Name: Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia do pomiaru odpowiedzi neuronów smakowych Drosophila na feromony lipidowe w żywym organizmie. Technika umożliwia badanie aktywności pojedynczych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 dla J.Y.Y.).

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Skrzyżuj linię drivera Gal43,22 z muchami UAS-GCaMP5G19 (w1118;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Hoduj potomstwo w temperaturze 25 °C. 
	Uwaga: Uzyskanie much z wieloma kopiami transgenów Gal4 lub UAS-GCaMP może pomóc w zwiększeniu intensywności sygnału fluorescencyjnego. Wcześniejsza wersja transgenu UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) wykazywała bardzo słabą intensywność fluorescencji podczas ekspresji pod kontrolą drivera Gr68a-Gal4.
	<ol>
		<li>Zbierz i rozdziel według płci nowo wyklute osobniki dorosłe i hoduj je w temperaturze 25 °C. 
		Uwaga: Bazowy poziom fluorescencji GCaMP5G jest optymalny u much w wieku od 14 do 28 dni. Izolacja much według płci wyklucza możliwość interakcji społecznych, które mogłyby wpłynąć na odpowiedzi neuronalne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz muchę w łagodnym strumieniu CO2 w celu znieczulenia.</li>
	<li>Przymocuj muchę do szkiełka podstawowego, umieszczając najpierw małą kroplę lakieru do paznokci w centrum szkiełka o grubości 0.17 mm. Ostrożnie połóż muchę na boku na kropli przezroczystego lakieru, upewniając się, że mucha całkowicie zakrywa kroplę.</li>
	<li>Kroki 1.5 i 1.6 wykonaj pod stereomikroskopem sekcyjnym przy powiększeniu 8X.</li>
	<li>Używając wilgotnego pędzelka, wyprostuj przednią odnóżkę muchy. Unieruchom odnóżkę w tej pozycji, nakładając dwa cienkie paski taśmy na pierwszy i piąty segment tarsalny (Rycina 2A). Pozwoli to na odsłonięcie segmentów tarsalnych T2-T4 do obrazowania (Rycina 2B).</li>
	<li>Aby obrazować neurony na trąbce, nałóż cienki pasek taśmy na rostrum trąbki, aby odsłonić labellum (Rycina 2C, D).</li>
	<li>Narysuj wokół muchy barierę hydrofobową za pomocą pisaka PAP, aby zapobiec wypływaniu roztworu po powierzchni szkiełka. Pomiary wykonaj w ciągu 30 min od zamontowania preparatu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu bodźca
<ol>
	<li>Rozcieńczyć ligandy lipofilowe (takie jak CH503, użyty w niniejszym badaniu) w roztworze PBST: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 0.1% Triton X-100 (v/v); pH 7.4.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór stokowy liganda o stężeniu 1 mg/ml w PBST. Wszystkie kolejne rozcieńczenia roztworu stokowego przygotować z użyciem PBST. 
		Uwaga: W zależności od rozpuszczalności interesującego liganda, do jego rozpuszczenia mogą być potrzebne różne rozpuszczalniki. Rozpuszczalność CH503 w różnych rozpuszczalnikach opisano w Tabeli 1. W przeciwieństwie do innych rozpuszczalników, PBST nie powodował wzrostu fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stymulacja neuronów smakowych i akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Za pomocą pipety 10 µl nanieś 10 µl PBST na segmenty tarsalne. 
	Uwaga: Krok ten nawilża odnóże i zapobiega przemieszczaniu się segmentów tarsalnych.</li>
	<li>Użyj systemu optycznego wyposażonego w kamerę o odpowiedniej szybkości i czułości, aby uzyskać dobry sygnał fluorescencyjny przy wysokiej rozdzielczości czasowej. 
	Uwaga: W niniejszym badaniu wykorzystano konfokalny mikroskop z dyskiem rotacyjnym oraz kamerę sCMOS (patrz: Lista Materiałów).</li>
	<li>Wybierz konkretny segment tarsalny oraz neurony do obrazowania. Pozyskaj trzy konfokalne stosy Z (Z-stacks) przed stymulacją.
	<ol>
		<li>W idealnym przypadku należy zastosować parametry akwizycji na tyle szybkie, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość czasową, jednocześnie rejestrując całą objętość komórki. Przykładowe parametry akwizycji to: czas ekspozycji 200 msec, binning 2 x 2 i sekcje optyczne 6 x 0.5 µm2, rejestrowane co 2 sec. 
		Uwaga: Unieruchomione odnóża były pomyślnie obrazowane przez okres do 10 min w odstępach 30 sec, bez zauważalnego blaknięcia sygnału GCaMP. W przypadku dłuższego czasu rejestracji należy upewnić się, że odnóża są bardzo mocno przymocowane do szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Zoptymalizuj moc lasera, aby uzyskać najwyższy możliwy stosunek sygnału do szumu przy minimalnym fotoblaknięciu podczas całego procesu obrazowania. W opisanych tutaj eksperymentach do obrazowania neuronów smakowych Gr68a i ppk23 na odnóżach i trąbce użyto lasera diodowego 491 nm (100 mW) przy 30% transmisji. Zastosuj binning 2 x 2, aby umożliwić skrócenie czasu ekspozycji przy zachowaniu wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. 
		Uwaga: Ustawienia mocy lasera zostały zoptymalizowane tak, aby umożliwić detekcję zmian fluorescencji w zakresie od 1,2- do 4,5-krotnego wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś pipetą 10 µl roztworu stymulującego na segmenty tarsalne. W eksperymentach kontrolnych dodaj kolejne 10 µl PBST. Natychmiast zarejestruj 117 obrazów po stymulacji. 
	Uwaga: Liczba obrazów pozyskanych po stymulacji opiera się na czasie, w którym osiągnięto maksymalną zmianę fluorescencji (około 2 min).
	<ol>
		<li>KROK KRYTYCZNY: Podczas n nanoszenia roztworu na preparat nie dotykaj muchy końcówką pipety, ponieważ spowoduje to przesunięcie przedniego odnóża z pozycji. 
		Uwaga: Alternatywnie można użyć mikromanipulatora, aby precyzyjnie umieścić szklaną kapilarę zawierającą bodziec blisko obrazowanego segmentu tarsalnego. Podawaj kontrolowane objętości bodźca za pomocą dozownika do mikroiniekcji wewnątrzkomórkowych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza obrazów: Ilościowe określenie odpowiedzi
<ol>
	<li>Otwórz serię konfokalnych stosów Z (Z-stacks) za pomocą oprogramowania do analizy i przetwarzania obrazów Fiji (<a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a>)23 lub ImageJ (<a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a>)24.</li>
	<li>Wykonaj projekcję sumy intensywności (sum-intensity projection) wszystkich sześciu przekrojów Z dla każdego z 120 punktów czasowych.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję „Stack” w menu „Image”. Następnie wybierz opcję „Z projection”, wpisz „1” jako przekrój początkowy (start slice) i „4” jako przekrój końcowy (stop slice). Jako typ projekcji wybierz z menu rozwijanego „sum slices” i zaznacz „All time frames”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI), używając narzędzia do zaznaczania swobodnego (freehand selection tool), aby obrysować ciało komórki lub wypustkę neuronalną. Kliknij zakładkę „Analyze” i wybierz opcję „ROI manager” w menu „Tools”.</li>
	<li>Ilościowo określ fluorescencję w ROI, wybierając opcję „Set measurements” w menu „Analyze” i zaznaczając pola dla gęstości zintegrowanej (integrated density), pola (area), średniej (mean) i maksymalnej wartości szarości (maximum gray value) oraz etykiety (label). Następnie wybierz opcję „More” w menu ROI manager, a następnie opcję „Multi measure”. 
	Uwaga: Spowoduje to wyświetlenie okna pop-up z wartościami dla każdego z wybranych parametrów.</li>
	<li>Sprawdź maksymalne wartości szarości, aby upewnić się, że żadne z pikseli nie osiągnęło stanu nasycenia (np. 65 535 dla kamery 16-bitowej). 
	UWAGA: W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy odpowiedzi mierzono albo z ciał komórek, albo z wypustek neuronalnych, w zależności od tego, gdzie zaobserwowano maksymalny wzrost ΔF/F.</li>
	<li>Maksymalną względną zmianę fluorescencji (ΔF/F) w punkcie czasowym t oblicza się w następujący sposób: 
	<img alt="Wzór ΔF/F na zmianę intensywności fluorescencji, stosowany w obrazowaniu i analizie komórek." src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
	<ol>
		<li>Odejmij fluorescencję tła od każdej wartości F(cell). Aby określić ilościowo fluorescencję tła, zmierz gęstość zintegrowaną ROI o równym rozmiarze i kształcie w obszarze przedniej nogi (lub trąbki), który jest pozbawiony wykrywalnych neuronów.</li>
		<li>Aby określić ilościowo fluorescencję po stymulacji, F(cell)t, zmierz gęstość zintegrowaną ROI ciała komórki lub wypustki w punkcie czasowym „t” po stymulacji.</li>
		<li>Aby określić ilościowo fluorescencję przed stymulacją, F(cell)t=0, przeanalizuj obrazy ciała komórki lub wypustki sprzed stymulacji w ten sam sposób, co sygnał po stymulacji. Użyj średniej gęstości zintegrowanej z 3 obrazów, aby wyznaczyć F(cell)t=0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li>
<li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li>
<li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li>
<li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23%28%2B%29+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li>
<li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238(2014).</li>
<li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587(2012).</li>
<li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li>
<li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li>
<li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li>
<li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355(2014).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li>
<li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2%2B+imaging+of+single+chemosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304(2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+synthesis.+Part+250%3A+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster%2C+as+%283R%2C11Z%2C19Z%29-3-acetoxy-11%2C19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li>
<li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li>
<li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li>
<li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53(2010).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+signaling+from+O%282%29+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Opisujemy tutaj metodę wykonywania obrazowania wapnia na żywo neuronów obwodowych Drosophila w 2 różnych narządach zmysłów. Wywołane Ca2+ odpowiedzi fluorescencyjne GCaMP w neuronach Gr68a indukowane przez ligand feromonowy CH503 były zależne od dawki i ilościowe. Możliwe było również dostrzeżenie różnych wzorców reakcji neuronalnych, takich jak reakcje fazowe i toniczne.
Uważa się, że neurony wykazujące odpowiedzi fazowe umożliwiają szybką adaptację do ciągłych bodźców. Te...

Zwierzęta polegają na informacjach węchowych i smakowych, aby pośredniczyć w podejmowaniu decyzji niezbędnych do przetrwania i reprodukcji. Zrozumienie, w jaki sposób sygnały chemosensoryczne są wykrywane i przetwarzane przez układ nerwowy, wymaga identyfikacji receptora (receptorów) czuciowego i odpowiadających im ligandów chemicznych. Drosophila wykrywają oszałamiającą różnorodność lotnych i nielotnych związków i są doskonałym modelem do badania mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw chemosensacji. Podczas gdy narządy węchowe postrzegają lotne cząsteczki, narządy smakowe są wyspecjalizowane w wykrywaniu związków o niskiej lotności. W tym miejscu przedstawiamy metodę bezpośredniego pomiaru odpowiedzi neuronalnych z narządów smakowych Drosophila melanogaster na lipofilowe ligandy o niskiej lotności.
Narządy smakowe muchy obejmują przednie nogi, trąbkę i skrzydła. Na powierzchni narządów smakowych rozmieszczone są struktury przypominające włosy, znane jako sensilla, które reagują na cukry, gorycze, sole, wodę i feromony8. Sensilla została podzielona morfologicznie na włosie smakowe i kołki smakowe9. Na etykiecie znajduje się około 31 szczecinek smakowych, które są podzielone na morfologie długie (typ l), krótkie (typ s) i pośrednie (typ i). W sensylach "l" i "s" znajdują się 4 neurony czuciowe, które fizjologicznie reagują na cukier (komórka S), niską zawartość soli (komórka L1), wysoką zawartość soli i związki goryczkowe (komórka L2) oraz wodę (komórka W)10,11. W sensilli "i" znajdują się 2 neurony czuciowe, z których jeden reaguje zarówno na niską zawartość soli, jak i cukier, podczas gdy drugi reaguje na wysoką zawartość soli12. Na każdej z przednich kończyn znajduje się około 41 sensilli smakowych u samców i 26 sensilli u samic. Zarówno u samców, jak i samic na środkowej nodze znajduje się 21 sensilli, a na tylnej nodze około 22 sensilli13. Neurony smakowe zamknięte w czubku smakowym na nogach są również klasyfikowane jako typy L1, L2, W i S.
Jedna standardowa metoda pomiaru aktywności elektrycznej pojedynczych neuronów wykorzystuje elektrody zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe do rejestrowania przepływu jonów. Pomiary elektrod pozwalają na badanie funkcji neuronów w organizmach niemodelowych, takich jak gatunki Drosophila, i pszczoły, które nie mają rozbudowanych narzędzi genetycznych do znakowania neuronów. Jednakże, podczas gdy metody elektrofizjologiczne są rutynowo stosowane do pomiaru aktywności Drosophila taste sensilla4,13,14, zastosowanie tego podejścia wiąże się z kilkoma wyzwaniami technicznymi. Po pierwsze, włosie smakowe musi zostać zidentyfikowane na podstawie morfologii i lokalizacji przestrzennej. Po zidentyfikowaniu pomiary elektrofizjologiczne mogą być utrudnione ze względu na mały rozmiar czujnika, ograniczoną dostępność ze względu na położenie oraz trudności w zastosowaniu kontrolowanych objętości bodźca chemicznego do włosia smakowego. Ponadto stymulacja sensilli może generować sygnały z więcej niż jednego typu neuronu15. Po drugie, wykrywanie sygnałów elektrycznych może być zakłócone przez szum tła wynikający z wibracji mechanicznych i szumów pochodzących ze sprzętu elektronicznego. Po trzecie, użycie zaostrzonej elektrody może uszkodzić preparat na muchy, jeśli zostanie użyty nieprawidłowo14. Wreszcie, montaż stanowiska do elektrofizjologii wymaga specjalistycznych komponentów elektronicznych do dostarczania bodźców, rejestracji sygnału i analizy danych i może być kosztowny.
U D. melanogaster, dostępność genetycznie kodowanych narzędzi ułatwiła rozwój technik obrazowania, które pozwalają na badanie odpowiedzi małych populacji neuronów. Jednym z takich podejść jest użycie CaLexA reporter16. W tej metodzie sekwencje genów kodujących czynnik transkrypcyjny LexA-VP16 i wrażliwe na wapń białko NFAT są ze sobą połączone. Aktywacja wapniowa fosfatazy białkowej kalcyneuryny katalizuje defosforylację NFAT, a to z kolei ułatwia jego import do jądra. Wewnątrz jądra domena LexA wiąże się z motywem wiążącym LexAop-DNA, który kieruje ekspresją reportera białka zielonej fluorescencji (GFP), umożliwiając w ten sposób trwałą identyfikację funkcjonalnie aktywowanych neuronów. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do pomiaru odpowiedzi określonych kłębuszków węchowych w płacie czułkowym po ekspozycji żywych much na działanie środka zapachowego16. Ostatnio zmierzono fizjologiczne odpowiedzi neuronów receptora smakowego IR52c od żywych much przy użyciu CaLexA7. Jednak w tym badaniu konieczne było starzenie much przez okres do 6 tygodni, aby poprawić transkrypcję GFP. Podczas gdy barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-GFP może być stosowane w celu wzmocnienia sygnału CaLexA, metoda ta wymagałaby utrwalenia tkanki, co wyklucza możliwość obrazowania żywych komórek.
Genetycznie kodowane białko wskaźnikowe wapnia GCaMP było również szeroko wykorzystywane do badania odpowiedzi neuronalnych u wielu gatunków17. Białko GCaMP fluoryzuje z niską intensywnością przed stymulacją neuronalną. Zastosowanie bodźca wyzwala potencjał czynnościowy w neuronze, co skutkuje napływem Ca2+. GCaMP, związany z Ca2+, ulega zmianie konformacyjnej, powodując fluoryzację z jaśniejszą intensywnością (ryc. 1). Niedawno opracowana metoda obrazowania wapnia z pojedynczym neuronem została wykorzystana do zidentyfikowania glukozy jako liganda dla specyficznych dla kończyny przedniej kończyny neuronów smakowych Gr61a18. W tym badaniu wypreparowane kończyny przednie transgenicznej Drosophila wykazującej ekspresję GCaMP w neuronach smakowych Gr61a zostały pokryte warstwą agarozy przed obrazowaniem. Jednak użycie wypreparowanej tkanki może spowodować ostateczne wyczerpanie ekspresji GCaMP, ograniczając w ten sposób czas pomiaru i czułość wykrywania. Ponadto agaroza może ograniczać wrażliwość ze względu na wysoki poziom fluorescencji tła i jej właściwości rozpraszania światła.
Aby rozwiązać niektóre z tych problemów, opisujemy użycie obrazowania wapnia za pośrednictwem GCaMP do rejestrowania fizjologicznych reakcji neuronów smakowych kończyn przednich i trąbek nienaruszonych zwierząt. Pokazujemy fizjologiczne odpowiedzi neuronów Gr68a i ppk23 wyrażających genetycznie kodowany GCaMP5G19 na feromon lipidowy Drosophila (3R, 11Z, 19Z)-3-acetoksy-11,19-oktakosadien-1-ol (CH503)20,21. Odpowiedzi neuronalne mierzy się poprzez ilościowe określenie wzrostu fluorescencji sygnału GCaMP5G podczas stymulacji feromonami. W tym protokole neurony są obrazowane przez łączny czas 120 sekund, co jest wystarczające do różnicowania wzorców aktywacji neuronów w poszczególnych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Prezent od H. Amreina (Texas A& M Health Science Center, TX, USA) i J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Prezent od K. Scotta (Uniwersytet Kalifornijski, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; </td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe Stock Center 0,17 mm (szkiełko nakrywkowe Gold-Seal)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci, "twardy jak paznokcie czysty"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td>malarski z cienką końcówką</td></tr><tr><td>Taśma&nbsp;</td><td>Szkocka marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, klasa laboratoryjna</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Heksan, klasa HPLC</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr><tr><td>Receptura PBST</td><td></td><td></td><td>opisana w sekcji protokołu</td></tr><tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Synteza opisana w Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>Mikroskop C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>(Ti-Eclipse)</td><td>Głowica</td> skanująca z wirującym <td>dyskiem Ni-E Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1 Aquistion</td><td></td></tr><tr><td>Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>software open source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

W przeciwieństwie do ssaków, owady takie jak Drosophila mają wiele organów smakowych. Neurony chemosensoryczne na nogach, trąbce, skrzydłach i pokładełku Drosophila wyrażają receptory smakowe1,2, kanały jonowe3-6 i receptory jonotropowe7, które są zaangażowane w wykrywanie lotnych i nielotnych sygnałów czuciowych. Neurony te mają bezpośredni kontakt z degustantami, takimi jak żywność, szkodliwe substancje i feromony, a zatem wpływają na wiele złożonych zachowań, takich jak karmienie, składanie jaj i krycie. Zapisy elektrod i obrazowanie wapnia są szeroko stosowane u owadów w celu ilościowego określenia reakcji neuronalnych wywoływanych przez te degustatory. Jednak elektrofizjologia wymaga specjalistycznego sprzętu, a uzyskanie pomiarów z jednego czujnika smaku może być technicznie trudne w zależności od typu, rozmiaru i położenia ogniwa. Ponadto rozdzielczość pojedynczego neuronu u Drosophila może być trudna do osiągnięcia, ponieważ Taste Sensilla zawiera więcej niż jeden typ neuronów chemosensorycznych. Opisana tutaj metoda obrazowania wapnia na żywo pozwala na pomiar odpowiedzi pojedynczych neuronów smakowych u żywych muszek. Metoda ta jest szczególnie przydatna do obrazowania odpowiedzi neuronalnych na feromony lipidowe i inne typy ligandów, które mają niską rozpuszczalność w rozpuszczalnikach na bazie wody.

Wskaźnik wapnia GCaMP został wykazany genetycznie przy użyciu driverów Gr68a-Gal4 lub ppk23-Gal4. Każdy driver znakuje odmienne populacje neuronów przedniej nogi oraz nie neuronalnych komórek podporowych (Ryc. 3A-C). Reakcje specyficzne dla ligandu w odpowiedzi na lipofilny feromon CH503 zaobserwowano w komórkach Gr68a-Gal4 i ppk23-Gal4 wykazujących GCaMP (Ryc. 3D). Względna zmiana intensywności fluorescencji sygnału GCaMP5G (ΔF/F)) wzrastała ...

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar odpowiedzi fizjologicznych neuronów smakowych Drosophila na feromony lipidowe. Technikę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii sensorycznej, takie jak identyfikacja ligandów dla sierocych receptorów smakowych. Główną zaletą tej metody jest możliwość badania odpowiedzi pojedynczych neuronów smakowych w nienaruszonym, żywym organizmie.Po znieczuleniu muchy przymocuj ją do szkiełka nakrywkowego o grubości 0,17 milimetra, używając bardzo małej kropli bezbarwnego lakieru do paznokci. Przymocuj bok muchy do preparatu, wykorzystując całą kroplę. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj wilgotnego pędzla, aby wyprostować przednią nogę muchy.Następnie, używając dwóch bardzo cienkich pasków taśmy, przymocuj pierwszy i piąty segment tarsalny do szkiełka nakrywek. Jeśli obrazowane mają być neurony w trąbce, umieść kolejny cienki pasek taśmy nad rostrum trąbki, aby odsłonić labellum. Teraz, za pomocą pisaka PAP, zbuduj niską ściankę wokół muchy.Odczekać pół godziny do ustąpienia działania znieczulenia przed przystąpieniem do pomiarów. Do niniejszego protokołu należy przygotować niezbędne rozcieńczenia

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę wykrywania reakcji neuronów czuciowych u Drosophila za pomocą wiązania ligandów i obrazowania fluorescencyjnego. Ligandy wiążą się z receptorami neuronów, powodując napływ wapnia. Wapń wiąże się z kompleksami wskaźnikowymi, co prowadzi do emisji fluorescencji, która potwierdza odpowiedź neuronalną na ligand.

Wykrywanie reakcji fizjologicznych neuronów czuciowych u Drosophila

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania wapnia do pomiaru odpowiedzi neuronów smakowych Drosophila na feromony lipidowe w żywym organizmie. Technika umożliwia badanie aktywności pojedynczych neuronów.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Przeglądaj więcej filmów