Prosta metoda kontrolowanej wielkości syntezy stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota w warunkach otoczenia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie oligomerycznych klastrów nanocząsteczek złota, które charakteryzują się wysoką stabilnością, łatwością w deriwatyzacji oraz dobrze kontrolowaną średnicą, uzyskaną poprzez redukcję kwasu chloroaurowego tiocyjanianem sodu. Cząsteczki, które analizowaliśmy dzisiaj, są interesujące ze względu na bardzo precyzyjną kontrolę ich wielkości, co w konsekwencji pozwala na badanie przepuszczalności błon dla cząsteczek o różnych rozmiarach. Ponieważ są one bardzo stabilne w roztworach biologicznych, stanowi to niezwykle istotną właściwość tych cząsteczek.

Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na dobrze kontrolowaną syntezę wysokiej jakości oligoklastrów złota w warunkach laboratoryjnych i jest łatwa do przeprowadzenia przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego oraz ograniczonej liczby odczynników. Po przygotowaniu wszystkich niezbędnych roztworów zgodnie z protokołem tekstowym, należy rozpocząć syntezę oligoklastrów złota z wykorzystaniem czasu opóźnienia, dodając 7 ml roztworu boraksu do czystej szklanej butelki o pojemności 125 ml zawierającej 59,5 ml wody pod stałym mieszaniem. Następnie do butelki należy dodać 2,8 ml roztworu chlorku złota, co rozpoczyna odliczanie czasu opóźnienia, który determinuje rozmiar oligoklastrów.

Po zakończeniu okresu oczekiwania dodaj 700 µL roztworu tiocyjanianu sodu do butelki. Kontynuuj mieszanie przez noc, aby dokończyć syntezę oligoklastrów. Podczas przeprowadzania tej procedury, w przypadku stosowania większych objętości roztworu, ważne jest szybkie dodanie chlorku złota oraz roztworu tiocyjanianu sodu do wszystkich odczynników, przy użyciu dozowników z szerokim wlotem.

W celu dodatkowego wzrostu połączyć 10 milliliters złocistych oligoklastrów z 60 milliliters roztworu chlorku złota hydroksylowanego. Następnie, przy intensywnym mieszaniu, dodać 900 microliters roztworu tiocyjanianu sodu. Mieszaninę mieszać przez noc, aż reakcja dobiegnie końca.

Przed pochodnowaniem należy przenieść 70 mililitrów surowych oligoklastrów do wirówki z filtrem o progu odcięcia 30 kilodalton i wirować przez 15 minut przy 3 000 ×g. Odzyskać filtrat poprzez odwrócenie filtra i wirowanie przez 3 minuty przy 500 ×g. Następnie, za pomocą mikropipety, zmierzyć objętość odzyskanego płynu.

Następnie należy dodać objętość GSH równą jednej dziewiątej objętości odzyskanych oligoklastrów. Reakcję należy pozostawić w temperaturze pokojowej nie dłużej niż przez 10 minut. Aby zatrzymać reakcję, pochodne oligoklastrów należy rozcieńczyć w 50 mililitrach soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco.

Następnie nanieś pochodne oligoklastrów na filtr wirówkowy o progu odcięcia 30 kilodalton i wiruj przez 15 minut przy 3 000 ×g. Na koniec odzyskaj taśmę ree-tin, odwracając filtr i wirując przez trzy minuty przy 500 ×g. Przechowuj pochodne oligoklastrów z glutationem w temperaturze czterech stopni Celsiusza.

Aby przeanalizować surowe oligoklastry za pomocą elektroforezy żelowej, należy wymieszać je z buforem do nakładania próbek w stosunku dwa do jednego. Następnie nanosi się 30 µL oligoklastrów na gotowy żel poliakrylamidowy o gradiencie stężeń. Elektroforezę prowadzi się w buforze tris-glicynowym przez 26 minut przy napięciu 200 V.

W celu przeprowadzenia elektroforezy żelowej zderywatyzowanych oligoklastrów, najpierw rozcieńcz je wodą w stosunku jeden do trzech. Następnie rozcieńcz klastry dalej w stosunku dwa do jednego buforem do nakładania próbek. Na gotowy żel gradientowy z poliakryloamidu nałóż 10 µL mieszaniny oligoklastrów, a następnie prowadź elektroforezę w buforze tris-glicynowym przez 26 minut przy napięciu 200 V.

Aby przeprowadzić analizę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, 20 µL skoncentrowanych oligoklastrów należy przemyć 0,5 mL wody, a następnie nanieść je na wirówkę membranową o objętości 0,5 mL i progu odcięcia 30 kDa. Wirować przy 14 000 ×g przez 10 minut. Następnie należy usunąć filtrat z probówki i ponownie zawiesić osad w 0,5 mL wody.

Powtórz płukanie jeszcze dwukrotnie, a następnie rozcieńcz oligoklastry 500-krotnie wodą. Po naładowaniu siatki pokrytej węglem metodą wyładowania żarowego, nanieś 0,6 microliters oligoklastrów na siatkę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Na koniec zwizualizuj oligoklastry przy powiększeniu 100, 000 x i napięciu 80 kilovolts w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Wielkość oligoklastrów złota, zsyntetyzowanych przy użyciu procedur czasu opóźnienia (delay-time) oraz dobudowy (add-on), przeanalizowano za pomocą elektroforezy w żelu. Ścieżki od drugiej do czwartej na żelu wykazały, że wielkość klastrów rośnie wraz z wydłużeniem czasu opóźnienia. Ścieżki od piątej do ósmej potwierdzają, że wielkość klastrów zwiększa się również wraz z ilością hydroksylowanego złota użytego podczas procedury dobudowy.

Do wyznaczenia średnic cząstek oligoklastrów wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową. Średnice obliczono na podstawie pomiarów wykonanych na obrazach obszarów siatki o wymiarach 50 nanometrów na 50 nanometrów zawierających cząstki. Przedstawiono zależności między rozmiarem cząstek, czasem opóźnienia a ilością dodanego złota hydroksylowanego w formie wykresów.

Dane te przekształcono następnie w równania predykcyjne dla średnic cząstek w każdej z procedur. Metoda otrzymywania klastrów złota, o której z pewnością słyszeliście, zależy od hydroksylacji chlorku złota w roztworze zasadowym. W związku z tym, im większy stopień hydroksylacji, tym mniejsze jest prawdopodobieństwo utworzenia się klastra złota.

Moja nowa publikacja jest dla mnie szczególnie interesująca, ponieważ po raz pierwszy uświadomiłem sobie, że czas ekspozycji na odczyn alkaliczny może być wykorzystany do kontrolowania rozmiaru klastrów. Przy prawidłowym przeprowadzeniu procesu, w czasie krótszym niż jeden dzień można zsyntetyzować złote klastry koloidalne o rozmiarach od 3 do 70 nanometrów. Powstałe nanocząstki są stabilne w buforach fizjologicznych i osoczu, co czyni je odpowiednimi do eksperymentów in vivo.

Opisane tutaj złote oligoklastry mają dodatkową zaletę w postaci możliwości zagęszczania bez wcześniejszej pochodnowania, co pozwala na stosowanie odczynników do rootyzacji w mniejszych objętościach.