Name: Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj technikę izolacji błony Brucha z ludzkich oczu dawcy w celu analizy zawartości białek i węglowodanów. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów immunoregulacji związanych z zwyrodnieniem plamki żółtej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować dr Isaacowi Zambrano i personelowi Banku Okulistycznego Szpitala Okulistycznego w Manchesterze za dostarczenie tkanki oka ludzkiego dawcy oraz panu Pete'owi Walkerowi z Wydziału Nauk Przyrodniczych za wykonanie obrazów barwionych metodą H&E. Specjalne podziękowania kierujemy do pana Rogera Meadowsa za pomoc przy mikroskopii. SJC jest laureatem stypendium Rady Badań Medycznych (MRC) Career Development Fellowship (MR/K024418/1), a autorzy doceniają również inne niedawne fundusze na badania z MRC (G0900538 i K004441), Fight for Sight (1866) i The Macular Society.

Ludzka tkanka oka, która została uznana za cel badawczy, została uzyskana z Banku Okulistycznego Królewskiego Szpitala Okulistycznego w Manchesterze po usunięciu rogówki do przeszczepu. Wykorzystanie tkanek ludzkich do badań było zgodne z wytycznymi Ustawy o tkankach ludzkich (2004) oraz z aprobatą Uniwersyteckiej Komisji Etyki Badań Naukowych (numer referencyjny 11305).
1. Wzbogacenie całej błony Brucha
<ol>
	<li>Oczyść przestrzeń roboczą wokół i pod mikroskopem sekcyjnym 1% środkiem dezynfekującym (v/v), a następnie przetrzyj 70% (v/v) etanolem.</li>
	<li>Upewnij się, że masz pod ręką: jeden nowy jednorazowy skalpel, dwa sterylne skrobaki do komórek (powszechnie stosowane w hodowlach tkankowych) i trzy pary pęset (wymienione tutaj jako A, B i C, patrz lista materiałów).</li>
	<li>Umieść gałkę oczną w jednorazowej szalce Petriego, zachowując pokrywkę do późniejszego użycia. Za pomocą nowego jednorazowego skalpela usuń resztki nerwu wzrokowego, który może przeszkadzać w tworzeniu płaskiego mocowania tkanki. Następnie wykonaj cztery nacięcia w równych odstępach, aby utworzyć cztery ćwiartki, jeśli przechodzisz do części 3 (wzbogacenie błony plamki żółtej) nie przecinaj obszaru plamki żółtej.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że nacięcia rozciągają się na całej głębokości tkanki oka – od najbardziej wewnętrznej siatkówki neurosensorycznej (NSR), przez naczyniówkę i twardówkę (białko oka). Kontynuuj nacięcie dookoła oka od brzegu muszli ocznej do nerwu wzrokowego. Umożliwi to spłaszczenie muszli ocznej (patrz rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymając jedną ćwiartkę spłaszczonej muszli ocznej za pomocą pęsety A (aby zapobiec odwarstwieniu naczyniówki), użyj większej pęsety B, aby chwycić ciało szkliste i leżące pod spodem NSR i odciągnąć tę tkankę od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), zaczynając od obwodu, przesuwając się w kierunku środka otwartej muszli ocznej, a następnie po przeciwnej stronie. Zazwyczaj, ale nie zawsze, zarówno ciało szkliste, jak i NSR odłączają się jako jedno. Użyj skalpela, aby wyciąć wszelkie pozostałości NSR zakotwiczone na tarczy nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Ponownie, przytrzymując jedną ćwiartkę tkanki na miejscu za pomocą pęsety A, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie usunąć monowarstwę RPE z całej wewnętrznej powierzchni muszli ocznej. Komórki te łatwo się odklejają i mogą być widoczne jako ciemnobrązowe grudki. Spłucz PBS, aby delikatnie zmyć usunięte komórki RPE z muszli ocznej.</li>
	<li>Następnie użyj pęsety A, aby delikatnie oderwać leżącą nad nią ciemnoczerwoną tkankę (obejmującą zarówno błonę Brucha, jak i naczyniówkę) ze wszystkich 4 kwadrantów oka. Umieść wyciętą tkankę w czystym naczyniu.</li>
	<li>Używając spłaszczonej krawędzi skrobaka do jednej komórki, aby przytrzymać wyciętą tkankę na miejscu, użyj drugiego skrobaka, aby delikatnie zeskrobać tkankę. Odwróć tkankę i powtórz, usuwając jak najwięcej nadmiaru materiału. W końcu pozostanie półprzezroczysta membrana: jest to prymitywnie wzbogacona membrana Brucha. Użycie mikroskopu preparacyjnego przy co najmniej 20-krotnym powiększeniu jest niezbędne do pomocy w usuwaniu naczyniówki i wzbogacaniu błony Brucha.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura krótko przepłucz membranę Brucha ultraczystą wodą, aby usunąć resztki naczyniówki i krwi przed umieszczeniem membrany w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zawiesić wzbogaconą błonę Brucha w około 1 ml ultraczystej wody i krótko (około 15 sekund) wirować, aby pomóc w lizie zanieczyszczającej materii komórkowej (patrz rysunek 2). Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 30 sekund w celu osadzenia membrany i odessania supernatantu. 
	Uwaga: Pozostała wzbogacona membrana Brucha jest teraz gotowa do rozpuszczania (jak opisano w sekcji 2 poniżej) lub przechowywania w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Solubilizacja całej wzbogaconej błony Brucha i analiza Western Blot
<ol>
	<li>Ekstrahuj białko ze wzbogaconej błony Brucha, zanurzając tkankę w 500 μl 8 M mocznika przez 6 godzin w temperaturze pokojowej w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek (ryc. 3A).</li>
	<li>Odwirować rozpuszczone próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut, aby osadzać pozostałą materię zewnątrzkomórkową. Usunąć supernatant i przenieść go do membrany dializacyjnej MWCO o stężeniu 3 500 Da MWCO, a następnie umieścić próbkę w 1 l PBS w celu dializy przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 40 μl kulek izolujących białko i obracać próbkę z mieszanką kulek (20 obr./min na mieszalniku obrotowym) w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia kulek. Usunąć supernatant i rozpuścić białko związane z kulkami w 30 μl 2x bufor do ładowania próbki (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w/v) glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy, 3% β-merkaptoetanol).</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 10 000 x g przez 5 minut, aby zagnieździć pozostałe kulki.</li>
	<li>Załaduj supernatant zawierający uwolnione białka do wstępnie odlanego żelu gradientowego ze stroną SDS (patrz lista materiałów) w celu oddzielenia białek.</li>
	<li>Wizualizuj oddzielone prążki białkowe przy użyciu wspólnego protokołu barwienia, np. Coomassie blue.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, dodać 20 ml barwnika brylantowego (0,1% błękitu brylantowego (w/v), 50% metanolu, 10% lodowatego kwasu octowego, 40% wody) do żelu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór barwiący i przemyj zabarwiony żel wodą dejonizowaną, aż barwienie tła zostanie wystarczająco zredukowane, aby umożliwić wizualizację barwionego pasma białkowego.</li>
		<li>Alternatywnie, przenieś oddzielone pasma białkowe do nitrocelulozy w celu analizy zachodniej, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść oddzielone pasma białkowe na membranę nitrocelulozową przy 80 mA przez 2,5 godziny za pomocą półsuchego aparatu transferowego w buforze transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 10% [v/v] metanolu).</li>
	<li>Zablokować błonę w 10 ml PBS, 10% (w/v) mleka i 0,02% (w/v) BSA na 16 godzin w temperaturze 4 °C przed dodaniem pożądanych przeciwciał pierwszorzędowych do wykrywania białka. 
	Uwaga: Jako przykład, rysunek 3C pokazuje reprezentatywną immunoplamę rozpuszczonej błony Brucha od trzech oddzielnych dawców sondowanych pod kątem regulatora kaskady dopełniacza, białka podobnego do czynnika H 1 (FHL-1).</li>
</ol>
3. Wzbogacenie błony plamki żółtej Brucha
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 1.1 do 1.3 zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
	<li>Podczas gdy NSR jest nadal na miejscu, zlokalizuj żółte zabarwienie dołka, które reprezentuje centralny obszar plamki żółtej (patrz ryc. 4). Za pomocą sterylnego stemple biopsyjnego o średnicy 6 mm umieść go nad obszarem dołka i mocno wciąć w plamkę żółtą.
	<ol>
		<li>Trzymając stempel do biopsji na miejscu, wykonaj osobne nacięcie skalpelem od krawędzi muszli ocznej do krawędzi ostrza dziurkacza do biopsji, a następnie za pomocą pęsety B oderwij otaczający materiał oka, aby uzyskać czystą biopsję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pęsety C wyjmij 6 mm krążek chusteczki z dziurkacza i umieść na czystej pokrywie szalki Petriego. Umieść pokrywkę szalki Petriego i stempel plamki żółtej pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Usuń cienki krążek NSR (sprawdź, czy nie ma żółtego zabarwienia dołka, aby wywnioskować dokładność biopsji). Użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie usunąć komórki RPE.</li>
	<li>Zabezpiecz krążek plamki żółtej przez twardówkę za pomocą końcówek pęsety A i powoli oderwij naczyniówkę i kompleks błonowy Brucha za pomocą pęsety C. Ponownie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć niechciany naczyniówkę i materię krwi z błony Brucha.</li>
	<li>Umieść błonę plamki żółtej Brucha w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zawiesić w 1 ml ultraczystej wody. Wiruj przez chwilę (około 15 sekund), aby pomóc w lizie zanieczyszczającej materii komórkowej. Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 30 sekund w celu osadzenia membrany i odessania supernatantu. 
	Uwaga: Wzbogacona błona Brucha wyizolowana z plamki żółtej może być teraz wykorzystana do analizy proteomicznej przy użyciu preferowanych przez użytkownika protokołów trawienia.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, H. R., Chan, C. -C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life%3A+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li>
<li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+%28HF1%2FCFH%29+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li>
<li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li>
<li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li>
<li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li>
<li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li>
<li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula%2C+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li>
<li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+Bruch%E2%80%99s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of Bruch’s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch%E2%80%99s+membrane%3A+implications+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li>
<li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+%28beta+1+H%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li>
<li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li>
<li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch%E2%80%99s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci.+I%22%5BJournal%5D)">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisano wzbogacenie membrany Brucha do dalszej analizy, co pozwala na późniejsze analizy, w tym western blotting11, spektrometrię mas i właściwości dyfuzyjne membrany Brucha z wykorzystaniem zmodyfikowanych komór Ussinga11,14. Krytyczne kroki obejmują: a) dokładne skrobanie i umycie wewnętrznej powierzchni oka w celu usunięcia wszystkich komórek RPE, b) wielokrotne i staranne skrobanie leżącego pod spodem naczyniówki bez powodowania rozpadu zespołu Brucha oraz c) mycie wyciętego Brucha w ultraczystej wodzie, aby zapewnić lizę pozostałych komórek. Ponadto, jeśli wzbogacona błona Brucha ma być wykorzystana do analizy proteomicznej, ekstrakcja białek za pomocą mocznika jest najbardziej skuteczna w rozbijaniu tej sprężystej tkanki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak homogenizacja mechaniczna. Histologia wzbogaconej błony Brucha wskazuje, że ECM naczyniówki nie jest usuwana. Należy się tego spodziewać, ponieważ zewnętrzna warstwa błony Brucha pentilaminarnego jest utworzona przez błony podstawne komórek śródbłonka naczyniówki i naczynia włosowatego. Rzeczywiście, korzystne może być to, że ECM naczyniówki pozostaje, ponieważ zmiany zachodzą w tym w AMD, w tym odkładanie się końcowego kompleksu dopełniacza / kompleksu ataku błony (MAC)15. Należy zauważyć, że w przypadku szczegółowej analizy histologicznej błony Brucha, jej struktura byłaby lepiej zachowana, gdyby została przecięta w obecności twardówki, naczyniówki i błony Brucha. Rzeczywiście, histologia przedstawiona na rycinie 2 ma na celu wyłącznie ukazanie stopnia wzbogacenia wynikającego z techniki opisanej w tym manuskrypcie.
Wzbogacenie plamki żółtej Brucha wymaga starannego rozwarstwienia muszli ocznej, upewniając się, że NSR, a zwłaszcza dołek centralny, nie są uszkodzone; W przeciwnym razie identyfikacja, a tym samym izolacja plamki żółtej nie jest możliwa. Integralność tkanki jest również ważna dla tego procesu, dlatego zaleca się wykorzystanie próbek w czasie krótszym niż 48 godzin po uboju. Wymagany stopień wzbogacenia różni się w zależności od dawcy i może mieć na niego wpływ wiek dawcy, czas pośmiertny i obecność jakiejkolwiek patologii oka. Użycie terminu "wzbogacony" jest celowe w celu uznania ograniczenia techniki, a mianowicie, że "oczyszczenie" lub "izolacja" błony Brucha przy użyciu tej metody po prostu nie jest możliwa. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę, że ECM naczyniówki włosowatej łączy się z błoną Brucha, całkowite oddzielenie nie jest możliwe.
Zrozumienie zmian biochemicznych w odpowiednich tkankach oka jest niezbędne do zrozumienia postępu choroby oczu. To unikalne wzbogacenie błony Brucha ułatwia to zrozumienie; Trwające badania dotyczą proteomu wzbogaconej błony plamki żółtej Brucha przy użyciu spektrometrii mas w różnych stadiach AMD oraz w próbkach pochodzących od osób o różnych genotypach, aby lepiej zrozumieć patologię molekularną AMD. Opisana tutaj technika została już wykorzystana do pomyślnej identyfikacji FHL-1 jako dominującego regulatora dopełniacza w błonie Brucha 11 , a dalsze badania nad wzbogaconą błoną Brucha prawdopodobnie przyniosą więcej nowych informacji na temat patologii molekularnej AMD.

Wykorzystanie pośmiertnej tkanki ludzkiego oka w badaniach okulistycznych jest nieocenionym źródłem do zrozumienia patogenezy chorób oczu. Analiza ludzkich oczu dawców wniosła istotny wkład w rozpoznanie mechanizmów leżących u podstaw zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), które jest główną przyczyną ślepoty w świecie zachodnim1. Na całym świecie AMD odpowiada za około 8,7% wszystkich ślepot, a wraz z coraz bardziej starzejącą się populacją przewiduje się, że do 2020 r. dotknie 196 milionów ludzi2. AMD powoduje utratę widzenia centralnego i ma ogromny wpływ na niezależność i jakość życia pacjenta3. Wczesna postać AMD charakteryzuje się powstawaniem druz i może przejść w atrofię geograficzną (czasami określaną jako "suche" AMD) lub neowaskularyzację naczyniówkową (określaną również jako neowaskularne lub "mokre" AMD). Chociaż zastrzyki anty-VEGF mogą stabilizować lub poprawiać widzenie w neowaskularnym AMD, nie są one wyleczalne i obecnie nie istnieje leczenie atrofii geograficznej.
Chociaż wykazano, że niektóre warianty genetyczne modyfikują ryzyko AMD 4-8, mniej wiadomo o tym, jak te warianty wpływają na plamkę żółtą na poziomie biochemicznym. Ważnym miejscem w patogenezie AMD jest błona Brucha. Druzy tworzą się w tej strukturze, a różne badania dostarczyły dowodów na aktywację dopełniacza w błonie Brucha i wokół niej w AMD9. Błona Brucha to arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej, który oddziela komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od naczyniówki i ma grubość około 4 μm. Błona Brucha łączy się z naczyniówką włosowatą, warstwą naczyniówki, która zawiera naczynia włosowate z okienkami, a na zewnątrz znajdują się warstwy zawierające większe naczynia krwionośne10 (ryc. 1A).
Błona Brucha to pentilaminowy arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a ta metodologia szczegółowo opisuje, jak wyizolować błonę Brucha wraz z ECM leżącej pod spodem błony kosmówkowo-naczyniowej (odtąd nazywanej wzbogaconą błoną Brucha), która jest w dużej mierze pozbawiona komórek i wolnych od czerwonych krwinek. Wzbogacona błona Brucha została następnie wykorzystana do eksperymentów western blotting i histologicznych. Ponadto opisano metodologię wzbogacania błony Brucha wyłącznie z obszaru plamki żółtej oka, co będzie szczególnie interesujące dla osób badających biochemiczne aspekty AMD.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw pomocniczy 0,5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Przydatny (ale nie niezbędny) do obrazowania całego oka w mniejszym powiększeniu płaski</td></tr><tr><td>dziurkacz do biopsji 6 mm</td><td>Materiały medyczne na wezwanie</td><td>SCH-33-36</td><td>6mm Stemple do biopsji</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma - Komórka Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td> skrobaki</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>Do wzbogacania membrany</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Sterylne, pojedynczo pakowane skalpele Swann-Morton.</td></tr><tr><td>Podwójne reflektory punktowe LED na gęsiej szyi na ramionach 30 cm</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Elastyczne źródło światła niezbędne do preparacji i obrazowania</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Stosowany w celu zapobiegania wysychaniu plamki żółtej i podczas wzbogacania błony.</td></tr><tr><td>(A) Kleszcze</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>INS4280</td><td>(A) Cienkie (100 mm) i proste</td></tr><tr><td>(B) Kleszcze</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>INS4272</td><td>(B) Szerokie i (150 mm). Przydatny do podnoszenia dużych porcji próbki</td></tr> <tr><td>(C) Kleszcze</td><td>Naukowe materiały laboratoryjne</td><td>INS4323</td> <td>(C) Proste drobne punkty</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 cyfrowy kolorowy aparat fotograficzny i Oprogramowanie GT-Vision</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90 mm, używana jako naczynie na próbki</td></tr><tr><td>Kulki izolacyjne białek (żywica Strataclean)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereozoom GXMXTL3T (zakres powiększenia 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Mikroskop stereozoom przymocowany do statywu wysięgnika dla łatwości użycia podczas sekcji</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacenie błony brucha z ludzkich oczu dawcy

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną upośledzenia wzroku w krajach rozwiniętych. Choroba objawia się zniszczeniem środka siatkówki, zwanego plamką żółtą, co skutkuje utratą widzenia centralnego. Wczesna postać AMD charakteryzuje się obecnością małych, żółtawych zmian zwanych miękkimi druzami, które mogą przekształcić się w późne AMD, takich jak atrofia geograficzna (suche AMD) lub neowaskularyzacja (wysiękowe AMD). Chociaż zmiany kliniczne są dobrze opisane, a wiedza na temat wpływu genetyki na ryzyko AMD staje się coraz bardziej szczegółowa, jednym z obszarów, w którym brakuje znaczącego postępu, jest zrozumienie biochemicznych konsekwencji ryzyka genetycznego. Wynika to częściowo z trudności w zrozumieniu biochemii błony Brucha, bardzo cienkiej macierzy zewnątrzkomórkowej, która działa jak biologiczny filtr materiału z dopływu krwi i rusztowania, na którym znajduje się monowarstwa komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Druzy tworzą się w błonie Brucha, a ich obecność zaburza przepływ składników odżywczych do komórek RPE. Tylko badając skład białkowy błony Brucha, a także sposób, w jaki inne białka wchodzą z nią w interakcje, naukowcy mogą mieć nadzieję na rozwikłanie mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw powstawania druz, rozwoju AMD i późniejszej utraty wzroku. W tym artykule szczegółowo opisano metodologie wzbogacania całej błony Brucha lub tylko z obszaru plamki żółtej, tak aby można ją było wykorzystać do dalszej analizy biochemicznej, a także przedstawiono przykłady, w jaki sposób już zmienia to rozumienie biochemii błony Brucha.

Opisany powyżej protokół otrzymywania wzbogaconej błony Brucha prowadzi do izolacji błony Brucha, czyli macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) choriocapillaris, i usuwa większość komórek oraz szczątków komórkowych, w tym wszystkie komórki RPE (Rysunek 2). Płukanie wzbogaconej błony Brucha w wodzie jest kluczowym etapem w lizie wszelkich pozostałych komórek naczyniówki. Nacisk wywierany podczas skrobania naczyniówki wydaje się zagęszczać niektóre z nielicznych pozostałych jąder komórkowych w obszarze zdefiniowanym jako błona Brucha (Rysunek 2B).
Solubilizacja wzbogaconej błony Brucha umożliwia dalszą analizę zawartości białek. Rozdział prążków białkowych z solubilizowanej wzbogaconej błony Brucha z wykorzystaniem żelu SDS-PAGE z gradientem 4 - 12%, choć sam w sobie nie jest użyteczny do identyfikacji zawartości białek, wykazuje zdolność tej techniki do minimalizacji zanieczyszczeń białkami krwi, które wiążą się nieswoiście (Rycina 3B). W tym względzie zauważalnym brakiem w elektroforezie białek jest obszerny prążek albuminy surowicy ludzkiej (~66 kDa), który w przeciwnym razie mógłby utrudnić interpretację późniejszego western blottingu: potwierdza to również analiza histologiczna wzbogaconej błony Brucha przedstawiona na Rycynie 2. Rzeczywiście, w ramach prac opisanych wcześniej11, solubilizowana błona Brucha od szeregu indywidualnych dawców była badana pod kątem liczby białek przy użyciu specyficznych przeciwciał via western blotting (Rycina 3C). W przedstawionym tutaj przypadku zastosowano przeciwciało (oznaczone jako OX23)12 skierowane przeciwko 155 kDa regulatorowi odporności wrodzonej, zwanemu czynnikiem H dopełniacza (FH), co wykazało obecność prążka o niższej masie cząsteczkowej w próbkach błony Brucha od trzech oddzielnych dawców (Rycina 3C). Okazało się to później białkiem podobnym do czynnika H 1 (FHL-1), białkiem o masie 49 kDa spokrewnionym z FH i powstającym w wyniku wariacji splicingu tego samego genu13. FHL-1 wydaje się być głównym regulatorem dopełniacza obecnym w błonie Brucha11.
<img alt="Schemat dysekcji siatkówki i izolacji RPE przedstawiający twardówkę, naczyniówkę, NSR z pęsetą i szalką Petriego." src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Dysekcja ludzkiego oka i wzbogacanie błony Brucha. (A) Błona Brucha stanowi barierę z macierzy zewnątrzkomórkowej. Naczyniówka zawiera warstwę okienkowatych kapilar, które nieustannie zlewają się z błoną Brucha (tzw. choriocapillaris); oddzielają one resztę naczyniówki (zawierającą duże naczynia krwionośne) od jednowarstwowego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), który fizjologicznie wspiera fotoreceptory siatkówki nerwowo-czuciowej (NSR). (B) W gałce ocznej wykonuje się cztery nacięcia, co pozwala na jej otwarcie i przygotowanie preparatu płaskiego. Ciało szkliste można usunąć za pomocą pęsety. NSR może oddzielić się wraz z ciałem szklistym, ale można je również usunąć pęsetą. Do usunięcia warstwy komórek RPE z błony Brucha, podczas gdy jest ona wciąż zakotwiczona w naczyniówce i twardówce, używa się skrobaka do komórek. Kompleks błony Brucha i naczyniówki można oddzielić od twardówki, a następnie, używając nowego skrobaka, usunąć zewnętrzną część naczyniówki. Końcowe płukanie w wodzie ultrazczystej powoduje lizę pozostałych elementów komórkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne tkanki przed i po wzbogaceniu, obrazy mikroskopowe, struktura komórkowa." src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Histologia błony Brucha i naczyniówki. Przekroje barwione H&amp;E przed (A) i po (B) zeskrobaniu zewnętrznych struktur naczyniówki z błony Brucha i płukaniu w wodzie ultrapurej w celu uzyskania wzbogaconej błony Brucha. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat oczyszczania białek, konfiguracja sprzętu do dializy; wyniki elektroforezy żelowej wykazujące prążki białkowe." src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Solubilizacja wzbogaconej błony Brucha w celu analizy zawartości białek. (A) Białka można wyekstrahować z wzbogaconej błony Brucha poprzez inkubację w 8 M mocznika przez 6 hr w RT, a następnie poddać dializie przeciwko PBS. Do analizy Western białka z całego dialyzatu błony Brucha można wyizolować za pomocą kuleczek do izolacji białek i eluować poprzez gotowanie z redukującym buforem do ładowania próbek Laemmliego. (B) Reprezentatywny żel SDS-PAGE barwiony błękitem Coomassie, pokazujący zarówno nie programmerskie, jak i rozcieńczone solubilizowane białka błony Brucha (BM) z zastosowaniem metody opisanej w (A). (C) Reprezentatywny western blot solubilizowanej błony Brucha od 3 indywidualnych dawców (ścieżki 1 - 3) pod kątem białka podobnego do czynnika H-1 (FHL-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat ekstrakcji siatkówki, wzbogacanie błony Blocha w plamce z tkanki ocznej przy użyciu pęsety i wirówki." src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Izolacja wzbogaconej błony Blocha z plamki. Obszar plamki siatkówki to obszar o średnicy 5 mm, który można łatwo zidentyfikować po żółtym zabarwieniu znajdującej się nad nią dołka centralnego oraz dzięki bliskości sąsiedniej tarczy nerwu wzrokowego. Kierując się dołkiem centralnym, należy przyłożyć 6 mm wycinak do biopsji do płasko zamocowanego ludzkiego oka, aby wyciąć 6 mm blok tkanki plamki. Należy usunąć znajdującą się powyżej NSR i zeskrobać komórki RPE z wyciętej plamki. Pozostały kompleks błony Blocha/naczyniówki można następnie oddzielić od twardówki i dokładnie zeskrobać w celu usunięcia naczyniówki, a następnie poddać pozostały materiał komórkowy lizie poprzez zanurzenie w wodzie ultrazczystej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Identyfikacja białek specyficznie związanych z błoną Brucha w ludzkich oczach jest ważnym krokiem w zrozumieniu biochemicznych mechanizmów stojących za chorobami oczu, takimi jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wzbogacić ten arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej do dalszej analizy biochemicznej.

Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Ogólnym celem tej techniki sekcji tkanek jest wyizolowanie błony Brooksa z pośmiertnego ludzkiego oka oraz dostarczenie naukowcom konkretnego materiału niezbędnego do analizy zawartości białek i węglowodanów w tej strukturze. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmów, takich jak immunoregulacja w błonie Brooksa, które leżą u podstaw szeregu chorób oczu, w tym najpowszechniejszej formy ślepoty w świecie zachodnim – związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona analizę wyłącznie acellularnej błony Brooksa, bez zanieczyszczenia składnikami krwi lub komórkami nabłonka barwnikowego siatkówki, co w przeciwnym razie mogłoby prowadzić do błędnych wyników.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ praca z tkanką ludzką jest trudna, a izolacja bogatej błony Brooksa jest trudna do wyobrażenia sobie wyłącznie na podstawie opisu metodologii. Procedurę zaprezentuje dr Selena Mcca, postdok z naszego laboratorium. Na początek należy zdezynfekować przestrzeń roboczą wokół i pod mikroskopem, a następnie przetrzeć ten obszar 70% ethanol. Następnie należy przygotować narzędzia niezbędne do procedury; po przygotowaniu umieścić gałkę oczną w jednorazowej szalce Petriego, zachowując pokrywkę do późniejszego użycia.Użyj nowego jednorazowego skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałości nerwu wzrokowego, które mogłyby utrudnić przygotowanie płaskiego preparatu tkanki. Następnie wykonaj cztery równomiernie rozmieszczone nacięcia, aby utworzyć cztery kwadranty. Należy unikać przecinania obszaru plamki jedynie podczas wzbogacania błony Brooksa w plamce, penetrując jednocześnie całą głębokość oka.Kontynuuj nacięcie dookoła, od brzegu kielicha oka aż do nerwu wzrokowego. Pozwoli to na spłaszczenie kielicha oka. Następnie przytrzymaj jedną ćwiartkę spłaszczonego kielicha oka jedną pęsetą, używając większej pęsety do uchwycenia ciała szklistego i tkanki podścielającej.Odciągnij tę tkankę od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), zaczynając od obwodu i przesuwając się w stronę centrum po przeciwnej stronie. Jeśli ciało szkliste i siatkówka sensoryczna nie oddzielą się jako jedna całość, użyj skalpela, aby wyciąć wszelką pozostałą tkankę zakotwiczoną w tarczy nerwu wzrokowego, przytrzymując jeden kwadrant tkanki w miejscu. Użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie odczepić monowarstwę RPE z całej wewnętrznej powierzchni oczodołu.Komórki te łatwo się odrywają i widoczne są jako ciemnobrązowe, pigmentowane grudki. Przepłucz PBS, aby delikatnie wypłukać oderwane komórki RPE. Następnie ostrożnie odwarstw górną, ciemnoczerwoną tkankę ze wszystkich czterech kwadrantów oka.Umieść wyciętą tkankę w czystym naczyniu. Dodaj kilka kropli PBS, a w razie potrzeby spłaszcz tkankę za pomocą skrobaka do komórek i pęsety. Używając płaskiej krawędzi jednego skrobaka do komórek w celu unieruchomienia wyciętej tkanki, drugim skrobakiem delikatnie zeskrob tkankę, następnie obróć ją i powtórz czynność, usuwając jak najwięcej nadmiaru materiału.Umieść tkankę w czystej szalce Petriego. Po usunięciu materiału pozostała półprzezroczysta błona stanowi wstępnie wzbogaconą błonę Brooksa. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, usuń naczyniówkę, aby dalej oczyścić błonę.Krótko opłucz membranę brooks wodą ultrapure, aby usunąć pozostałości naczyniówki i krwi, a następnie umieść membranę w probówce do mikrowirówki. Po zawieszeniu membrany w około 1 ml wody ultrapure krótko wymieszaj na wortexie, aby pomóc w oddzieleniu zanieczyszczeń z materiału komórkowego. Odwiruj próbkę w celu utworzenia osadu i odessij nadsącz.Pozostała wzbogacona membrana brooks jest teraz gotowa do solubilizacji lub może być przechowywana w temperaturze -80 °C. W celu późniejszej ekstrakcji białek z wzbogaconej membrany brooks, należy zanurzyć tkankę w 500 µL 8 M mocznika na sześć godzin.W temperaturze pokojowej odwiruj rozpuszczone próbki, aby zgranulować pozostałą materię zewnątrzkomórkową. Usuń nadsącz i przenieś go do membrany dializacyjnej. Umieść próbkę w jednym litrze PBS w celu dializy przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Do każdej próbki należy dodać 40 µL kulek do izolacji białek i inkubować mieszaninę w rotacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Kulki należy osadzić poprzez wirowanie, a następnie usunąć nadsącz. Białko związane z kulkami należy zsolubilizować w 30 µL dwukrotnego buforu do ładowania próbek.Po 10 minutowej inkubacji odwiruj kuleczki i zbierz nadsącz. Naniesione uwolnione białka na gotowy żel SDS-PAGE z gradientem do rozdziału białek.W razie potrzeby należy zastosować standardowe procedury w celu wizualizacji rozdzielonych prążków białkowych. Przeprowadź analizę western blot zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi, aby wzbogacić błonę Brooksa w plamce żółtej. Postępuj zgodnie z procedurami przedstawionymi wcześniej, z wyjątkiem tego, że gdy siatkówka neurosensoryczna jest jeszcze na miejscu, zlokalizuj żółte zabarwienie dołka centralnego, które reprezentuje centralny obszar plamki.Umieść sterylny treściwiec do biopsji o średnicy 6 mm nad obszarem dołka i zdecydowanie przetnij plamkę, utrzymując treściwiec w miejscu. Wykonaj skalpelem osobne nacięcie od krawędzi oczodołu do krawędzi ostrza treściwieca do biopsji. Odwarstw otaczające tkanki oka, aby uzyskać czystą próbkę do biopsji.Wyjmij sześciomilimetrowy wycinek tkanki z wycinaka i umieść go na uprzednio przygotowanej, czystej pokrywce szalki Petriego. Umieść pokrywkę szalki Petriego oraz wycinak do biopsji plamki pod mikroskopem stereoskopowym. Sprawdź obecność żółtego zabarwienia dołka centralnego, aby ocenić dokładność biopsji.Następnie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek delikatnie usuń komórki RPE. Unieruchom tarczę nerwu wzrokowego przez twardówkę, używając końcówek pęsety, a następnie powoli odwarstw kompleks naczyniówki i błony Brooksa. W razie potrzeby użyj ostrza skalpela, aby oddzielić błonę Brooksa od twardówki.Ponownie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć niepożądane fragmenty naczyniówki i krew z błony Brooksa. Umieść plamkę błony Brooksa w probówce i zawieś ją w 1 ml wody ultrapure. Krótko wymieszaj w wirówce typu vortex, aby pomóc w lizie zanieczyszczeń komórkowych. Odwiruj próbkę, aby zgranulować błonę, a następnie odessaj nadsącz.Wzbogacona błona Brooksa wyizolowana z plamki może teraz zostać poddana analizie proteomicznej z wykorzystaniem wybranych protokołów trawienia. Te barwione H&amp;E skrawki tkanek ludzkiej plamki przed i po zeskrobaniu zewnętrznych struktur naczyniówki wykazują wzbogacenie błony Brooksa oraz acellularnej chorio-capillaris z zrębu naczyniówki. Ten żel SDS-PAGE wykazuje brak kontaminacji albuminą z krwi zarówno w niezmieszanym, jak i rozcieńczonym materiale błony Brooksa.Ten reprezentatywny western blot został poddany detekcji w celu wykrycia białka podobnego do czynnika H, regulatora odporności, pochodzącego od jednego z trzech dawców. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak wyizolować błonę Brooksa z ludzkiego oka w sposób zapewniający cenny materiał do późniejszych analiz biochemicznych i biofizycznych tej unikalnej struktury acellularnej. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi tkankami i ostrymi narzędziami może być niezwykle niebezpieczna i wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak stosowanie pełnych środków ochrony indywidualnej oraz szczepienia przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.Przed rozpoczęciem pracy z tkanką ludzką należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Ten film demonstruje rozwój modelu kiełkowania naczyniówki ex vivo do badania angiogenezy mikronaczyniowej oka. Test polega na hodowli eksplantatów oka myszy zawierających tkankę naczyniówki przyczepioną do twardówki i nabłonka barwnikowego siatkówki w określonych warunkach, które sprzyjają kiełkowaniu mikronaczyniówki przez naczyniówkę.

Test kiełkowania naczyniówki w celu zbadania proliferacji mikrokrążenia gałki ocznej ex vivo

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Testy laboratoryjne mogą wykorzystać wartość prognostyczną z multimodalnego obrazowania zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) opartego na podłużnej optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ludzkie oczy dawcy z AMD i bez AMD są obrazowane za pomocą OCT, koloru, skaningowej oftalmoskopii laserowej w bliskiej podczerwieni i autofluorescencji na dwóch długościach fal wzbudzenia przed sekcją tkanki.

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Poznaj technikę izolacji błony Brucha z ludzkich oczu dawcy w celu analizy zawartości białek i węglowodanów. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów immunoregulacji związanych z zwyrodnieniem plamki żółtej.

Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy

Przeglądaj więcej filmów