Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe scharakteryzowanie odpowiedzi immunologicznej Arabidopsis diliana za pomocą zoptymalizowanego testu infiltracji strzykawki. Osiąga się to poprzez użycie infiltracji strzykawki w celu ręcznego dostarczenia bakterii do liścia przez naturalne otwory zwane sada. Drugim krokiem jest uzyskanie krążków z zakażoną tkanką liścia po wystąpieniu objawów chorobowych.

Następnie bakterie są ekstrahowane z krążków liściowych poprzez homogenizację o wysokiej przepustowości. Ostatnim krokiem jest seryjne rozcieńczanie i nakrapianie na bakteryjne płytki liczące w celu zliczenia kolonii. Ostatecznie wzrost bakterii w obrębie każdego liścia może być skorelowany ze względną siłą odpowiedzi immunologicznej rośliny.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności roślin, takie jak identyfikacja genów, które przyczyniają się do odpowiedzi obronnej przed stresem biotycznym. Główną przewagą tej techniki nad istniejącą metodą jest to, że umożliwia ona precyzyjną ocenę ilościową wzrostu patogenu w zakażonej tkance roślinnej i pomaga uniknąć błędu eksperymentalnego spowodowanego pobieraniem próbek z liści o różnym statusie rozwojowym. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat odpowiedzi immunologicznej roślin na zakażenie zjadliwym patogenem bakteryjnym, a także może być stosowana do innych systemów, takich jak kwas salicylowy lub wzorce molekularne wywołane przez mikroorganizmy.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z dostarczeniem bakterii do liścia bez uszkodzenia tkanek. Następującą procedurę zademonstrują doktoranci hinduscy i doktoranci shalu i yali. Wkrótce z mojego laboratorium, Test na zwiększoną podatność na chorobę zostanie zademonstrowany w tym filmie.

Przed eksperymentem przygotuj płytki King's B lub KB, przygotuj jeden litr stałego podłoża KB, jak opisano w tekście protokołu i pozwól mu ostygnąć na magnetycznej płytce mieszającej. Gdy podłoże zostanie schłodzone do kontaktu z 80% glicerolem, jednym molowym siarczanem magnezu i streptomycyną do podłoża, wlej dwa różne rozmiary płytek KB. Mniejsza szalka Petriego służy jako podstawowa płytka do hodowli bakterii, a większa szalka Petriego służy jako płytka do liczenia bakterii.

Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwa dni przed serią testów. PSM ES 43 26. Bakterie z ujemnej temperatury glicerolu 80 stopni Celsjusza należy umieścić na płytce do hodowli bakterii paciorkowca KB i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin następnego dnia.

Rozpocznij płynną hodowlę w sterylnej probówce z czterema mililitrami płynnej pożywki kb zawierającej 50 mikrogramów na mililitr streptomycyny. Wstrząśnij 250 obr./min w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc. Rośliny rzodkiewnika do eksperymentu są hodowane w warunkach wyszczególnionych w tekście protokołu w tym samym dniu, w którym inicjowana jest płynna hodowla bakterii.

Oznacz płatki liści numer pięć i sześć i wodoodpornym markerem, aby ułatwić identyfikację zainfekowanej tkanki podczas pobierania próbek. Aby zwiększyć otwarcie STA i ułatwić wnikanie roztworu patogenu do wody liściowej. Rośliny dobrze moczą się w mieszkaniu od dołu przez 20 minut.

Po 20 minutach spuść nadmiar wody. Przeprowadza się infekcję roślin rzodkiewnika. Dzień po rozpoczęciu płynnej hodowli.

Przenieś kulturę bakteryjną do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i wiruj z prędkością 9 600 G przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny jednym mililitrem sterylnego 10-milimolowego chlorku magnezu, rozcieńczyć zawiesinę bakterii dziewięcioma mililitrami 10-milimolowego chlorku magnezu w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Po zmierzeniu gęstości optycznej bakterii, rozcieńczyć bakterie 10 milimolowym chlorkiem magnezu do końcowego OD 600 0,0002.

Do testu zakażenia EDS. Do infiltracji służy jednomililitrowa strzykawka bezigłowa z końcem, powszechnie znana jako strzykawka insulinowa. Napełnij strzykawkę 0,5 do 0,6 mililitra rozcieńczonego roztworu bakteryjnego, aby uzyskać znacznie lepszą kontrolę podczas procesu infiltracji, nie napełniaj strzykawki do pełnej pojemności.

Odsłoń dolną powierzchnię liścia na czubku palca wskazującego, a następnie za pomocą kciuka delikatnie wyreguluj pozycję liścia. Ustawić strzykawkę pionowo przy powierzchni liścia, aby zapewnić równomierne rozłożenie nacisku w celu zmniejszenia uszkodzenia liści. Staraj się unikać okolic nerwu środkowego podczas infiltracji.

Powoli naciskać tłok, aby przeniknąć do roztworu bakteryjnego. Wnikanie cieczy do mezofilu liścia zostanie uwidocznione, na co wskazuje ciemniejszy kolor liścia, nacieka całą powierzchnię liścia, nawet jeśli wymaga wielu prób. Po zakończeniu infiltracji delikatnie osusz liść chłonną tkanką, aby usunąć dodatkowy roztwór patogenu.

Sprawdź wzrokowo zainfekowaną tkankę liścia pod kątem uszkodzeń. Pozostaw infiltrowane rośliny do wyschnięcia na jedną do dwóch godzin, przywróć rośliny do ich pierwotnych warunków wzrostu. Spryskaj przezroczystą kopułę wodą i przykryj zainfekowane rośliny na dwie godziny.

Następnie rozbij kopułę, aby wygenerować otwór o długości od dwóch do trzech cali i pozostaw ją włączoną przez pozostałą część eksperymentu z infekcją, która zwykle trwa trzy dni. Jeden dzień przed ilościowym określeniem wzrostu patogenu. Wstępnie wysuszyć płytki informacyjne KB o wymiarach 150 milimetrów na 15 milimetrów.

Wysuszyć płytki, trzymając je w temperaturze pokojowej przez około 24 godziny. Przetwarzaj zakażoną tkankę po pojawieniu się stwardnienia wskazywanego przez zażółcenie zakażonej tkanki w podatnych genotypach, ale przed rozwojem zmian martwiczych. Dla każdego genotypu przygotuj sześć probówek do mielenia.

Umieść jedną kulę szlifierską ze stali nierdzewnej i dodaj 500 mikrolitrów sterylnego, 10-milimolowego chlorku magnezu do każdej probówki. Następnie odłącz zainfekowany liść od rośliny i przebij krążek liściowy jednootworowym dziurkaczem do papieru za pomocą kleszczy losowo, umieść dwie tarcze liściowe z dwóch różnych roślin w każdej rurze mielącej. Uszczelnij probówki, homogenizuj tkankę homogenizatorem o wysokiej przepustowości z maksymalną prędkością przez 10 minut.

W razie potrzeby powtarzaj ten proces, aż tkanka będzie dobrze homogenizowana, a roztwory zmienią kolor na zielony z powodu uwalniania chlorofilu z zainfekowanych liści podczas oczekiwania. W celu homogenizacji należy wypełnić każdą studzienkę w pierwszych sześciu rzędach 96-dołkowej płytki hodowlanej 180 mikrolitrami 10-milimolowego chlorku magnezu. Przenieść 20 mikrolitrów zmielonej zawiesiny tkankowej do każdego dołka w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej i wymieszać, wielokrotnie pipetując ciecz w górę iw dół.

Jeśli małe fragmenty tkanki zatkały końcówkę, przytnij ją o dwa do trzech milimetrów, aby uzyskać odpowiednią objętość roztworu, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca dla kropli na górze płytki, aby umieścić tkankę z różnych genotypów w alternatywnych rzędach. Aby przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie seryjne, przenieś 20 mikrolitrów zawiesiny tkankowej do drugiego rzędu i powtarzaj tę procedurę do szóstego rozcieńczenia. Za pomocą podzielonych końcówek do pipet przenieś 20 mikrolitrów roztworu z płytki ściennej 96 na płytkę KB o wymiarach 150 milimetrów na 15 milimetrów.

Pracować od najcieńszej zawiesiny do najbardziej skoncentrowanej, tak aby nie było potrzeby wymiany końcówek pipet między rozcieńczeniami. Wysuszyć talerz w temperaturze pokojowej z pękniętą pokrywką. Gdy na powierzchni płytki nie będzie już można zaobserwować cieczy, zamknij pokrywkę, odwróć i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej.

Inkubuj płytki przez 40 do 60 godzin, aż kolonie staną się widoczne. Upewnij się, że bakterie na płytkach odzwierciedlają przewidywalną dziesięciokrotność. Zrzuć jednostki tworzące kolonie.

Policz bakterie, zanim przerosną i kolonie się połączą. Określ liczbę bakterii w najniższym rozcieńczeniu, które nie ma nakładających się kolonii. Zazwyczaj preferowane rozcieńczenie, które ma być policzone, zawiera od 10 do 50 kolonii i może się różnić w zależności od kontrprób technicznych.

Aby obliczyć poziomy proliferacji bakterii, należy określić liczbę jednostek tworzących kolonie na krążek liścia za pomocą tego wzoru, gdzie R jest numerem rzędu, a T jest liczbą bakterii w każdej kontrpróbie technicznej. Dane są następnie wykorzystywane do tworzenia wykresu. Każdy punkt danych jest reprezentowany jako średnia z sześciu powtórzeń technicznych w skali logarytmicznej.

Aerobary reprezentują 95% przedział ufności średniego nasilenia choroby. Wrażliwość na P-S-M-E-S 43 26 oceniano na podstawie zakażenia inokulum o OD 600 0,0002. Wyniki pokazują, że wysoce wrażliwe mutanty NPR one dash one one mają około 2,5 log lub 300 razy większy wzrost patogenów w porównaniu z dzikimi roślinami Columbia zero.

Test infiltracji strzykawki może być zmodyfikowany w celu oceny różnych warstw odpowiedzi immunologicznej. Aby ocenić odporność wywołaną kwasem salicylowym, stosuje się zewnętrzne stosowanie salicylanu sodu w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej, która jest określana ilościowo przez wzrost patogenu. Utrata NPR R, który pełni funkcję receptora kwasu salicylowego i główna koregulacja transkrypcyjna genów docelowych zależnych od kwasu salicylowego, prowadzi do niewrażliwości na egzogenne stosowanie pochodnej kwasu salicylowego.

Aby scharakteryzować odporność wyzwalaną wzorcem molekularnym związanym z mikroorganizmami, rośliny poddano wstępnej terapii dwoma znanymi wyzwalaczami. FLAG 22 i L 18, dzikie rośliny Columbia zero traktowane przez FLAG 22 wspierały jednologarytmiczną lub 10-krotną redukcję populacji bakterii, podczas gdy dwie zmutowane rośliny FLS nie wywołały efektu ograniczenia wzrostu bakterii. Podobnie, rośliny ze zmutowanym EFR były niewrażliwe na wstępną obróbkę L 18.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo arabską odpowiedź immunologiczną opsys za pomocą testu infiltracji strzykawki. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o monitorowaniu rozwoju choroby i pobieraniu próbek tkanek po pojawieniu się corsis. Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 jest patogenem zanikowym hemi.

W związku z tym pobieranie próbek powinno być przeprowadzone przed przejściem do stadium neurotroficznego. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i zachodnia analiza krwi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, który konkretny szlak sygnalizacji immunologicznej jest zaburzony. Nie zapominaj, że pracujesz z żywymi bakteriami.

Chociaż Pseudomona Senge nie jest chorobotwórczy dla ludzi, należy pamiętać o prawidłowej utylizacji skażonych materiałów eksploatacyjnych i zainfekowanych roślin podczas wykonywania tej procedury.