Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Ogólnym celem tego behawioralnego testu biologicznego jest zbadanie zachowania kierowanego zapachem u much octowych. Fly Walk to system o wysokiej przepustowości, który automatycznie śledzi i analizuje reakcje behawioralne wielu pojedynczych much na bodźce węchowe. Ta nowa technika może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie węchu owadów.

Na przykład, czym jest hedoniczna równowaga zapachu lub co oznacza dodanie dodatkowych substancji zapachowych do tej równowagi? Główną zaletą tego eksperymentu jest to, że możemy sterować zapachem w wysokiej rozdzielczości tymczasowej i używamy bodźców zapachowych, które są podobne do tych, których owady doświadczają w naturze lub do tych, których używamy również w nagraniach elektrofizjologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które próbują zastosować tę metodę, mogą mieć problemy, ponieważ tak naprawdę wymaga ona hermetycznego systemu, więc musisz wiedzieć, przez co przechodzi powietrze i musisz mieć pewność, że w ogóle nie ma wycieków, w których powietrze może opuścić system I W przypadku tych eksperymentów ważne jest, aby hodować muchy w 12 do 12 jasnym cyklu ciemnym w kulturach o niskiej i średniej zawartości normalne podłoże spożywcze.

Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu między 23 a 25 stopni Celsjusza, a wilgotność względna powinna wynosić około 70% podczas przygotowania. Używając dużych fiolek hodowlanych, wykonano od 20 do 30 dorosłych osób przez tydzień i zbiorowo grupy od 30 do 40 potomstwa płci mieszanej, aby stworzyć eksperymentalną kohortę. Gdy kohorta ma od dwóch do czterech dni, przenieś ją do nowej fiolki zawierającej wilgotną piankową zatyczkę lub wilgotną bibułkę.

Pozwól muchom umrzeć z głodu w tej fiolce przez 24 godziny przed badaniem. Ważne jest, aby muchy nie były znieczulone podczas tego przenoszenia. W przypadku tej konfiguracji butelki o pojemności 250 mililitrów służą tylu nawilżaczom.

Napełnij każdą butelkę 100 mililitrami wody destylowanej. Następnie przygotuj półmililitrowe zapasy robocze każdego środka zapachowego jako jedno 1000 rozcieńczeń czystych zapachów i oleju mineralnego. Podobnie przygotuj jedną probówkę PCR z samym olejem mineralnym, który posłuży jako kontrola negatywna.

Teraz przygotuj system dostarczania zapachów dla każdego środka zapachowego. W eksperymencie. Podłącz dwa kulowe zawory zwrotne do każdej fiolki z zapachem.

Upewnij się, że fiolki z zapachami są podłączone we właściwym kierunku przepływu. Niewłaściwe połączenie nie tylko zagrozi planowanemu eksperymentowi, ale może również zanieczyścić system dostarczania. Następnie sprawdź system pod kątem wycieków.

Najpierw uszczelnij wylot komory mieszania. Następnie sprawdź, czy cały przepływ powietrza przed urządzeniem stymulacyjnym spadnie do zera. Jeśli w systemie są nieszczelności, nasłuchuj ich.

Zwykle można je rozwiązać, wymieniając gumowe uszczelki na kluczowych połączeniach lub wymieniając rurki teflonowe. W pierwszym kroku tej procedury problemem jest stłuczenie szkła, więc załóż odzież ochronną. Ostrożnie przenieś 15 pojedynczych much testowych do poszczególnych szklanych probówek Za pomocą aspiratora zamknij szklane rurki po obu stronach za pomocą odpowiednich adapterów, muszą one bardzo ciasno przylegać.

Następnie podłącz załadowane szklane rurki do zestawu do chodzenia po muchach. Po podłączeniu wszystkich rurek pozwól muszkom przyzwyczaić się do nowego środowiska przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Teraz włącz źródło światła.

Upewnij się, że zapewnisz wystarczającą ilość światła do wydajnego śledzenia bez zwiększania temperatury wewnątrz szklanych rurek. W tym momencie wszystkie fiolki zapachowe muszą być połączone, aby utworzyć zamknięty system. Okres przyzwyczajenia opiera się na zamkniętym systemie bez wycieków, więc przepływ powietrza przez rurki odbywa się z taką samą prędkością, jak w okresach testowych.

Sprawdź przepływ powietrza na komputerze, podłącz go do cyfrowych przepływomierzy. Całkowite strumienie powietrza wychodzącego z systemu powinny być równe przepływowi powietrza wchodzącego do systemu. Jeśli nie, oznacza to, że występuje wyciek.

Nieszczelność wpłynie na przepływ powietrza we wszystkich rurkach, ale problematyczna rurka zwykle to ta, która wykazuje największy spadek przepływu powietrza. Jeśli zostanie zidentyfikowany nowy wyciek, jest on zwykle spowodowany przez szklaną rurkę, która pękła wewnątrz adaptera, lub jest spowodowany odłamkami szkła w adapterach z poprzednich eksperymentów. Podczas tego procesu upewnij się, że wilgotność powietrza wychodzącego z systemu wynosi od 60 do 80%Po tym, jak muchy zaaklimatyzują się w swoich rurkach, eksperyment można przeprowadzić.

W zasadzie do tej pory można przedstawić dowolną sekwencję zapachów. Najlepsze efekty można uzyskać poprzez randomizację bodźców i oddzielenie ich od siebie o co najmniej 90 sekund. W sumie.

Przedstaw każdy zapach 40 razy w ciągu 500 milisekundowych impulsów. Następnie skonfiguruj obszar zainteresowania, przeciągając ramkę po obszarze, który ma być monitorowany. Uwzględnij wszystkie 15 szklanych rurek w ramce, ale nie uwzględnij zewnętrznych pięciu milimetrów końców rurek.

Następnym krokiem jest wyłączenie oprogramowania śledzącego i wprowadzenie modyfikacji w skrypcie. Spowoduje to zmianę położenia osi Y 14 równoległych linii oddzielających poszczególne rury. Gdy oprogramowanie śledzące jest ponownie włączone, między dowolnymi dwiema liniami powinna znajdować się tylko jedna mucha.

Następnie upewnij się, że parametry kamery są ustawione tak, aby muchy były niezawodnie śledzone w szklanych rurkach. Jeśli muchy zostaną zgubione na krawędziach obszaru zainteresowania, zwiększ jasność lub wzmocnienie oprogramowania śledzącego. Teraz, gdy system jest w pełni przygotowany, uruchom protokół bodźca.

Rejestruj pozycje much z szybkością 20 klatek na sekundę i rejestruj te pozycje współrzędnych w połączeniu ze stanem zaworu zapachowego w plikach tekstowych. Ponieważ eksperyment jest bardzo wrażliwy na zapachy, wymagane jest regularne czyszczenie, aby wyczyścić szklane rurki, namoczyć je w detergencie, a następnie spłukać pod bieżącą wodą destylowaną. Po wypłukaniu wysusz rurki pod sprężonym powietrzem, a następnie podgrzej je do 200 stopni Celsjusza przez osiem godzin.

Aby najpierw wyczyścić system dostarczania zapachów, wyjmij wszystkie fiolki i rurki zapachowe z centralnej komory mieszania. Następnie wyjmij adaptery przewodów z komory mieszania. Wyczyść opróżnioną komorę mieszania, spłukując ją rozpuszczalnikiem pod kapturem, takim jak rurki.

Osuszyć komorę mieszania za pomocą sprężonego powietrza i podgrzewać ją w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Aby wyczyścić fiolki z zapachami i zawory, wyjmij stalowe korki, wyrzuć gumowe uszczelki i wyjmij zawory zwrotne, zawory zwrotne mydła i etanol oraz inne składniki zarówno z etanolu, jak i acetonu. Następnie sonikuj namoczone składniki przez 30 minut na maksymalnym ustawieniu i spłucz je wodą destylowaną.

Tak jak poprzednio, do suszenia używaj sprężonego powietrza i podgrzewaj elementy do 200 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Przepłucz je etanolem Gdy aceton jest w kierunku przepływu powietrza, ponieważ aceton atakuje części gumowe, natychmiast wysusz każdy przepłukany zawór zwrotny sprężonym powietrzem, aby usunąć wszystkie resztki zapachów z przepłukanych zaworów zwrotnych. Pulsuj przez nie powietrzem przez kilka dni, ustaw je w inkubatorze o temperaturze 60 stopni Celsjusza z przepływem powietrza pulsującym w jednosekundowych odstępach.

15 wygłodzonych samic much wystawiono na działanie maślanu etylu. Żółty pasek reprezentuje impuls zapachu. Niebieskie kwadraty przedstawiają ruch pod wiatr w ciągu 100 milisekund

Odpowiednio czerwone kwadraty przedstawiają ruch z wiatrem. Te same muchy wykazywały również ruch pod wiatr w odpowiedzi na stymulację octanem izopu pentylu, octanem etylu lub dwoma trzema butanami d uśrednionymi dla populacji. Reakcja muchy na octan etylu miała ostry początek, wysoką amplitudę i krótki czas trwania.

W przeciwieństwie do tego, odpowiedź na dwa trzy butany Dion miała późniejszy średni początek, niższą amplitudę i dłuższy czas trwania. Ostatecznie dane z każdego nawaniacza zostały rozwiązane w ten sposób, a następnie poddane dalszej analizie, aby wykazać, że wszystkie cztery zapachy wywołały większe przemieszczenie pod wiatr w ciągu czterech sekund niż rozpuszczalnik. Ponadto, otwierając fiolki z nazapachem, muchy synchronicznie były wystawione na działanie wszystkich możliwych mieszanin.

Po stymulacji muszek czterema indywidualnymi zapachami, stymulacje mieszankami czterech zapachów były co najmniej tak samo atrakcyjne, jak najbardziej atrakcyjny pojedynczy związek w mieszance. Po opanowaniu eksperymentu możesz przeprowadzić go w ciągu godziny, a następnie trwa on przez osiem godzin i już 30 minut później możesz zwizualizować swoje pierwsze wyniki. Tak więc ta metoda naprawdę pozwala na uzyskanie danych od wielu much w krótkim czasie z wysoką tymczasową rozdzielczością.

Ale bądź ostrożny. Ten eksperyment wymaga intensywnego czyszczenia między eksperymentami. Jeśli twój system nadal jest zanieczyszczony mrówkami z ostatniego eksperymentu, możesz zapomnieć o swoich wynikach podczas spaceru w locie.

Możesz oczywiście również testować genetycznie zmodyfikowane muchy, dzięki czemu możesz zbadać wpływ indywidualnych lub fabrycznych obwodów neuronowych na zachowanie kierowane przez OD. Po opracowaniu tej nowej techniki, utorowało to drogę do prowadzenia badań w tej dziedzinie, frakcji owadów, aby zrozumieć kodowanie tych zapachów w mózgu owada. I co ważne, użycie tego samego rodzaju stymulacji do zachowania podczas chodzenia w locie i do eksperymentu fizjologicznego oznacza, że możemy naprawdę porównać te dwa różne paradygmaty eksperymentalne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak ustanowić chód muchy i powinieneś być w stanie przeprowadzić ten eksperyment na własnych kolanach i wkrótce rozpocząć własne, wysokoprzepustowe eksperymenty nad uczuciem owadów. Ale nie zapominaj, że praca ze szkłem i chemikaliami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze noś fartuch laboratoryjny. Używaj okularów i rękawiczek.