanie następuje w odpowiedzi na wzrost napięcia, ponieważ wszystkie piki prądowe obserwuje się w momencie maksymalnego ściskania. W punkcie maksymalnego ściskania względna rozszerzalność powierzchniowa kropel jest największa, a co za tym idzie, napięcie na granicy faz jest maksymalne.
Alametycyna, bramkowany napięciem kanał jonowy i jeden z najczęściej badanych peptydów, zwiększa przepuszczalność błony po przyłożeniu napięcia stałego (DC) przez błonę36. Zdolność interfejsu lipidowej dwuwarstwy do gospodowania białkami i peptydami transbłonowymi jest również testowana poprzez rejestrację prądów bramkowania napięciowego z wykorzystaniem peptydu alametycyny. Alametycynę miesza się z roztworem fosfolipidów do końcowego stężenia 100 ng/ml. Rysunek 6 przedstawia pomiary prądu w warunkach zacisku napięciowego (+115 mV). Krople w tym doświadczeniu są rozciągane w celu uzyskania małego interfejsu dwuwarstwy, co przekłada się na wyższą rezystancję i mniejszą pojemność. Zachowanie bramkowania peptydu alametycyny jest widoczne w formie dyskretnych skoków prądu (Rysunek 6). Histogram po prawej stronie wykresu pokazuje zmiany konduktancji względem poziomu bazowego (0,0962 nS), który stanowi w zasadzie pierwszy poziom konduktancji samego kanału.
<img alt="Schemat równowagi statycznej i układ mikroskopowy, cylinder akrylowy, pomiar wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający główne części i wymiary zbiornika olejowego. Zbiornik olejowy został wykonany w warsztacie mechanicznym Virginia Tech. Składa się on z obrobionej cylindrycznej rurki akrylowej przyklejonej do powierzchni arkusza akrylowego. Wymiary i konstrukcja mogą zostać zmodyfikowane, aby dostosować je do różnych zastosowań lub umożliwić użycie więcej niż dwóch mikropipet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53362/53362fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ elektrofizjologiczny z mikropipetą, mikromanipulatorem, proteoliposomami i systemem analizy danych." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układ eksperymentalny i przygotowanie mikropipet. (A) Standardowe stanowisko do tworzenia, mechanicznej stymulacji i charakteryzowania dwuwarstw interfejsowych obejmuje mikroskop, manipulatory 3-osiowe, kamerę cyfrową, oscylator piezoelektryczny, stół antywibracyjny oraz klatkę Faradaya (niewidoczna). (B) Układ eksperymentalny składa się z dwóch przeciwległych mikropipet wypełnionych hydrożelem PEG-DMA, umieszczonych poziomo w kąpieli z oleju heksadekanowego. Każda z mikropipet zawiera elektrodę Ag/AgCl w celu zapewnienia połączenia elektrycznego. Trzecia mikropipeta, wypełniona roztworem proteoliposomów, służy do tworzenia kropli na końcach pozostałych mikropipet. (C) Odpowiedź prądową DIB można mierzyć, wykorzystując kombinację wzmacniacza patch-clamp i niskoszumnego systemu akwizycji danych. (D) Zdjęcie powiększone przedstawiające krople wodne utworzone na końcach mikropipet. (E) Elektrody Ag/AgCl przygotowuje się poprzez zanurzenie końców dwóch srebrnych drutów o średnicy 250 μm w wybielaczu. Następnie elektrody wprowadza się do dwóch kapilar z borokrzemianowego szkła wypełnionych hydrożelem PEG-DMA, który jest utwardzany światłem UV w celu zestalenia. Prosty uchwyt mikroelektrody z męskim złączem służy do podłączenia jednej z mikropipet do głowicy wzmacniacza patch-clamp.
<img alt="Proces tworzenia dwuwarstwy na styku kropel z użyciem mikropipet; schemat dwuwarstwy lipidowej; mikroskopia." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazy ilustrujące tworzenie dwuwarstw na styku kropel. (A) Mikropipeta o średnicy 10 μm wypełniona proteoliposomami została umieszczona pod mikroskopem w pobliżu końcówek mikropipet. Za pomocą strzykawki połączonej z mikropipetą należy dozować małe objętości proteoliposomów, aby utworzyć sferyczne krople o pożądanej objętości. Pozostawić krople na dziesięć min, aby utworzyła się monowarstwa. Doprowadzić do kontaktu krople; dwuwarstwa utworzy się po usunięciu całego oleju ze styku. (B) Po utworzeniu dwuwarstwy skład chemiczny po obu stronach styku można kontrolować, wstrzykując pożądane substancje chemiczne za pomocą mikropipety o rozmiarach mikrometrycznych. (C) Krople w momencie pierwszego kontaktu. (D) Krople po utworzeniu dwuwarstwy lipidowej.
<img alt="Schemat tworzenia dwuwarstwy; wykres prądu w funkcji czasu; manipulacja kroplami wpływa na powierzchnię dwuwarstwy." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pomiary w czasie rzeczywistym pokazują zarówno początkowe zwężenie, jak i późniejszą rozszerzenie interfejsu. (A) Prąd mierzony w trakcie tworzenia dwuwarstwy poprzez przyłożenie trójkątnego potencjału elektrycznego. Wartość zmierzonego prądu jest wprost proporcjonalna do pojemności, a tym samym do powierzchni interfejsu dwuwarstwy. Im bliżej siebie zostaną zbliżone krople, tym większa będzie powierzchnia interfejsu i na odwrót. (B) Po przyłożeniu wzbudzenia mechanicznego powierzchnia interfejsu dwuwarstwy zwiększa się i zmniejsza z tą samą częstotliwością co sygnał stymulujący.
<img alt="Dynamiczna analiza sygnału; wykresy prądu w funkcji przemieszczenia z danymi kompresyjnymi; narzędzie do analizy spektralnej." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pomiary w czasie rzeczywistym pokazują odpowiedź dwuwarstwy na pobudzenie mechaniczne oraz bramkowanie mutanta V23T białka MscL. Kształt odpowiedzi prądowej jest sinusoidalny, co wiąże się z sinusoidalną zmianą pojemności dwuwarstwy w wyniku zmiany jej powierzchni. Skoki prądu, występujące w szczycie każdego cyklu, wskazują na bramkowanie subkonduktancji mutanta V23T. Wykres polarny dodatkowo wskazuje, że bramkowanie zachodzi przy maksymalnej kompresji, co odzwierciedla wzrost napięcia na granicy faz dwuwarstwy.
<img alt="Wykres prądu elektrofizjologicznego w funkcji czasu, przedstawiający poziomy przewodności w nanosimensach (nS)." src="/files/ftp_upload/53362/53362fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Pomiary prądu w warunkach clampowania napięcia i odpowiadający im histogram poziomów przewodności dla aktywności bramkowania wbudowanych kanałów alametycyny. Zachowanie bramkowania peptydu alametycyny jest widoczne poprzez dyskretny, skokowy wzrost prądu. Poziomy przewodności są bardzo zgodne z poprzednimi pomiarami wykonanymi przez nasz zespół badawczy w Virginia Tech7.

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych. Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych. W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest funkcjonalna rekonstytucja kanałów mezcal w systemie dwuwarstwowym na interfejsie kropli oraz zbadanie odpowiedzi tych kanałów mechanosensytywnych na harmoniczne bodźce mechaniczne. Metoda ta umożliwia badanie aktywności mechanoelektrycznej mutanta V 23 T mezcal w odpowiedzi na harmoniczne pobudzenie mechaniczne po rekonstytucji w systemie dwuwarstwowym na interfejsie kropli. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie atutów technicznych zarówno metody patch-clamp, jak i metody dwuwarstwowej na interfejsie kropli, wraz z możliwością miniaturyzacji oraz możliwością kontrolowania składu chemicznego po obu stronach błony.Aby sformułować liposomy, przygotuj 10 mililitrów roztworu lipidowego o stężeniu dwóch miligramów na mililitr, dodając 10 mililitrów buforu chlorkowego potasu do 20 miligramów syntetycznych lipidów D-P-H-P-C zakupionych w formie liofilizowanego proszku. Upewnij się, że zarówno nośniki lipidowe, jak i roztwór buforowy są dokładnie wymieszane. Po całkowitym rozpuszczeniu mieszanina powinna wyglądać na jednorodną i mętna.Zamrozić mieszaninę w temperaturze -20 °C, a następnie całkowicie rozmrozić nową mieszaninę lipidową, pozwalając jej odtajać w temperaturze pokojowej, a nie w środowisku ogrzewanym. Po przeprowadzeniu łącznie sześciu cykli zamrażania i rozmrażania, użyć dostępnego komercyjnie ekstrudera, aby poddać lipidy ekstruzji, przepuszczając całą zawiesinę lipidową najpierw przez filtr z membrany poliwęglanowej o wielkości porów 0,4 µm, a następnie sześciokrotnie przez filtr membranowy 0,1 µm. Proces ten pozwala na uzyskanie cząstek o średnicy bliskiej 100 nm.Aby wykonać zbiornik olejowy, należy wywiercić dwa przeciwległe otwory w ściance cylindra akrylowego o średnicy dwóch cali i długości 1,5 centymetra. Otwory powinny mieć średnicę jednego milimetra i znajdować się jeden centymetr od dna. Następnie należy wywiercić dwa otwory o średnicy czterech milimetrów, współśrodkowe z wcześniej wykonanymi otworami o średnicy jednego milimetra.Głębokość każdego otworu powinna wynosić 1 mm. Należy uważać, aby nie przewiercić ich na wylot. Otwory te są przygotowane pod gumowe uszczelki.Umieść i przyklej dwie gumowe uszczelki o średnicy wewnętrznej 1 mm w większych otworach, aby zapobiec wyciekowi oleju. Następnie, w dniu przeprowadzenia eksperymentu, przyklej maszynę do cylindra do cienkiej arkusza akrylowego o wymiarach 10 cm na 10 cm, używając dowolnego uniwersalnego kleju epoksydowego; odetnij kawałek srebrnego drutu o średnicy 250 µm i długości 7 cm, a następnie zanurz jego końce w wybielaczu na dwie godziny. Aby utworzyć powłokę z chlorku srebra, szary kolor wskazuje, że powłoka z chlorku srebra została uformowana.Za pomocą przecinaka do szkła podziel borokrzemianową kapilarę szklaną o długości 10 cm, średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,58 mm na dwie kapilary o długości 5 cm każda. Używając strzykawki o pojemności 1 ml z tępą igłą o rozmiarze 18 G, wypełnij kapilary hydrożelem P-E-G-D-M-A, aby zapobiec wypływaniu nawodnionego hydrożelu z kapilary w wyniku pęcznienia. Pozostaw 3 mm wolnej przestrzeni przy końcach i upewnij się, że w kapilarach nie ma pęcherzyków powietrza.Wprowadź elektrody srebrowe i srebrowo-chlorkowe do kapilar wypełnionych hydrożelem. Utwardź hydrożel P-E-G-D-M-A poprzez wolnorodnikową fotopolimeryzację, naświetlając go światłem ultrafioletowym przez dwie minuty przy mocy jednego wata za pomocą punktowego źródła UV; eksperyment jest przeprowadzony wewnątrz klatki Faradaya, uziemionej do zacisku uziemiającego wzmacniacza patch clamp. Przymocuj jedną z mikropipet do prostego uchwytu mikroelektrody wyposażonego w złącze męskie.Następnie podłącz uchwyt mikroelektrody do głowicy wzmacniacza patch-clamp. Aby połączyć głowicę z uziemieniem, przylutuj izolowany miedziany drut o rozmiarze 18 gauge do odpowiedniego złącza głowicy. Zamontuj głowicę na trójosiowym manualnym mikromanipulatorze, najpierw mocując płytę montażową głowicy do mikromanipulatora, a następnie łącząc głowicę z płytą montażową. Za pomocą odpowiednich śrub przymocuj drugą mikropipetę do siłownika liniowego za pomocą złącza wykonanego w laboratorium, a następnie zamontuj oba elementy na drugim mikromanipulatorze.Mikropipety powinny być ustawione naprzeciw siebie, w jednej linii i wypoziomowane. Następnie w szklanej fiolce zmieszaj 0,1 ml liposomów D-P-H-P-C z 0,01 ml roztworu liposomów V 23 T mescal protea. Używając igły microfill o rozmiarze 34 G, napełnij końcówki obu mikropipet roztworem proteosomów.Umieść zbiornik na górze mikroskopu w pozycji pionowej i wprowadź mikropipety przez przeciwległe otwory o średnicy jednego milimetra. Następnie wypełnij zbiornik do pełna heksadekanem, aby utworzyć sferyczne krople na końcach mikropipet. Użyj trzeciej mikropipety z borokrzemianowego szkła o średnicy 10 mikronów, zamontowanej na trzecim mikromanipulatorze, aby dozować rozcieńczony roztwór liposomów V 23 T mescal na końce mikropipet i utworzyć krople.Kontroluj rozmiar kropli, zmniejszając lub zwiększając ich objętość według uznania, a następnie pozostaw je na 10 minut, aby monowarstwy mogły w pełni się sformować. Następnie doprowadź do kontaktu kropli warstwami. Formowanie nastąpi w ciągu jednej do dwóch minut.Po skonfigurowaniu oprogramowania i sprzętu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy użyć kabla BNC, aby połączyć wyjście generatora przebiegów do przedniego przełącznika wejściowego dla zewnętrznych komend. Do stopnia głowicy należy przesłać trójkątny przebieg o częstotliwości 10 hertz i amplitudzie szczytowej 500 millivolt. Następnie należy skorzystać z mikromanipulatora.Przesuwaj szklane mikropipety poziomo, aż krople wejdą ze sobą w kontakt i lekko się dotkną, a następnie odczekaj do momentu pocienienia dwuwarstwy. Postęp procesu formowania dwuwarstwy można obserwować wizualnie pod mikroskopem oraz monitorować za pomocą pomiaru natężenia prądu. Dostosuj rozmiar dwuwarstwy do średnicy około 250 mikronów, kontrolując za pomocą manipulatora pozycję kropli zamontowanej na aktuatorze; wielkość dwuwarstwy można oszacować wizualnie pod mikroskopem.Po utworzeniu i ustabilizowaniu dwuwarstwy, pobudź krople, przesyłając sygnał sinusoidalny za pomocą generatora funkcji w celu stymulacji białka mescal wbudowanego w dwuwarstwę. Prześlij do piezoelektrycznego kontrolera serwomechanizmu falę sinusoidalną o amplitudzie szczyt-szczyt 175 micron, częstotliwości 0,2 hertz i cyklu pracy 50%. Przedstawiony jest tutaj typowy zapis prądu w czasie rzeczywistym.Zmierzona pojemność dwuwarstwy gwałtownie rośnie, co wskazuje na jej cieńczenie i formowanie, zanim osiągnie stan stabilny. Bilayer może być kontrolowany poprzez zmianę położenia kropli podczas mechanicznej stymulacji DIB, przy zachowaniu stałego potencjału DC w poprzek błony. Mutant V 23 T białka mezcal wykazuje wiarygodną aktywność, obejmującą głównie stany podprzewodzące oraz sporadyczne zdarzenia pełnego otwarcia.Bramkowanie występuje głównie w punkcie maksymalnej kompresji, co wskazuje na jego powiązanie ze wzrostem napięcia dwuwarstwy, jak pokazano na wykresie polarnym. W tym miejscu podkreślono możliwość wykorzystania tej techniki do badania innych typów biomolekuł. Ethin, który jest bramkowanym napięciowo kanałem jonowym, zwiększa przepuszczalność błony po przyłożeniu stałego potencjału przezbłonowego One master.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas realizacji procedury należy pamiętać, aby nie doprowadzić do przypadkowego stłuczenia kapilar szklanych ani innych elementów. Po zakończeniu etapu przygotowania należy zrestartować układ i upewnić się, że wszystkie przewody są podłączone.Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się kanałami aktywowanymi rozciąganiem do eksploracji nowych metod przekazywania sił zewnętrznych na bramkę mechanizmów wbudowanych w kanały wrażliwe na DIB. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak tworzyć interfejs kropelkowy warstwami, wbudowywać kanały mechanowrażliwe w błony sztuczne oraz stymulować te kanały mechanicznie.

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrojontoforeza polega na przemieszczaniu jonów z mikropipety w odpowiedzi na różnicę potencjałów elektrycznych między wnętrzem a zewnętrzem mikropipety. Dzięki temu cząsteczki biologicznie czynne są dostarczane proporcjonalnie do natężenia prądu elektrycznego. Przedstawiamy mikrojontoforezę acetylocholiny w połączeniu z mikromanipulacją w celu zbadania rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w mikrokrążeniu.

Mikrojontoforeza i mikromanipulacja w obrazowaniu fluorescencyjnym mikrokrążenia in vivo

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Ten film demonstruje indukcję żylaków aksonalnych poprzez zastosowanie bodźca mikromechanicznego na neuronach. System składa się z mikropipety podłączonej do strzykawki zawierającej bufor za pomocą rurki. Za pomocą mikromanipulatora mikropipetę umieszcza się nad neuronami. Następnie stosuje się ciśnienie płynu w celu wywołania żylaków w aksonach.

Wywoływanie żylaków aksonalnych za pomocą bodźca mikromechanicznego na neuronach

Ten artykuł przedstawia protokół do zasiewania rzadkiej populacji komórek za pomocą końcówek pipet do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia wyższej efektywności enkapsulacji komórek w kropelkach.

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.

Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę wprowadzania bakteryjnych kanałów mechanowrażliwych do dwuwarstw interfejsu kropelkowego z wykorzystaniem mikropipet. Technika umożliwia precyzyjną stymulację mechaniczną i badanie aktywności mechanoelektrycznej kanałów MscL.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego (Wideo) | JoVE Journal

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Przeglądaj więcej filmów