Name: Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Poznaj syntezę nanowłókien keratynowych metodą elektroprzędzenia dla inżynierii biomedycznej. Technika ta umożliwia tworzenie materiałów do inżynierii tkankowej, gojenia ran i uwalniania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Narodowej Fundacji Nauki za pośrednictwem Centrum Badań Inżynieryjnych na rzecz Rewolucyjnego Metalowego Biomateriału (ERC-0812348) oraz Edukacji Licencjackiej Nanotechnologii (EEC 1242139) za wsparcie finansowe.

Wszystkie protokoły są zgodne z wytycznymi Biura ds. Zgodności i Etyki Badań Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej A&T.
1. Chemiczne przygotowanie do ekstrakcji keratyny 4
<ol>
	<li>Aby przygotować 1000 ml 2% wag./obj. roztworu kwasu nadoctowego (PAS), pod wyciągiem należy dodać 20 ml kwasu nadoctowego do 980 ml wody dejonizowanej (DI).</li>
	<li>Aby przygotować 1 000 ml 100 mM roztworu zasady Tris (TBS), dodaj 12,2 g zasady Tris do 1 000 ml wody demineralizowanej i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczony roztwór kwasu solnego (DHAS) w dygestorium, wlewając 4 ml stężonego kwasu solnego do 30 ml wody demineralizowanej.</li>
	<li>Zaopatrz się w około 20 g ścinków włosów ludzkich, które nie zostały poddane obróbce chemicznej ani zmienione. Włosy mogą mieć dowolną długość.</li>
	<li>Umyj włosy dokładnie, ręcznie, ciepłą wodą z mydłem. Do końcowego płukania użyj wody dejonizowanej (DI).</li>
	<li>Przełóż włosy do dwóch zlewek o pojemności 600 ml i wstaw do piekarnika o temperaturze 80 ºC na 1 godzinę.</li>
	<li>Odcedź płyn z dna zlewki i wstaw z powrotem do piekarnika, aż włosy całkowicie wyschną.</li>
	<li>Podziel wysuszone włosy równomiernie między zlewki o pojemności 600 ml, umieszczając 10 g włosów w każdej zlewce. Nie pozwól, aby włosy wypełniły się więcej niż 500 ml.</li>
	<li>Wlej 500 ml PAS do każdej zlewki, upewniając się, że pokryły wszystkie włosy. Przykryj zlewki parafilmem i przechowuj przez 12 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu ekstraktu keratynowego
<ol>
	<li>Oddziel włosy od PAS za pomocą sita 500 μm. Odpady PAS należy zebrać do osobnego pojemnika. Dokładnie spłucz włosy wodą DI, aby usunąć wszelkie resztki PAS.</li>
	<li>Umieść spłukane włosy w kolbie o pojemności 500 ml. Wlać 400 ml TBS do kolby, upewniając się, że włosy są pokryte. Umieścić kolbę w kąpieli wstrząsającej nastawionej na 38 °C, 65 obr./min na 1 godzinę.</li>
	<li>Po upływie 1 godziny wyjąć z kąpieli wstrząsowej i wlać płyn, około 400 ml roztworu do ekstrakcji keratyny (KES), do zlewki o pojemności 1 000 ml.</li>
	<li>Wlać 400 ml wody demineralizowanej do kolby zawierającej włosy, upewniając się, że włosy są pokryte i umieścić z powrotem w kąpieli wstrząsowej na 1 godzinę. Wyjąć kolbę z kąpieli wstrząsowej i wlać pozostałe 400 ml KES do zlewki o pojemności 1 000 ml z uprzednio zebranym KES. Włosy nie są już potrzebne i można je wyrzucić z kolby i wyrzucić do najbliższego pojemnika na śmieci.</li>
</ol>
3. Stężenie roztworu ekstraktu keratynowego
<ol>
	<li>Napełnić kąpiel destylatora rotacyjnego do górnej linii wodą destylowaną i ustawić na 90 °C. Ustawić prędkość obrotową na 200 obr./min. Włączyć pompę agregatu chłodniczego płynu chłodzącego i ustawić na -10 ºC.</li>
	<li>Używając pH-metru do monitorowania pH KES, użyj pipety, aby powoli dodawać 1 mM DHAS do KES, aż do osiągnięcia pH 7,0. Mieszaj powoli w miarę dodawania roztworu.</li>
	<li>Wlać zneutralizowany KES do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml do około jednej czwartej wypełnienia. Uruchom destylator zgodnie z protokołem producenta na 1,25 godziny.
	<ol>
		<li>Powtarzaj krok 3.3, aż cała KES zostanie zdestylowana. Upewnij się, że kolba jest szczelnie podłączona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dializa roztworu ekstraktu keratynowego
<ol>
	<li>Wlać roztwór KES równomiernie do 12 oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 14 ml. Odwirować probówki o masie 1 050 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Wlej odwirowany KES do czystej zlewki, upewniając się, że wylałeś z dala od zebranych zanieczyszczeń. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie KES zostaną odwirowane.</li>
	<li>Napełnij cylinder z podziałką o pojemności 2,000 ml wodą DI.</li>
	<li>Przytnij membranę celulozową rurki do dializy na 24 cale i przypnij jeden koniec rurki, aby ją zamknąć.</li>
	<li>Zanurz rurkę w cylindrze z wodą DI, aby była bardziej elastyczna i łatwiejsza do otwarcia.</li>
	<li>Otwórz niezaciśnięty koniec membrany celulozowej rurki do dializy i powoli wlej 60 ml odwirowanego roztworu KES do rurki. Użyj innego zacisku, aby zamknąć ten koniec rurki.</li>
	<li>Umieść rurkę dializacyjną w butli o pojemności 2 000 ml z wodą demineralizowaną i pozostaw na 24 godziny. Zmieniaj wodę dimentalną w butli co 3 do 4 godzin.</li>
	<li>Po upływie 24 godzin przelej dializowany roztwór KES do zakorkowanych słoików, pamiętając o pozostawieniu miejsca na górze i umieść w zamrażarce w temperaturze -20°C na 24 godziny.</li>
</ol>
5. Liofilizacja roztworu ekstraktu keratynowego
<ol>
	<li>Ustawić liofilizator na -86 ºC.</li>
	<li>Wyjmij słoiki zawierające zamrożony KES z zamrażarki, zdejmij nakrętki ze słoików i umieść je w ampułkach liofilizatora. Umieść uszczelki na ampułkach i przekręć pokrętło, aby wytworzyć podciśnienie 0,133 mBar. Liofilizuj próbki przez około 48 godzin, aż cała wilgoć zniknie.</li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworów do elektroprzędzenia (10 % wag. roztworu keratynowego)
<ol>
	<li>Usuń keratynę w proszku z liofilizatora i zważ ją.</li>
	<li>Dodaj wodę DI do keratyny w proszku, aby uzyskać 10% wagowo-wagowy roztwór keratyny.</li>
</ol>
7. Przygotowanie 10% wagowego roztworu PCL
<ol>
	<li>Otrzymać PCL (polimer ε-kaprolaktonu, Mn 70 - 90 kDa) i trifluoroetanol (TFE). Przygotować 10% wagowo PCL w TFE, mieszając O/N i otrzymać jednorodną mieszaninę.</li>
</ol>
8. Przygotowanie roztworu keratyny/PCL
<ol>
	<li>Otrzymać uprzednio przygotowany 10% % roztwór PCL i 10% wag. roztwór keratyny. Stopniowo dodawaj keratynę do roztworu PCL, aby uzyskać 10 ml roztworów PCL/keratyny w proporcjach 90:10, 80:20, 70:30 i 60:40.</li>
	<li>Użyj wirownika, aby uzyskać jednorodną mieszaninę roztworu PCL/keratyny przed elektrowirowaniem.</li>
</ol>
9. Produkcja elektroprzędzonego włókna PCL/keratynowego
<ol>
	<li>Umieścić około 8 ml roztworu PCL/keratyny w jednorazowej strzykawce o pojemności 10 ml wyposażonej w plastikową rurkę o średnicy 0,5 mm. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej, w której natężenie przepływu jest ustawione na 2,5 ml/h.</li>
	<li>Przyłóż napięcie do końcówki igły podłączonej do rurki (umieszczonej ~23 cm od bębna zbierającego światłowód i ~30 stopni od poziomu). Przyłóż napięcie 19 - 22 kV do rury i obróć bęben kolektora z prędkością około 200 obr./min.
	<ol>
		<li>Owinąć bęben kolektora folią aluminiową przed uruchomieniem próbki. Upewnij się, że folia aluminiowa jest stabilna, nakładając taśmę etykietową na obu końcach. 
		Uwaga: Włókna utworzą się na folii aluminiowej (patrz rysunek 2), przechowuj folię pokrytą włóknem w temperaturze RT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Analiza mechaniczna nanowłókien PCL/keratynowych
<ol>
	<li>Pociąć próbkę na 60 mm na 8 mm. Upewnij się, że zapisałeś grubość za pomocą mikrometru cyfrowego. Do każdej przygotowanej kompozycji należy użyć pięciu próbek.</li>
	<li>Podłącz próbkę o wymiarach 60 x 8 mm do testera rozciągania. Użyj specjalnie zaprojektowanego uchwytu na próbkę, aby przymocować próbkę. Umieścić próbkę między uchwytami na próbki, które są wykonane z karty indeksowej za pomocą taśmy dwustronnej. Zastosować czujnik wagowy 10 N o prędkości przemieszczenia 10 mm/min. 
	Uwaga: Uchwyt próbki został zaprojektowany tak, aby miał wymiary 62 mm na 40 mm z wewnętrznym okienkiem 50 mm na 38 mm.</li>
	<li>Rejestruj wartości rozszerzenia i obciążenia za pomocą oprogramowania zgodnie z protokołem oprogramowania.</li>
	<li>Oblicz naprężenie, dzieląc siłę przez obszar badanej próbki. Następnie oblicz odkształcenie, dzieląc zmianę długości przez długość początkową.</li>
	<li>Wygeneruj krzywą naprężenie-odkształcenie, wykreślając naprężenie na osi y dla odpowiedniej wartości odkształcenia na osi x.</li>
	<li>Oblicz moduł Younga z obszaru liniowego, w którym nachylenie jest równe modułowi sprężystości. Określ wytrzymałość na rozciąganie na podstawie wykresu naprężenia i odkształcenia, biorąc 0,2% przesunięcia odkształcenia i rysując linię równoległą do krzywej obszaru liniowego.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę statystyczną danych mechanicznych uzyskanych wcześniej w trzech egzemplarzach, stosując jednoczynnikową analizę wariancji przy użyciu oprogramowania analitycznego8. Wartości p <0,05 uznano za istotne statystycznie.</li>
</ol>
11. Morfologia powierzchni i charakterystyka strukturalna
<ol>
	<li>Za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) o parametrach napięcia przyspieszającego 15 kV i prądu 5 μA można obserwować morfologię włókien elektroprzędzonych.
	<ol>
		<li>Przed obrazowaniem za pomocą SEM należy wyciąć odcinek włókna o długości 2 cm2 i przymocować go do stolika SEM za pomocą taśmy miedzianej. Umieść stolik wewnątrz napylarki i pokryj złotem o natężeniu 15 mA przez 1 minutę i 30 sekund, aby utworzyć warstwę złota o grubości około 11 nm. Załaduj próbkę do komory SEM. Obserwuj próbki włókien.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), aby scharakteryzować wiązanie chemiczne między PCL a keratyną. Umieść odcinek 2 cm2 elektroprzędzonej membrany z nanowłókien w uchwycie magnetycznym i przed testem przepłucz system suchym powietrzem. Uzyskaj widma dla 200 skanów i przeanalizuj widma za pomocą standardowego oprogramowania zgodnie z protokołem oprogramowania.</li>
	<li>Wykonaj analizę widma przy użyciu standardowego oprogramowania i użyj trzech egzemplarzy każdego stosunku nanowłókien zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
12. Badanie interakcji komórka-włókno
<ol>
	<li>Pokrój włókna na 16 mm2 próbki. Użyj biokompatybilnego kleju na bazie silikonu, aby przymocować każdą próbkę do szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm.</li>
	<li>Przyklej jeden koniec próbki włókna do tylnej części szkiełka nakrywkowego, owiń próbkę wokół szkiełka nakrywkowego, a następnie przyklej wolny koniec próbki również do tylnej części szkiełka nakrywkowego, pozostawiając górną część szkiełka pokrytą tylko próbką włókna.</li>
	<li>Umieść próbki błonnika w 24-dołkowej płytce. Wysterylizuj próbki, zanurzając je w 80% etanolu na 1 godzinę.</li>
	<li>Wypłukać etanol z próbek za pomocą wody demineralizowanej. Następnie naniec pipetą 2 ml podłoża podstawowego na próbki, upewniając się, że pokryła całą próbkę. Usuń podłoże po 5 minutach.</li>
	<li>Użyj komórek fibroblastów 3T3 do wysiewu próbek błonnika. Zawiesić komórki w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej antybiotykami i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), tak aby na 1 ml DMEM przypadało około 62 000 komórek/cm2</li>.
	<li>Wrzuć 1 ml roztworu DMEM zawierającego komórki 3T3 do każdej płytki dołka, upewniając się, że każda próbka włókna jest pokryta około 62 000 komórek/cm2. Inkubować płytki basenowe przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Uwaga: Użyj 5% CO2 , ponieważ ten poziom zwykle może utrzymać pH pożywki komórkowej w zakresie fizjologicznym przez kilka dni.</li>
</ol>
13. Degradacja matrycy z nanowłókien
<ol>
	<li>Pociąć wysuszone membrany z nanowłókien PCL/keratyny na kwadrat o wymiarach około 30 mm x 30 mm.</li>
	<li>Próbki o średnicy 900 mm2 sterylizować 80% alkoholem przez 10 minut inkubacji i dokładnie umyć wodą demineralizowaną. Próbki inkubować w 15 ml PBS o pH 7,5 w temperaturze 37 °C. Bufor należy wymieniać co 3 dni.</li>
	<li>Wyjmować membrany z roztworu w określonych odstępach czasu, 1 tydzień i 7 tygodni, i płukać wodą demineralizowaną.</li>
	<li>Umieścić próbki membrany w ampułkach liofilizatora. Umieść uszczelki na ampułkach i przekręć pokrętło, aby wytworzyć próżnię. Liofilizować przez 24 godziny, aż do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Przymocuj wysuszoną próbkę do stolika SEM za pomocą taśmy miedzianej. Umieść stolik wewnątrz napylarki i pokryj złotem pod ciśnieniem 15 mA przez 1 min i 30 sekund.</li>
	<li>Załaduj próbkę do komory SEM. Obserwuj próbki włókien przy napięciu przyspieszającym 1,5 kV i prądzie 5 μA.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Compos+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos Sci Technol. 63, (2003).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for regenerative medicine.</a> Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).</li>
<li>Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28-caprolactone%29%2Fkeratin-based+composite+nanofibers+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B%22%5BJournal%5D)">Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications.</a> J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).</li>
<li>Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+component+8c-1+of+alpha-keratin.+An+analysis+of+the+amino+acid+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence.</a> Biochem J. 236, 705-712 (1986).</li>
<li>Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+fibroblast+cells+on+keratin-coated+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomat+Sci-Polymer%22%5BJournal%5D)">Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata.</a> J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).</li>
<li>Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Bone+Development+from+a+Pre-Osteoblast+Cell+Line+on+Three-Dimensional+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds.</a> Tissue E. 6, 605-617 (2000).</li>
<li>Fortin, M. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Biological+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biol%22%5BJournal%5D)">New Biological Software.</a> Q Rev Biol. 71, 169-170 (1996).</li>
<li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li>
<li>Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.+Part+I.+Traditional+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors.</a> Tissue E. 7, 679-689 (2001).</li>
<li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural-Synthetic+Polyblend+Nanofibers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications.</a> Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Udało się wyekstrahować keratynę z ludzkich włosów. Kwas nadoctowy działał jako środek utleniający na ludzkie włosy, umożliwiając ekstrakcję keratyny przez Tris Base. Produkcja keratyny w proszku odbywała się na małą skalę ze względu na fakt, że odbywała się wyłącznie w celach badawczych. Procedura ta została już ustalona w przemyśle dla produkcji na dużą skalę. Celem ekstrakcji keratyny na małą skalę była kontrola zanieczyszczenia, zmienności partii i opłacalności.
Ekstrakcja keratyny jest et...

Elektroprzędzenie jest uznawane za powszechną metodę uzyskiwania nanowłókien polimerowych. Włókna mogą być wytwarzane w nanoskali, a właściwości włókien można dostosować 1. Te osiągnięcia i charakterystyka elektroprzędzonych nanowłókien są szczególnie interesujące ze względu na ich zastosowania w inżynierii biomedycznej, zwłaszcza w inżynierii tkankowej. Elektroprzędzone nanowłókna wykazują podobieństwa do macierzy zewnątrzkomórkowej, a tym samym sprzyjają adhezji, migracji i proliferacji komórek2. Ze względu na to podobieństwo do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), włókna elektroprzędzone mogą być używane jako materiały wspomagające opatrywanie ran, dostarczanie leków oraz do inżynierii tkanek, takich jak wątroba, kości, serce i mięśnie3.
Do stworzenia włókien elektroprzędzonych do różnych zastosowań inżynierii biomedycznej użyto wielu różnych polimerów pochodzenia syntetycznegoi naturalnego. 4. W ostatnim czasie rośnie zainteresowanie rozwojem nanowłókien kompozytowych poprzez mieszanie polimerów syntetycznych i naturalnych4. W tych kompozycjach produkty końcowe zazwyczaj dziedziczą wytrzymałość mechaniczną związaną z polimerem syntetycznym, a jednocześnie przyjmują wskazówki i właściwości biologiczne polimeru naturalnego.
W tym eksperymencie, PCL i keratyna są przedstawione jako syntetyczne i naturalne polimery, które mają być użyte do syntezy kompozytowego nanowłókna. Keratyna to naturalny polimer, który znajduje się we włosach, wełnie i paznokciach. Zawiera wiele reszt aminokwasowych; Godnym uwagi zainteresowaniem jest cysteina4,5. Idealnie byłoby, gdyby naturalnie występujący polimer był bioodnawialny, biokompatybilny i biodegradowalny. Keratyna posiada wszystkie trzy te cechy, jednocześnie zwiększając proliferację komórek i przywiązanie do biomateriałów, w których została włączona6.
Polikaprolakton (PCL) to resorbowalny, syntetyczny polimer, który ma duże znaczenie w inżynierii tkankowej4. Polimer ten był wcześniej chwalony za swoją stabilność strukturalną i mechaniczną, jednak brakuje mu powinowactwa komórkowego i wykazuje długie tempo degradacji. Hydrofobowy charakter PCL jest prawdopodobnie odpowiedzialny za brak powinowactwa komórkowego7. Jednak PCL rekompensuje swoje ograniczenia tym, że jest wysoce mieszalny z innymi polimerami. Kompozyt PCL/keratyna powinien wykazywać właściwości mechaniczne PCL i uwzględniać właściwości biologiczne keratyny, co czyni go idealnym wyborem do różnych zastosowań biomedycznych.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie włosy&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Uzyskany z lokalnego salonu fryzjerskiego w Greensboro</td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (polimer e-kaprolaktonu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluoroetanol (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (TrizmaTM Base Powder)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99.9% krystaliczny</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lot 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Membrana celulozowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa molekularny mikroskop optyczny odcinający</td></tr><tr><td></td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td><td>Japonia</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>Japonia</td></tr><tr><td>Maszyna stołowa Shimadzu</td><td>Ameryka Północna Przyrządy analityczne i pomiarowe Seria AGS-X</td><td>Seria AGS-X&nbsp;</td><td>Columbia, lekarz medycyny</td></tr><tr><td>Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera</td><td>Instrument Bruker Tensor 2&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>Microcal Origin</td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>Dyfrakcja rentgenowska (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance Dyfraktometr</td><td></td> rentgenowski <td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblast 3T3&nbsp; komórka</td><td>Amerykańska kolekcja</td><td></td> kultur typu tkanki <td>Manassas,</td></tr><tr><td>zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy VA Dulbecco (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS czytnik mikropłytek</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Sunnyvale, Kalifornia</td></tr><tr><td>Student - test post hoc Newmana-Keulsa</td> Oprogramowanie <td></td><td></td><td>SigmaPlot 12</td></tr></tbody></table>

synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, ze względu na swoją wszechstronność i potencjał do zastosowań w różnych dziedzinach, jest często używany do produkcji nanowłókien. Produkcja tych porowatych nanowłókien cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na ich unikalne właściwości fizykochemiczne. W tym miejscu omówimy wytwarzanie nanowłókien zawierających keratynę zawierającą nanowłókna poli(ε-kaprolakton) (PCL) (tj. Włókno kompozytowe PCL/keratyna). Keratyna rozpuszczalna w wodzie została po raz pierwszy wyekstrahowana z ludzkich włosów i zmieszana z PCL w różnych proporcjach. Zmieszany roztwór PCL/keratyny przekształcono w błony nanowłókniste za pomocą zaprojektowanego w laboratorium zestawu do elektroprzędzenia. Morfologię włókien oraz właściwości mechaniczne otrzymanego nanowłókna obserwowano i mierzono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i testera rozciągania. Ponadto za pomocą FTIR badano degradowalność i właściwości chemiczne nanowłókien. Obrazy SEM wykazały jednolitą morfologię powierzchni dla włókien PCL/keratynowych o różnym składzie. Te włókna PCL/keratynowe wykazały również doskonałe właściwości mechaniczne, takie jak moduł Younga i punkt uszkodzenia. Komórki fibroblastów były w stanie przyłączać się i namnażać się, co dowodzi dobrej żywotności komórek. Opierając się na cechach omówionych powyżej, możemy zdecydowanie argumentować, że mieszane nanowłókna polimerów naturalnych i syntetycznych mogą stanowić doskonały rozwój materiałów kompozytowych, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań biomedycznych.

Morfologia włókien 
Dla wszystkich składów włókien wykonano obrazy SEM. Patrz Rycina 3. Obraz włókien potwierdza, że są one zorientowane losowo.
Badania mechaniczne 
W różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej zazwyczaj wymagane są włókna o wysokiej wytrzymałości mechanicznej. Włókna te powinny zachować odpowiednią wytrzymałość i elastyczność w określonych warun...

Elektroprzędzone nanowłókna mają wysoki stosunek powierzchni do masy, doskonałą integralność mechaniczną oraz wspierają wzrost i proliferację komórek. Te nanowłókna mają szeroki zakres zastosowań biomedycznych. Tutaj wytwarzamy nanowłókna keratynowe/PCL przy użyciu techniki elektroprzędzenia i charakteryzujemy włókna pod kątem możliwych zastosowań w inżynierii tkankowej.

Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest synteza i charakterystyka nanowłókien na bazie keratyny do zastosowań biomedycznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii biomedycznej, takie jak gojenie ran, dostarczanie leków oraz inżynieria tkankowa, m.in. wątroby, kości i mięśni. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona tania, wydajna i może zostać przeskalowana do produkcji na dużą skalę.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na leczenie ran oraz dostarczanie leków w celu regeneracji tkanek. Choć metoda ta może dostarczyć informacji o zaletach stosowania nanofibryli otrzymywanych metodą elektroprzędzenia, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak regeneracja tkanek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ opracowanie substancji polimerowej zdolnej do tworzenia nanofibryli jest wymagające.Należy pozyskać około 20 gramów obciętych ludzkich włosów, które nie były poddane obróbce chemicznej ani innym modyfikacjom. Długość włosów może być dowolna. Włosy należy dokładnie umyć ręcznie w ciepłej wodzie z mydłem.Do końcowego płukania należy użyć wody dejonizowanej. Włosy należy umieścić w dwóch zlewkach o pojemności 600 ml i włożyć do piekarnika nagrzanego do 80 °C na jedną godzinę. Po wysuszeniu należy równomiernie podzielić suche włosy między zlewki o pojemności 600 ml, odważając 10 g włosów do każdej z nich.Nie dopuść do tego, aby włosy wypełniły więcej niż 500 mililitrów objętości. Następnie wlej do każdego zlewki 500 mililitrów roztworu kwasu nadoctowego (PAS), upewniając się, że wszystkie włosy są całkowicie zakryte. Przykryj zlewki folią Parafilm i przechowuj przez 12 godzin.Oddziel włosy od PAS za pomocą sita o oczkach 500 µm, zbierając zużyty PAS do osobnego pojemnika. Dokładnie wypłucz włosy wodą dejonizowaną, aby usunąć pozostałości PAS. Po umieszczeniu wypłukanych włosów w kolbie o pojemności 500 ml, wlej do niej 400 ml 100 mM roztworu Tris Base (TBS), upewniając się, że włosy są całkowicie zakryte.Następnie kolbę należy umieścić w łaźni wytrząsowej ustawionej na 38 °C i 65 RPM na jedną godzinę. Po godzinie kolbę wyjmuje się z łaźni wytrząsowej. Ciecz, stanowiącą około 400 ml roztworu do ekstrakcji keratyny (KES), należy przelać do zlewki o pojemności 1000 ml.Wlej 400 mililitrów wody dejonizowanej do kolby zawierającej włosy, upewniając się, że włosy są całkowicie przykryte, a następnie umieść kolbę z powrotem w łaźni wytrząsowej na jedną godzinę. Wyjmij kolbę z łaźni wytrząsowej i wlej pozostałe 400 mililitrów KES do zlewki o pojemności 1000 mililitrów z wcześniej zebranym KES. Włosy nie są już potrzebne i można je wyrzucić do najbliższego pojemnika na odpady.Po zneutralizowaniu zebranego KES zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wlej roztwór do kolby okrągłodennej o pojemności 500 mililitrów, wypełniając ją mniej więcej do jednej czwartej. Uruchom destylator zgodnie z protokołem producenta na 1,25 godziny, upewniając się, że kolba jest szczelnie podłączona. Powtarzaj ten proces, aż cały KES zostanie poddany destylacji.Rozleć destylowany roztwór KES w równych częściach do 12 osobnych stożkowych probówek o pojemności 14 ml. Wiruj probówki z prędkością 1 050 ×g przez 10 minut. Przelej odwirowany roztwór KES do czystego zlewki, dbając o to, aby nie pobrać zgromadzonych osadów.Powtarzaj czynność do czasu odwirowania całego roztworu KES. Następnie odetnij 24 cale celulozowej membrany tubingu do dializy i zaciśnij jeden koniec tubingu, aby go zamknąć. Otwórz niezaciśnięty koniec celulozowej membrany tubingu do dializy i powoli wlej do niego 60 milliliters odwirowanego roztworu KES.Użyj innego klipsa, aby zamknąć ten koniec rurki. Umieść rurkę do dializy w cylindrze o pojemności 2 000 ml z wodą dejonizowaną i pozostaw ją na 24 godziny, wymieniając wodę dejonizowaną w cylindrze co trzy do czterech godzin. Następnie przelej zdializowany roztwór KES do zakręcanych słoików, pamiętając o pozostawieniu wolnej przestrzeni u góry.Umieść zamknięte słoiki w zamrażarce o temperaturze -20°C na 24 godziny. Po 24-godzinnym mrożeniu zdejmij zakrętki ze słoików i przelej ich zawartość do ampułek liofilizatora. Załóż uszczelki na ampułki i przekręć pokrętło, aby wytworzyć ciśnienie próżni wynoszące 0,133 millibara.Liofilizuj próbki przez około 48 godzin, aż do całkowitego usunięcia wilgoci. Przygotuj roztwór PCL i keratyny, dodając kroplami 10% roztwór keratyny do 10% roztworu PCL, aby otrzymać roztwory o objętości 10 ml z proporcjami PCL do keratyny wynoszącymi 90:10, 80:20, 70:30 oraz 60:40. Przenieś około ośmiu ml wymieszanego w wortexie roztworu PCL/keratyny do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, wyposażonej w plastikową rurkę o średnicy 0,5 mm.Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej, ustawiając szybkość przepływu na 2,5 milliliters per hour. Przyłóż napięcie do końcówki igły połączonej z rurką. Przyłóż napięcie od 19 do 22 kilovolt do rurki i obracaj bębnem kolektora z prędkością około 200 RPM.Potnij włókna na próbki o wymiarach 16 mm². Użyj biokompatybilnego kleju na bazie silikonu, aby przymocować każdą próbkę do szkiełek nakładkowych o średnicy 12 mm. Przyklej jeden koniec próbki włókna do tylnej części szkiełka nakładkowego i owiń próbkę wokół szkiełka.Następnie przyklej wolny koniec próbki również do tylnej części szkiełka nakrywki, tak aby górna część szkiełka była pokryta jedynie próbką włókna. Umieść próbki włókien w płytce 24-dołkowej. Sterylizuj próbki, zanurzając je w 80% etanolu na jedną godzinę.Spłucz etanol z próbek, używając wody dejonizowanej. Następnie nanieś pipetą 2 mililitrów pożywki podstawowej na próbki, upewniając się, że cała próbka jest pokryta przez pięć minut. Do zasiewu na próbkach włókien wykorzystaj komórki fibroblastów 3T3.Zawiesić komórki w pożywce DMEM uzupełnionej o antybiotyki i 10% płodowej surowicy bydlęcej, tak aby uzyskać stężenie około 62 000 komórek na centymetr kwadratowy na jeden mililitr DMEM. Do każdego dołka płytki dodać jeden mililitr roztworu DMEM zawierającego komórki 3T3, upewniając się, że każda próbka włókien jest pokryta około 62 000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.Po wycięciu wysuszonych membran z nanowłókien PCL/keratyny, wysterylizuj próbki o powierzchni 900 mm² za pomocą 80% alkoholu, inkubując je przez 10 minut. Następnie dokładnie wypłucz membrany wodąydejonizowaną. W dalszej kolejności inkubuj próbki w 15 mL PBS o pH 7,5 w temperaturze 37 °C, wymieniając bufor co trzy dni.Wyjmować membrany z roztworu w określonych odstępach czasu: po jednym tygodniu oraz po siedmiu tygodniach. Przepłukać wodą dejonizowaną. Umieścić próbki membran w ampułkach do liofilizatora.Załóż korki na ampułki i wytwórz próżnię, aby liofilizować próbki przez 24 godziny, aż będą całkowicie suche. Następnie przymocuj wysuszoną próbkę do stolika skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) za pomocą taśmy miedzianej. Umieść stolik w napylaczu i napyl złoto przy natężeniu 15 milliamps przez jedną minutę i 30 sekund.Umieść próbkę w komorze SEM. Obserwuj próbki włókien przy napięciu przyspieszającym 1,5 kV i natężeniu prądu 5 µA. Tutaj przedstawiono reprezentatywne obrazy nanowłókien na bazie PCL/keratyny, pomyślnie otrzymanych metodą elektroprzędzenia z roztworów o stosunkach PCL/keratyny wynoszących 70:30, 80:20 oraz 90:10.Stwierdzono, że włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia wykazują moduły Younga zbliżone do modułów tkanki natywnej. Moduły Younga malały wraz ze wzrostem stosunku keratyny. Rycina przedstawia trend graficzny zmienności modułu Younga w funkcji stosunku PCL/keratyna.Przedstawione tutaj widma spektroskopii podczerwieni w przekształcie Fouriera potwierdzają wiązanie PCL z keratyną. Główny pik, zmierzony przy 1 722 cm⁻¹, jest zgodny ze standardowymi pomiarami pasma absorpcji PCL i jest widoczny na wszystkich widmach. Adhezja i proliferacja komórek na włóknach PCL-keratyna potwierdzają, że włókna nie są toksyczne i stanowią wsparcie dla wzrostu komórek.Wzrost filopodiów wzdłuż nanowłókien wskazuje na korzystną interakcję między fibroblastami a włóknami PCL/keratyny. Po opanowaniu techniki, synteza nanowłókien może zostać przeprowadzona w ciągu 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas przeprowadzania procesu elektroprzędzenia należy zwrócić szczególną uwagę na lepkość roztworu polimeru, szybkość przepływu roztworu, przyłożone napięcie, prędkość obrotową bębna oraz etapy hodowli komórek fibroblastów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat syntezy nanofibryli na bazie PCL/keratyny oraz ich znaczenia w dziedzinie inżynierii biomedycznej. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne badania, takie jak testy żywotności komórek i degradacji in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące reakcji toksycznej tkanek, wzrostu tkanek oraz degradacji włókien. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie inżynierii regeneracyjnej do eksploracji takich obszarów jak regeneracja skóry, gojenie ran i dostarczanie leków.Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak TFE, oraz z wysokim napięciem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie okularów ochronnych, fartuchów laboratoryjnych i rękawiczek, a także właściwa utylizacja rozpuszczalników.

synthesis-of-keratin-based-nanofiber-for-biomedical-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Ten manuskrypt opisuje procedurę wytwarzania i charakteryzowania włókien elektroprzędzonych z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) modyfikowanych przez Griffithsin, które wykazują silne działanie adhezyjne i przeciwwirusowe przeciwko zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 in vitro. Opisano metody stosowane do syntezy, modyfikacji powierzchni i charakterystyki wynikowej morfologii, koniugacji i desorpcji Griffithsiny z włókien modyfikowanych powierzchniowo.

Wytwarzanie i charakterystyka rusztowań z włókien modyfikowanych przez Griffithsin w celu zapobiegania infekcjom przenoszonym drogą płciową

Celem tego protokołu jest pokazanie montażu biomimetycznej nanomatrycy (NM) z nanorurkami o zasadzie Janusa (JBNT) i fibronektyną (FN). W przypadku jednoczesnej hodowli z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC), NM wykazują doskonałą bioaktywność w zachęcaniu do adhezji hMSC.

Wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Poznaj syntezę nanowłókien keratynowych metodą elektroprzędzenia dla inżynierii biomedycznej. Technika ta umożliwia tworzenie materiałów do inżynierii tkankowej, gojenia ran i uwalniania leków.

Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Przeglądaj więcej filmów