Name: Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj metodę infiltracji strzykawkowej w liściach Arabidopsis thaliana w celu ilościowej oceny odpowiedzi immunologicznej roślin na Pseudomonas syringae. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów obronnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Shahidowi Mukhtarowi za krytykę manuskryptu i Dr. Xinnian Dong za plik z próbkami do analizy danych. Praca ta jest wspierana przez nagrodę NSF-CAREER (IOS-1350244) dla KPM i Wydziału Biologii UAB.

<ol><li>Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+mechanisms+of+defense+against+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).</li>
<li>Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+disease+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biolog%22%5BJournal%5D)">Plant disease resistance genes.</a> Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).</li>
<li>Pontier, D., Balague, C., Roby, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypersensitive+response.+A+programmed+cell+death+associated+with+plant+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+II%22%5BJournal%5D)">The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance.</a> C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).</li>
<li>Ryals, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Acquired+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cel%22%5BJournal%5D)">Systemic Acquired Resistance.</a> Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Natur. 444, 323-329 (2006).</li>
<li>Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAMP+%28microbe-associated+molecular+pattern%29+triggered+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sc%22%5BJournal%5D)">MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants.</a> Front Plant Sc. 4, 139(2013).</li>
<li>Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+proteins+in+induced+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immuno%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial proteins in induced plant defense.</a> Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).</li>
<li>Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+PAMP-triggered+immunity+against+bacteria%3A+pattern+recognition+receptors+watch+over+and+raise+the+alarm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physio%22%5BJournal%5D)">Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm.</a> Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).</li>
<li>Zipfel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Natur. 428, 764-767 (2004).</li>
<li>Kunze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N+terminus+of+bacterial+elongation+factor+Tu+elicits+innate+immunity+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cel%22%5BJournal%5D)">The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants.</a> Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).</li>
<li>Gust, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria-derived+peptidoglycans+constitute+pathogen-associated+molecular+patterns+triggering+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Che%22%5BJournal%5D)">Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis.</a> J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).</li>
<li>Alfano, J. R., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+system+effector+proteins%3A+double+agents+in+bacterial+disease+and+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopatho%22%5BJournal%5D)">Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense.</a> Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).</li>
<li>Tyler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+and+breaking%3A+virulence+effector+proteins+of+oomycete+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbio%22%5BJournal%5D)">Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens.</a> Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).</li>
<li>He, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+bacterial+suppressors+of+MAMP+signaling+upstream+of+MAPKKK+in+Arabidopsis+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity.</a> Cel. 125, 563-575 (2006).</li>
<li>Gimenez-Ibanez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AvrPtoB+targets+the+LysM+receptor+kinase+CERK1+to+promote+bacterial+virulence+on+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio%22%5BJournal%5D)">AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants.</a> Curr Bio. 19, 423-429 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+PAMP-induced+MAP+kinase+cascade+by+a+Pseudomonas+syringae+effector+activates+plant+immunity+mediated+by+the+NB-LRR+protein+SUMM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microb%22%5BJournal%5D)">Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2.</a> Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).</li>
<li>Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions%3A+shaping+the+evolution+of+the+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response.</a> Cel. 124, 803-814 (2006).</li>
<li>Jones, D. A., Takemoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+innate+immunity+-+direct+and+indirect+recognition+of+general+and+specific+pathogen-associated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immuno%22%5BJournal%5D)">Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules.</a> Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).</li>
<li>Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+NB-LRR+signaling%3A+upstreams+and+downstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams.</a> Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).</li>
<li>Gassmann, W., Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-triggered+immunity+signaling%3A+from+gene-for-gene+pathways+to+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interac%22%5BJournal%5D)">Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks.</a> Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).</li>
<li>Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein+secretory+pathway+is+required+for+systemic+acquired+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Scienc%22%5BJournal%5D)">Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance.</a> Scienc. 308, 1036-1040 (2005).</li>
<li>Bednarek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+warfare+or+modulators+of+defence+responses+-+the+function+of+secondary+metabolites+in+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity.</a> Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitive+response-related+death%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).</li>
<li>Fu, Z. Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+acquired+resistance%3A+turning+local+infection+into+global+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense.</a> Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).</li>
<li>Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+NPR1+gene+that+controls+systemic+acquired+resistance+encodes+a+novel+protein+containing+ankyrin+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats.</a> Cel. 88, 57-63 (1997).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+NPR1+protein+is+a+receptor+for+the+plant+defense+hormone+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Re%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid.</a> Cell Re. 1, 639-647 (2012).</li>
<li>Smith, J. M., Heese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+bioassay+to+measure+early+reactive+oxygen+species+production+in+Arabidopsis+leave+tissue+in+response+to+living+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Method%22%5BJournal%5D)">Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae.</a> Plant Method. 10, 6(2014).</li>
<li>Nomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+virulence+protein+suppresses+host+innate+immunity+to+cause+plant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scienc%22%5BJournal%5D)">A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease.</a> Scienc. 313, 220-223 (2006).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+book%2FAmerican+Society+of+Plant+Biologist%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).</li>
<li>Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Pseudomonas+syringae+pathovars+suggests+the+horizontal+gene+transfer+of+argK+and+the+evolutionary+stability+of+hrp+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evo%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster.</a> J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).</li>
<li>Xin, X. F., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%3A+a+model+pathogen+for+probing+disease+susceptibility+and+hormone+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopatho%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants.</a> Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).</li>
<li>Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Arabidopsis+defense+genes+by+virulent+and+avirulent+Pseudomonas+syringae+strains+and+by+a+cloned+avirulence+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cel%22%5BJournal%5D)">Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene.</a> Plant Cel. 3, 61-72 (1991).</li>
<li>Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIN4+interacts+with+Pseudomonas+syringae+type+III+effector+molecules+and+is+required+for+RPM1-mediated+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis.</a> Cel. 108, 743-754 (2002).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high%E2%80%90throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journa%22%5BJournal%5D)">A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).</li>
<li>Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+seedling+flood-inoculation+technique%3A+a+rapid+and+reliable+assay+for+studying+plant-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Method%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions.</a> Plant Method. 7, 32(2011).</li>
<li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microb%22%5BJournal%5D)">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).</li>
<li>Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSF-like+transcription+factor+TBF1+is+a+major+molecular+switch+for+plant+growth-to-defense+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio%22%5BJournal%5D)">The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition.</a> Curr Bio. 22, 103-112 (2012).</li>
<li>Rusterucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+associated+with+the+transition+to+flowering+in+Arabidopsis+and+is+effective+against+Peronospora+parasitica%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+molecular+plant+patholog%22%5BJournal%5D)">Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica.</a> Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).</li>
<li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+stage%E2%80%93based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Onlin%22%5BJournal%5D)">Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants.</a> The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).</li>
<li>Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+of+streptomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistr%22%5BJournal%5D)">The stability of streptomycin.</a> Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Natur. 470, 110-114 (2011).</li>
<li>Hua, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+plant+immunity+by+light%2C+circadian+rhythm%2C+and+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biolog%22%5BJournal%5D)">Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature.</a> Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).</li>
<li>Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbio%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).</li>
<li>Qutob, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytotoxicity+and+innate+immune+responses+induced+by+Nep1-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Onlin%22%5BJournal%5D)">Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins.</a> The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).</li>
<li>Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+economic+costs+of+nonindigenous+species+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22BioScienc%22%5BJournal%5D)">Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States.</a> BioScienc. 50, 53-65 (2000).</li>
<li>Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata%3A+a+checkpoint+of+host+immunity+and+pathogen+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnolog%22%5BJournal%5D)">Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence.</a> Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).</li>
<li>Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+ABA+in+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+scienc%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of ABA in disease resistance.</a> Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).</li>
<li>Mahajan, S., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+salinity+and+drought+stresses%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+biochemistry+and+biophysic%22%5BJournal%5D)">Cold salinity and drought stresses: an overview.</a> Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).</li>
<li>León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+signalling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botan%22%5BJournal%5D)">Wound signalling in plants.</a> Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z kurczącymi się dostępnymi gruntami rolnymi i rosnącą populacją, naukowcy na całym świecie stają przed pilnymi potrzebami w zakresie poprawy upraw. Na plony mogą mieć duży wpływ różne stresy biotyczne i abiotyczne. Wśród nich infekcja patogenami jest jedną z głównych przyczyn zmniejszenia plonów, odpowiedzialną za około 12% strat w samych Stanach Zjednoczonych45. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadzono szeroko zakrojone badania w modelu patosystemu Arabidopsis - P. syringae , aby kompleksowo s...

Ze względu na swoją siedzącą naturę, rośliny są stale zagrożone przez mnóstwo patogenów o różnym stylu życia i strategiach żywieniowych1. W pierwszym przybliżeniu patogeny biotroficzne utrzymują swojego gospodarza przy życiu w celu odzyskania składników odżywczych, podczas gdy patogeny nekrotroficzne aktywnie wydzielają toksyny i enzymy, aby zabić tkankę gospodarza i żywić się martwymi komórkami1. Inna grupa patogenów, zwana hemibiotrofami, rozpoczyna swój przebieg infekcji od stadium biotroficznego i przechodzi w stadium nekrotroficzne po osiągnięciu określonego progu akumulacji patogenu2. Aby skutecznie bronić się przed tymi mikroorganizmami, rośliny wykształciły skomplikowany wrodzony układ odpornościowy wyposażony w wiele mechanizmów nadzoru w celu wykrycia ataku patogenu i wywołania zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki3, a także ogólnoustrojowej odporności nabytej (SAR)4. Obecne badania koncentrują się na scharakteryzowaniu podstawowych składników sygnalizacyjnych i wzajemnych oddziaływań w układzie odpornościowym roślin5.

Jak zaproponowano w modelu5 "Zig-Zag", pierwsza warstwa wrodzonej odpowiedzi immunologicznej rośliny wymaga obecności zlokalizowanych w błonie plazmatycznej receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) w celu wykrycia inwazji drobnoustroju. PRR są w stanie rozpoznawać wzorce molekularne związane z drobnoustrojami (MAMP) i ustanawiać odporność wyzwalaną przez MAMP (MTI)6. Oprócz indukowania transkrypcyjnej regulacji w górę genów kodujących przeciwdrobnoustrojowe białka PR7, MTI prowadzi do różnych zdarzeń, które hamują wzrost patogenu, w tym do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS), odkładania kalozy w ścianie komórkowej, a także aktywacji wielu szlaków sygnałowych kinazy8.
Do tej pory zidentyfikowano kilka MAMP, które wywołują MTI u Arabidopsis, w tym bakteryjny flg229 (fragment 22 aminokwasów pochodzący z flageliny), elf1810 (18 aminokwasów z bakteryjnego czynnika wydłużania translacji Tu) i peptydoglikany, składnik strukturalnej ściany komórkowej11. Aby ustalić udaną infekcję, niektóre wyspecjalizowane patogeny wyewoluowały zdolność do wydzielania białek efektorowych wirulencji do przestrzeni wewnątrzkomórkowych lub międzykomórkowych, a w konsekwencji tłumienia MTI i wyzwalania podatności wyzwalanej efektorem (ETS)12,13. Na przykład efektory wirulencji mogą dezaktywować kaskady fosforylacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) MTI, aby indukować rozwój choroby w zakażonej tkance14-16. Podczas dynamicznej koewolucji między gospodarzami a patogenami rośliny opracowały również strategię przeciwdziałania atakom, aby rozpoznać białka efektorowe i osłabić cząsteczki wirulencji patogenów17. To bezpośrednie lub pośrednie rozpoznawanie efektorów odbywa się za pośrednictwem białek oporności na choroby (R)18. Większość z nich należy do rodziny NB-LRR (Nucleotide Binding and Leucine-Rich Repeats)19. Postrzeganie efektora awirulentnego przez białko R wywołuje silniejszą i szerszą odpowiedź immunologiczną scharakteryzowaną jako odporność wyzwalana efektorowo (ETI)20. Oprócz indukowania ekspresji genów obronnych21 i produkcji metabolitów obronnych22, ETI często prowadzi do szybkiej zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki znanej jako reakcja nadwrażliwa (HR) w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się patogenu do sąsiedniej tkanki3.
Oprócz zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki23, rośliny są zdolne do zainicjowania długoterminowej i ogólnosystemowej odpowiedzi immunologicznej zwanej Ogólnoustrojową Odpornością Nabytą (SAR)4. Po zmierzeniu się z biotroficznym patogenem komórki roślinne uruchamiają biosyntezę i akumulację endogennego fitohormonu kwasu salicylowego (SA) i białek PR zarówno w tkankach miejscowych, jak i ogólnoustrojowych24. Dzięki temu procesowi w niezakażonych liściach osiąga się podwyższony stan gotowości, który pozwala na szybsze reakcje obronne podczas kolejnej infekcji przez szerokie spektrum patogenów24. SA i jego syntetyczne analogi, takie jak ester S-metylowy kwasu benzo-(1,2,3)-tiadiazolo-7-karbothiowego (BTH) i kwas 2,6-dichloroisonicotynowy (INA), są zdolne do chemicznego indukowania odporności wyzwalanej kwasem salicylowym (SA) (STI) po zastosowaniu zewnętrznym24. Proponuje się, że Nonexpressor of Pathogenesis-Related Genes 1 (NPR1) jest jednym z receptorów SA i pełni funkcję głównego regulatora transkrypcji podczas odpowiedzi obronnej za pośrednictwem SA zarówno w tkankach lokalnych, jak i ogólnoustrojowych21,25,26. Wykazano jednoznacznie, że NPR1 jest wymagany do powstania SAR, a utrata NPR1 prowadzi do dramatycznej podatności na Pseudomonas syringae25.
Aby dokładnie scharakteryzować molekularny wkład składników roślinnych w interakcje roślina-patogen, opracowano wiele testów biologicznych do pomiaru określonych zdarzeń obronnych, w tym wybuchu ROS27, depozycji kalozy28, ekspresji genów obronnych i akumulacji ich produktów białkowych21. Chociaż te indywidualne testy mogą dostarczyć wglądu w specyficzną formę odpowiedzi immunologicznej rośliny, żadna z nich nie jest jednak w stanie przedstawić pełnej odpowiedzi obronnej na poziomie całej rośliny. I odwrotnie, kwantyfikacja wzrostu patogenu po zakażeniu zapewnia ogólne oszacowanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie organizmu. Dlatego opracowanie i optymalizacja precyzyjnego i wysoce ustandaryzowanego testu inokulacji patogenów ma kluczowe znaczenie dla napędzania badań i odkryć dotyczących odpowiedzi immunologicznej Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, bakteria Gram-ujemna, została zidentyfikowana jako fitopatogen zdolny do wywoływania chorób u różnych gospodarzy roślin, w tym Arabidopsis29. Jako modelowy system roślina-patogen, interakcja Arabidopsis - P. syringae jest szeroko stosowana w celu zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw reakcji obronnych roślin29. Do tej pory zidentyfikowano ponad 50 patowarów P. syringae na podstawie ich zdolności do infekowania różnych gatunków roślin30 . P. syringae pv. pomidor DC3000(Pst DC3000)31oraz P. syringae pv. Maculicola powiedział:ES4326 (Psm ES4326)32 to dwa najczęściej stosowane i szeroko scharakteryzowane zjadliwe szczepy. Oprócz tego, że są rozpoznawane przez roślinę i wyzwalają odpowiedź MTI, Pst DC3000 i Psm ES4326 są zdolne do wydzielania zjadliwych białek efektorowych w celu tłumienia MTI i wyzwalania ETS w celu sprzyjania wzrostowi patogenu31,33.
Aby funkcjonalnie przeanalizować interakcję między Arabidopsis a P. syringae, opracowano metody infekcji wieloma patogenami w oparciu o podejście dostarczania patogenów. W przypadku roślin uprawianych w glebie patogen może być dostarczany przez infiltrację strzykawkową, infiltrację próżniową, inokulację zanurzeniową i inokulację opryskową29,34. Niedawno opracowano test inokulacji zalewowej sadzonek w celu przeprowadzenia badań przesiewowych na dużą skalę na młodych roślinach rzodkiewnika wyhodowanych na płytkach kultur tkankowych35. Naciek strzykawkowy, jako jedno z najczęściej stosowanych metod, polega na ręcznym dostarczaniu patogenu do apoplastu przez naturalne otwory liściowe zwane aparatami szparkowymi29. Dzięki takiemu podejściu równe ilości P. syringae mogą przeniknąć do zakażonego liścia, a siła odpowiedzi immunologicznej roślin jest odwrotnie skorelowana z poziomem wzrostu patogenu. Dlatego kwantyfikacja wzrostu patogenów służy jako optymalne podejście do oceny funkcji immunologicznej na poziomie całej rośliny. Ponadto infiltracja strzykawki może rozróżnić tkankę miejscową i ogólnoustrojową, co może mieć zastosowanie w charakterystyce mechanizmów molekularnych leżących u podstaw SAR36.
W poniższym protokole opisujemy zoptymalizowany test infiltracji strzykawki za pomocą Psm ES4326 do badania mutantów Arabidopsis w celu zwiększenia podatności na choroby (EDS). W protokole tym wykorzystane zostaną dwa genotypy Arabidopsis: rośliny ekotypu dzikiego Columbia-0 (Col-0) (kontrola) i mutanty NPR1-1 z utratą funkcji (hiperpodatne), które zostaną zakażone zjadliwym szczepem bakteryjnym Psm ES432637. Mutant npr1-1 przenosi mutację punktową w sekwencji konsensusu ankyryny-powtórzeń cząsteczki NPR1, która zmienia wysoce konserwatywną histydynę na tyrozynę i sprawia, że białko staje się niefunkcjonalne25. Ponadto opisano szereg modyfikacji testu infiltracji strzykawki, które umożliwiają ilościowe określenie defektów w określonych warstwach odpowiedzi immunologicznej, w tym MTI i STI.

<table><tbody><tr><td>MetroMix 360&nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>Duże doniczki</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 Wkłady</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Mieszkania bez otworów</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Mieszkania z otworami</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>Kopuły propagacyjne z winylu</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy trójwodny&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>150 x 15 mm Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>Płyta prostokątna</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydrate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bio Basic Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; </td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9992493&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>Rury szlifierskie&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki do rurek szlifierskich</td><td>Denville Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>Kula szlifierska ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>Salicylan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>Genescript</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>Genescript</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz</td><td>Zszywki</td><td>146308</td><td></td></tr><tr><td>Biofotometr plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>952000006</tr><tr><td>Wysokowydajny homogenizator PowerGen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka wirowa Accu</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (10-100 &mikro; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (30-300 &mikro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (20&micro; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td> Marker permanentny <td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>Zszywki</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

W przypadku braku wyspecjalizowanych mobilnych komórek odpornościowych, rośliny wykorzystują swoją zlokalizowaną zaprogramowaną śmierć komórki i ogólnoustrojową odporność do obrony przed atakiem patogenów. Udział określonego genu Arabidopsis w ogólnej odpowiedzi immunologicznej roślin można specyficznie i ilościowo ocenić, badając wzrost patogenu w zakażonej tkance. Od ponad trzech dekad hemibiotroficzna bakteria Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: ES4326 (Psm ES4326) jest szeroko stosowany jako modelowy patogen do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi immunologicznej rzodkiewnika. Aby dostarczyć patogeny do tkanki liścia, opracowano wiele metod inokulacji, np. infiltracja strzykawką, inokulacja zanurzeniowa, opryskiwanie, infiltracja próżniowa i inokulacja powodziowa. Poniższy protokół opisuje zoptymalizowaną metodę infiltracji strzykawki w celu dostarczenia zjadliwego Psm ES4326 do liści dorosłych roślin rzodkiewnika uprawianego w glebie i dokładnego badania przesiewowego pod kątem zwiększonej podatności na chorobę (EDS) na ten patogen. Ponadto protokół ten może być uzupełniony wieloma zabiegami wstępnymi w celu dalszej analizy określonych defektów immunologicznych w różnych warstwach obrony roślin, w tym odporności wyzwalanej kwasem salicylowym (SA) (STI) i odporności wyzwalanej MAMP (MTI).

Protokół, który tutaj opisujemy, stanowi zoptymalizowany test infiltracji strzykawkowej P. syringae służący do ilościowej oceny odpowiedzi immunologicznej u roślin Arabidopsis. Jak przedstawiono na Rysunku 1, po infiltracji strzykawkowej Psm ES4326 następuje ekstrakcja patogenu i jego kwantyfikacja poprzez seryjne rozcieńczenia oraz liczenie kolonii.
Jak opisano w kroku 3 tekstu protokołu, zwiększoną podatność na chorobę (Enhanced Disease Susceptibil...

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowa charakterystyka odpowiedzi immunologicznej Arabidopsis diliana za pomocą zoptymalizowanego testu infiltracji strzykawką. Jest to realizowane poprzez wstępne wykorzystanie infiltracji strzykawką do ręcznego wprowadzenia bakterii do liścia przez naturalne otwory zwane aparatami szparkowymi. Drugim krokiem jest pobranie krążków z zainfekowanej tkanki liściowej po wystąpieniu objawów choroby.Następnie bakterie są ekstrahowane z krążków liściowych poprzez homogenizację wysokoprzepustową. Ostatnim krokiem jest rozcieńczanie seryjne i nanoszenie kropel na płytki do liczenia bakterii w celu zliczenia kolonii. W rezultacie wzrost bakterii w każdym krążku liściowym może zostać skorelowany z względną siłą odpowiedzi immunologicznej rośliny.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu odporności roślin, takie jak identyfikacja genów przyczyniających się do odpowiedzi obronnych przeciwko stresowi biotycznemu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala ona na precyzyjną kwantyfikację wzrostu patogenu w zainfekowanej tkance roślinnej i pomaga uniknąć błędów eksperymentalnych spowodowanych pobieraniem próbek z liści o różnym stadium rozwojowym. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat odpowiedzi odpornościowej roślin na infekcję wirulentnym patogenem bakteryjnym, a także może być zastosowana w innych układach, takich jak odpowiedzi odpornościowe wywołane przez kwas salicylowy lub molekularne wzorce związane z mikrobami (MAMPs).Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z wprowadzeniem bakterii do liścia bez uszkodzenia tkanki. Poniższą procedurę zademonstrują postdoktorant Hindu oraz studenci studiów magisterskich Shalu i Yali z mojego laboratorium. W tym filmie zostanie zaprezentowany test zwiększonej podatności na choroby.Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować płytki z pożywką King's B lub KB; przygotuj jeden litr stałej pożywki KB zgodnie z opisem w tekście protokołu i pozostaw ją do ochłonięcia na mieszadle magnetycznym. Gdy pożywka ochłodzi się do temperatury pozwalającej na dotyk, dodaj do niej 80% glycerol, jeden molowy siarczan magnezu oraz streptomycynę, a następnie wlej pożywkę KB do dwóch różnych rozmiarów płytek. Mniejsza szalka Petri służy jako główna płytka do hodowli bakterii, a większa szalka Petri służy jako płytka do liczenia bakterii.Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C dwa dni przed posianiem do analizy. PSM ES 43 26. Bakterie z zapasu glicerynowego przechowywanego w temperaturze -80 °C wysiać na płytkę z podłożem KB do hodowli bakterii i inkubować w temperaturze 28 °C przez 24 do 48 godzin w dniu następnym.Rozpocznij hodowlę ciekłą w sterylnej probówce, używając 4 mL ciekłego medium KB zawierającego 50 µg/mL streptomycyny. Inkubuj w wytrząsarce przy 250 RPM w temperaturze 28 °C przez noc. Rośliny Arabidopsis do eksperymentu są hodowane zgodnie z warunkami szczegółowo opisanymi w tekście protokołu w tym samym dniu, w którym rozpoczynano hodowlę bakteryjną w cieczy.Oznacz płatki liści numer pięć i sześć tępym, wodoodpornym markerem, aby ułatwić identyfikację zainfekowanej tkanki podczas pobierania próbek. Aby zwiększyć otwarcie aparatów szparkowych i ułatwić wnikanie roztworu patogenu do wnętrza liścia, należy nawodnić rośliny, mocząc doniczkę od spodu przez 20 minut.Po 20 minutach odlej nadmiar wody. Zakażenie roślin arabidopsis zostało przeprowadzone. Dzień po zainicjowaniu hodowli ciekłej.Przenieś kulturę bakteryjną do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 9 600 G przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej odlej nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 1 ml sterylnego 10 mM chlorku magnezu, a następnie rozcieńcz zawiesinę bakteryjną w 9 ml 10 mM chlorku magnezu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po zmierzeniu gęstości optycznej bakterii, rozcieńcz je 10 mM chlorkiem magnezu do końcowej wartości OD 600 wynoszącej 0,0002.Do testu infekcji EDS. Do infiltracji używa się strzykawki bezigłowej o pojemności jednego mililitra z tępym końcem, powszechnie znanej jako strzykawka insulinowa. Aby uzyskać znacznie lepszą kontrolę podczas procesu infiltracji, należy napełnić strzykawkę od 0,5 do 0,6 mililitra rozcieńczonego roztworu bakteryjnego; nie należy napełniać strzykawki do pełnej pojemności.Odsłoń dolną powierzchnię liścia, opierając go na czubku palca wskazującego, a następnie za pomocą kciuka delikatnie skoryguj położenie liścia. Ustaw strzykawkę pionowo względem powierzchni liścia, aby zapewnić równomierny rozkład nacisku i zminimalizować uszkodzenia tkanki. Podczas infiltracji staraj się unikać obszaru nerwu głównego.Powoli wciśnij tłok, aby przeprowadzić infiltrację roztworem bakteryjnym. Wniknięcie cieczy do mezofylu liścia będzie widoczne jako ciemniejszy kolor tkanki; należy zinfiltrować całą powierzchnię liścia, nawet jeśli wymaga to kilku prób. Po zakończeniu infiltracji delikatnie osusz liść chłonną chusteczką, aby usunąć nadmiar roztworu patogenu.Wizualnie sprawdź zainfekowaną tkankę liścia pod kątem uszkodzeń. Pozostaw infiltrowane rośliny do wyschnięcia na jedną do dwóch godzin, a następnie zwróć rośliny do pierwotnych warunków wzrostu. Spryskaj przezroczystą kopułę wodą i przykryj zainfekowane rośliny na dwie godziny.Następnie należy delikatnie rozbić kopułę, aby stworzyć otwór o szerokości od dwóch do trzech cali, i pozostawić ją na miejscu przez cały pozostały czas eksperymentu z infekcją, który zazwyczaj trwa trzy dni. Na jeden dzień przed ilościowym określeniem wzrostu patogenu należy wysuszyć płytki z pożywką KB o wymiarach 150 mm na 15 mm.Osusz płytki, pozostawiając je w temperaturze pokojowej przez około 24 godziny. Przystąp do obróbki zakażonej tkanki po pojawieniu się sklerotyzacji, objawiającej się żółknięciem zakażonej tkanki w genotypach podatnych, lecz przed rozwojem zmian nekrotycznych. Dla każdego genotypu przygotuj sześć probówek do utarcia.Umieść jedną stalową kulkę do mielenia i dodaj 500 µL sterylnego, 10 mM chlorku magnezu do każdej probówki. Następnie oddziel zainfekowany liść od rośliny i za pomocą pęsety oraz dziurkacza z jednym otworem wycinij losowo krążek liściowy; umieść dwa krążki liściowe z dwóch różnych roślin w każdej probówce do mielenia. Zamknij probówki i homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora wysokoprzepustowego z maksymalną prędkością przez 10 minut.W razie potrzeby powtarzać ten proces, aż tkanka zostanie dobrze zhomogenizowana, a roztwory w międzyczasie zmienią kolor na zielony na skutek uwalniania chlorofilu z zainfekowanych liści. Do homogenizacji należy napełnić każdą studzienkę w pierwszych sześciu rzędach płytki hodowlanej 96-dołkowej 180 µL 10 mM chlorku magnezu. Następnie do każdej studzienki w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej należy przenieść 20 µL zawiesiny z utartych tkanek i wymieszać, wielokrotnie pipetując ciecz w górę i w dół.Jeśli małe fragmenty tkanki zapchają końcówkę, należy ją skrócić o dwa do trzech milimetrów, aby ułatwić pobranie odpowiedniej objętości roztworu; zapewni to wystarczającą przestrzeń dla kropli na górnej powierzchni płytki. Tkanki różnych genotypów należy rozmieścić w naprzemiennych rzędach. Aby przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie szeregowe, należy przenieść 20 µl zawiesiny tkankowej do drugiego rzędu i powtarzać tę procedurę aż do szóstego rozcieńczenia. Używając podzielonych końcówek pipet, należy przenieść 20 µl roztworu z płytki 96-dołkowej na płytkę KB o wymiarach 150 mm na 15 mm.Pracuj od najmniej do najbardziej skoncentrowanej zawiesiny, aby uniknąć konieczności zmiany końcówek pipety pomiędzy rozcieńczeniami. Wysusz płytkę w temperaturze pokojowej przy lekko uchylonej pokrywce. Gdy na powierzchni płytki nie będzie już widocznej ciecz, zamknij pokrywkę, odwróć płytkę do góry dnem i inkubuj w temperaturze pokojowej.Inkubować płytki od 40 do 60 godzin, aż kolonie staną się widoczne. Potwierdzić, czy liczba bakterii na płytkach odzwierciedla przewidywany dziesięciokrotny spadek jednostek tworzących kolonie.Przelicz bakterie, zanim ulegną nadmiernemu wzrostowi i kolonie zaczną się zlewać. Określ liczbę bakterii w najniższym rozcieńczeniu, w którym kolonie nie nachodzą na siebie. Zazwyczaj preferowane rozcieńczenie do przeliczenia powinno zawierać od 10 do 50 kolonii, co może się różnić pomiędzy powtórzeniami technicznymi.Aby obliczyć poziom proliferacji bakterii, należy wyznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na krążek liściowy, korzystając z następującego wzoru, gdzie R oznacza numer rzędu, a T liczbę bakterii w każdej replikacji technicznej. Uzyskane dane są następnie wykorzystywane do sporządzenia wykresu. Każdy punkt danych przedstawia średnią z sześciu replikacji technicznych w skali logarytmicznej.Słupki błędu reprezentują 95% przedział ufności średniej nasilenia choroby. Podatność na P-S-M-E-S 43 26 oceniano poprzez zakażenie inokulum o wartości OD 600 wynoszącej 0,0002. Wyniki pokazują, że u wysoce podatnych mutantów NPR one dash one wzrost patogenu jest około 2,5 log lub 300 razy większy w porównaniu z roślinami typu dzikiego Columbia zero.Test infiltracji strzykawką można zmodyfikować, aby ocenić różne warstwy odpowiedzi immunologicznej. W celu oceny odporności wywołanej przez kwas salicylowy stosuje się zewnętrzną aplikację salicylanu sodu w celu zainicjowania odpowiedzi immunologicznej, którą następnie kwantyfikuje się poprzez pomiar wzrostu patogenu. Utrata NPR R one, który pełni funkcję receptora kwasu salicylowego i głównego koregulatora transkrypcyjnego genów docelowych zależnych od kwasu salicylowego, prowadzi do niewrażliwości na egzogenną aplikację pochodnej kwasu salicylowego.Aby scharakteryzować odporność wywołaną przez molekularne wzorce związane z drobnoustrojami, rośliny poddano wstępnej obróbce dwoma znanymi wyzwalaczami. W przypadku flg22, u roślin typu dzikiego Columbia 0 po traktowaniu flg22 odnotowano redukcję populacji bakteryjnej o jeden rząd wielkości (10-krotną), podczas gdy u roślin mutantów fls2 nie udało się wywołać efektu ograniczenia wzrostu bakterii. Podobnie rośliny mutanty efr okazały się niewrażliwe na wstępną obróbkę elf18.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić odpowiedź immunologiczną Arabic opsys za pomocą testu infiltracji strzykawką. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby monitorować rozwój choroby i pobrać próbkę tkanki po pojawieniu się corsis. Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 jest patogenem hemiatroficznym.Zatem pobieranie próbek powinno zostać przeprowadzone przed przejściem w stadium neurotroficzne. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza Western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, która konkretna ścieżka sygnalizacji immunologicznej jest zaburzona. Proszę pamiętać, że pracują Państwo z żywymi bakteriami.Chociaż Pseudomona Senge nie jest patogenna dla ludzi, podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowej utylizacji zanieczyszczonych materiałów eksploatacyjnych oraz zainfekowanych roślin.

bacterial-leaf-infiltration-assay-for-fine-characterization-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano test oparty na śmierci komórek w celu badania PTI u roślin Nicotiana benthamiana.

Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Źródło: Rufián, J. S., et.al. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje metodę infiltracji próżniowej polegającą na wprowadzeniu patogenu bakteryjnego do liści rośliny Arabidopsis . Podejście to wykorzystuje przygotowaną zawiesinę bakteryjną oraz impulsy próżniowe, aby umożliwić równomierne przenikanie przez szparki szparkowe, co skutkuje kontrolowanym zakażeniem liści.

Szczepienie patogena bakteryjnego do liści Arabidopsis poprzez infiltrację próżniową

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę infiltracji strzykawkowej w liściach Arabidopsis thaliana w celu ilościowej oceny odpowiedzi immunologicznej roślin na Pseudomonas syringae. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów obronnych.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae (Wideo) | JoVE Journal

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Przeglądaj więcej filmów