Name: Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę emulsji woda-w-olej do łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z hydrofobowymi pigmentami. Technika umożliwia badanie interakcji białko-chlorofil bez konieczności tagowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DN dziękuje za wsparcie ze strony projektów UE 7PR PEPDIODE (GA 256672) i REGPOT-2012-2013-1(GA 316157), oraz osobistego grantu badawczego (No. 268/10) z Izraelskiej Fundacji Naukowej. Dziękujemy prof. Shmuelowi Rubinsteinowi, School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, Cambridge, MA, USA za wykonanie zdjęć z mikroskopii konfokalnej.

1. Przygotowanie roztworów magazynowych
<ol>
	<li>ETAP KRYTYCZNY: Wykonaj wszystkie etapy przygotowania chlorofilu w kapturze chemicznym, w zielonym świetle (520 nm) lub w ciemności, aby zminimalizować fotouszkodzenia. Zawsze dodawaj azot lub argon przed zamrożeniem pigmentów do przechowywania. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy analitycznej.</li>
	<li>Zważyć około 5 mg liofilizowanych komórek Spirulina platensis lub innych komórek cyjanobakterii zawierających tylko Chl a w błonach tylakoidów i rozdrobnić za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Rozdrobnione komórki załadować na szklaną kolumnę i przemyć około 50-100 ml 100% acetonu w celu usunięcia karotenoidów. Wyrzuć eluowaną frakcję pomarańczowo-zieloną. 
	Uwaga: Jeśli frakcja pomarańczowa nie zostanie wymyta 100 ml acetonu, kontynuuj mycie komórek acetonem, aż zielona frakcja zacznie się wymywać.</li>
	<li>Zamień aceton na 100% metanol i zbierz zieloną frakcję zawierającą Chl a. Objętość eluowanej frakcji może wahać się w granicach 50-100 ml. Na początku eluowana frakcja ma ciemnozielony kolor, który pod koniec elucji zmienia się w bladozielony. Gdy kolor eluowanej frakcji zmieni się w bladozielony, zatrzymaj elucję.</li>
	<li>Odparować metanol za pomocą wyparki obrotowej, aż ekstrakt całkowicie wyschnie. Nie podgrzewaj roztworu; upewnić się, że temperatura łaźni wodnej parownika nie przekracza 30 °C. 
	Uwaga: Czas parowania zależy od objętości odparowywanej frakcji metanolu i może wynosić od 10 do 60 minut. Ważne jest, aby całkowicie wysuszyć ekstrakt.</li>
	<li>Rozpuść pigmenty z wysuszonego ekstraktu w niewielkiej objętości eteru dietylowego (około 5-10 ml) i przefiltruj przez watę. Upewnij się, że pigmenty są całkowicie rozpuszczone w eterze przed filtrowaniem.</li>
	<li>Odparować eter dietylowy aż do całkowitego wyschnięcia pigmentów (10-30 min). 
	Uwaga: Suche pigmenty można oczyścić i przechowywać w azocie lub argonie w temperaturze -20 °C, w ciemności do czasu dalszej obróbki.</li>
	<li>Suche pigmenty należy rozpuścić w jak najmniejszej objętości 100% metanolu (około 1 ml), nawet jeśli nie wszystko jest całkowicie zawieszone. Dodać 4 ml acetonu do roztworu i delikatnie strzepnąć szklankę, aby całkowicie rozpuścić pigmenty.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura delikatnie załadować próbkę na kolumnę sefarozy DEAE zrównoważoną w 100% acetonie.</li>
	<li>Elute karotenoidy (pomarańczowo-żółte pasmo) 100% acetonem. Następnie eluować Chl a (zielony pasek) mieszaniną acetonu i metanolu 3:1 v/v. 
	Uwaga: Objętość acetonu i mieszaniny acetonu/metanolu jest w przybliżeniu równoważna objętości sefarozy DEAE załadowanej na kolumnę.</li>
	<li>Sprawdzić czystość Chl a za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przy użyciu mieszaniny 68:25:5:2 dichlorometan/n-heksan/izopropanol/metanol (v/v) jako eluent 17.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aż Chl a całkowicie wyschnie (10-60 min). 
	Uwaga: Suchy Chl a można przedmuchnąć azotem lub argonem i przechowywać w atmosferze argonu w temperaturze -20 °C w ciemności.</li>
	<li>Przygotować Chl roztwór podstawowy, ponownie rozpuszczając suchy Chl a w 2-4 ml 100% etanolu. 
	Uwaga: Współczynnik ekstynkcji Chl a przy 663 nm wynosi 74 400 cm-1 M-1 (83,3 cm-1 (mg/ml)-1) w etanolu. Typowy roztwór podstawowy powinien mieć OD 1,860, co odpowiada stężeniu 25 mM (23 mg/ml). Dodanie 20 μl tego bulionu do emulsji zawierającej 5 ml fazy organicznej i 1 mg WSCP w 1 ml fazy wodnej daje mieszaninę z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a w porównaniu z WSCP.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fazy organicznej emulsji
Uwaga: Faza organiczna emulsji składa się z oleju mineralnego zawierającego 4,5% (v/v) Span 80 i 0,4% (v/v) Tween 80.
<ol>
	<li>Odważ w probówce o pojemności 50 ml 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 i 38 g oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj wszystkie składniki i ostudź na lodzie. 
	Uwaga: Faza organiczna może być przechowywana w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie fazy wodnej emulsji
Uwaga: Faza wodna emulsji może składać się albo z oczyszczonego WSCP, albo z surowego ekstraktu bakterii z nadekspresją WSCP.
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy wodnej zawierającej oczyszczony WSCP.
	<ol>
		<li>Hodować bakterie E.coli BL21 zawierające plazmid WSCP 12 w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka przez dodanie 1 mM IPTG. Po indukcji rozmnażaj bakterie w temperaturze 30 °C przez 12-16 godzin.</li>
		<li>Zbierać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozpuść osad w buforze wiążącym i poddaj sonikacji na lodzie (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, pięć razy). Użyć 10 ml buforu do osadu otrzymanego z odwirowania 250 ml pożywki LB z komórkami z nadekspresją białka. 
		Uwaga: W zależności od metody oczyszczania, bufor wiążący może składać się ze 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,2 lub 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.</li>
		<li>Odwirowywać lizat komórkowy w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Oczyść WSCP metodą chromatografii powinowactwa. W zależności od znacznika połączonego z WSCP, należy oczyścić rekombinowane białka przy użyciu odpowiedniego dostępnego na rynku systemu chromatografii powinowactwa do oczyszczania białek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Do przygotowania emulsji należy użyć oczyszczonego WSCP w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,8. Upewnić się, że końcowa ilość białka użytego do rozpuszczenia wynosi 0,5-1,0 mg na 1 ml buforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie fazy wodnej zawierającej surowy lizat bakteryjny za pomocą WSCP.
	<ol>
		<li>Hodować komórki E.coli BL21 zawierające WSCP wykazujące ekspresję plazmidu w 250 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka za pomocą 1 mM IPTG i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Komórki bakteryjne zbierać przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozpuścić osad w 1-2 ml 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,8, dokonać sonikacji (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, trzy razy) i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować fazę wodną emulsji, mieszając 0,125 ml supernatantu z 0,875 ml 50 mM buforu fosforanowego o pH 7.8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż WSCP z Chl a w emulsji
<ol>
	<li>Przenieść 5 ml mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego do szklanej fiolki i ostudzić na lodzie. Przed pipetowaniem należy sprawdzić, czy wszystkie składniki fazy organicznej są dokładnie wymieszane i czy nie ma separacji faz między środkami powierzchniowo czynnymi a olejem mineralnym.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatej fazy wodnej przygotowanej zgodnie z sekcją 3 do 5 ml fazy organicznej.</li>
	<li>Mieszać obie fazy za pomocą homogenizatora tkankowego przez 2 minuty przy 9 500 obr./min na lodzie.</li>
	<li>KROK KRYTYCZNY: Od tego etapu wykonuj wszystkie dalsze kroki w zielonym świetle (520 nm), aby zminimalizować fotouszkodzenia. Dodać 20 μl z 25 mM Chl roztworu podstawowego (patrz sekcja 1.13) do emulsji. Rozproszyć przez strzepnięcie i odwrócenie szklanej fiolki. Upewnij się, że Chl jest równomiernie rozprowadzony w emulsji.</li>
	<li>Inkubuj emulsję przez 1-2 godziny na lodzie w ciemności.</li>
	<li>W celu rozbicia emulsji i oddzielenia kropelek wody od fazy organicznej, należy przenieść emulsję do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Jeśli montaż się powiedzie, dolna faza wodna powinna mieć zielony kolor.</li>
	<li>Wylej górną fazę olejową i dodaj 1 ml oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj olej mineralny z granulowaną emulsją przez wir lub dokładnie obracając rurkę. Odwirowywać próbkę o wymiarach 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzać ten krok, aż do uzyskania przezroczystego menisku oddzielającego fazę wodną i olejową bez żadnej emulsji pośredniej.</li>
	<li>Wykonaj ten krok w okapie chemicznym. Po wyraźnym oddzieleniu fazy wodnej i oleju mineralnego usunąć olej mineralny i dodać 1 ml nasyconego wodą eteru dietylowego. Wirować i wirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Po drugim odwirowaniu usuń eter dietylowy i pozostaw otwarte probówki na 5-20 minut w okapie.</li>
	<li>Na koniec załadować fazę wodną zawierającą kompleks WSCP/Chl do kolumny odsalającej i wymyć buforem odpowiednim do dalszych eksperymentów. 
	Uwaga: Białko jest stabilne w fosforanowych i Tris w szerokim zakresie pH (6,0-7,5). Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C, chroniona przed światłem przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li>
<li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li>
<li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li>
<li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants%3A+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li>
<li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+%28WSCP%29+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li>
<li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li>
<li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li>
<li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li>
<li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein%2C+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li>
<li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li>
<li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+%28Brassica+oleracea+var.+gemmifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li>
<li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li>
<li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li>
<li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li>
<li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li>
<li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a%2Fb-protein+from+brussels+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li>
<li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Naszym celem było opracowanie nowego ogólnego systemu łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi. Pokazano tutaj, że nowy system rekonstytucji oparty na emulsji W/O jest ogólnym podejściem, które sprawdziło się w przypadku składania apoprotein WSCP z brukselki, kalafiora, chrzanu japońskiego i pieprzu Virginia rekombinowanych w E. coli. Przedstawiono wyniki po rozpuszczeniu 1 mg WSCP z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a. Możliwe jest jednak również stosowanie...

Hydrofobowe pigmenty, takie jak chlorofile (Chls), bakteriochlorofile (BChls) i karotenoidy, są głównymi kofaktorami w centrach reakcji fotosyntezy i białkach zbierających światło, które przeprowadzają transport elektronów oraz wychwytywanie i transfer energii świetlnej. Centra reakcji i większość kompleksów zbierających światło wiążące Chl to białka transbłonowe. Białko Fenna-Matthews-Olson (FMO) nietlenowych fotosyntetycznych bakterii zielonosiarkowych 1,2 oraz białko perydyniny-Chl (PCP) bruzdnic3 są wyjątkowymi przykładami rozpuszczalnych w wodzie białek zbierających światło. Rozpuszczalne w wodzie białka wiążące chlorofil (WSCP) roślin Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae i Amaranthaceae 4,5 są kolejnym unikalnym przykładem, jednak w przeciwieństwie do FMO i PCP, nie biorą one udziału w zbieraniu światła ani w żadnej z pierwotnych reakcji fotosyntezy, a ich dokładne funkcje fizjologiczne są jeszcze niejasne 5-8. Ich wysokie powinowactwo do wiązania Chl doprowadziło do sugerowania funkcji jako przejściowych nośników Chls i pochodnych Chl 9,10. Alternatywnie postawiono hipotezę, że WSCP odgrywa rolę w wymiataniu Chls w uszkodzonych komórkach i chroni przed uszkodzeniem fotooksydacyjnym wywołanym przez Chl 7,11-13. Niedawno zasugerowano, że WSCP działa jako inhibitor proteazy i odgrywa rolę podczas odporności roślinożerców, a także reguluje śmierć komórek podczas rozwoju kwiatów 14. WSCP dzielą się na dwie główne klasy w zależności od ich właściwości fotofizycznych. Pierwsza klasa (klasa I, np. z albumu Chenopodium) może ulegać fotokonwersji po oświetleniu. WSCP klasy II z roślin kapustnych, które nie są poddawane fotokonwersji 5,10, są dalej dzielone na klasę IIa (np. z Brassica oleracea, Raphanus sativus) i IIb (np. z Lepidium virginicum). Strukturę WSCP klasy IIb z Lepidium virginicum rozwiązano metodą krystalografii rentgenowskiej z rozdzielczością 2,0 A 8. Ujawnia symetryczny homotetramer, w którym podjednostki białkowe tworzą hydrofobowy rdzeń. Każda podjednostka wiąże pojedynczy Chl, co powoduje ścisły układ czterech ciasno upakowanych Chl w rdzeniu. Ten prosty układ wszystkich Chl sprawia, że WSCP są potencjalnie użytecznym systemem modelowym do badania wiązania i składania kompleksów Chl-białko oraz wpływu sąsiednich Chls i środowisk białkowych na właściwości spektralne i elektroniczne poszczególnych Chl. Co więcej, może dostarczyć szablonów do konstruowania sztucznych białek wiążących Chl, które mogą być wykorzystane w modułach zbierających światło w sztucznych urządzeniach do fotosyntezy.
Rygorystyczne badania rodzimych WSCP nie są wykonalne, ponieważ kompleksy oczyszczone z roślin zawsze zawierają niejednorodną mieszaninę tetramerów z różnymi kombinacjami Chl a i Chl b 9. W związku z tym wymagana jest metoda łączenia rekombinowanych ekspresji WSCP z Chls in vitro. Jest to wyzwaniem ze względu na znikomą rozpuszczalność Chls w wodzie, co uniemożliwia złożenie kompleksu in vitro poprzez proste zmieszanie rozpuszczalnych w wodzie apoprotein z pigmentami w roztworach wodnych. Wykazano składanie in vitro przez zmieszanie apoprotein z błonami tylakoidów 15, ale metoda ta jest ograniczona do natywnych Chls obecnych w tylakoidach. Schmidt i wsp. doniesiono o połączeniu kilku pochodnych Chl i BChl z WSCP z kalafiora (CaWSCP) poprzez rekombinacyjną ekspresję białka znakowanego histydyną w E. coli, unieruchamiając je na kolumnie powinowactwa do Ni i wprowadzając pochodne Chl rozpuszczone w detergentach 11. Zgłoszono również pomyślne odtworzenie rekombinowanych WSCP z A. thaliana 6 oraz brukselki (BoWSCP), dzikiej rzodkwi japońskiej (RshWSCP) i pieprzu wirginijskiego (LvWSCP) za pomocą podobnej metody.
Tutaj prezentujemy nowatorską, ogólną, prostą metodę łączenia Chls z WSCP, która nie wymaga znakowania ani immobilizacji białek. Polega ona na przygotowaniu emulsji z ich wodnych roztworów rozpuszczalnych w wodzie apoprotein w oleju mineralnym. Białka są zatem zamknięte w mikrokropelkach typu woda w oleju (W/O) o bardzo wysokim stosunku powierzchni do objętości 16. Kofaktory hydrofobowe są następnie rozpuszczane w oleju i są łatwo wprowadzane do kropelek z fazy olejowej. Opisano zastosowanie metody składania kilku wariantów apoprotein WSCP rekombinowanych wyrażanych w E. coli z Chl a. Pokazujemy składanie z surowego lizatu bakterii z nadekspresją WSCP, które mogą być wykorzystane jako system przesiewowy do opracowania nowych białek wiążących Chl.

<table><tbody><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Chromatografia powinowactwa do oczyszczania WSCP z natywną sekwencją.</td></tr><tr><td>Jego kolumna Pułapka HF</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Chromatografia powinowactwa do oczyszczania WSCP z His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Pożywka chromatograficzna do oczyszczania chlorofilu</td></tr></tbody></table>

emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorofile (Chls) i bakteriochlorofile (BChls) są głównymi kofaktorami, które przeprowadzają fotosyntetyczne zbieranie światła i transport elektronów. Ich funkcjonalność zależy krytycznie od ich specyficznej organizacji w dużych i skomplikowanych wielopodjednostkowych kompleksach białek transbłonowych. Aby zrozumieć na poziomie molekularnym, w jaki sposób kompleksy te ułatwiają konwersję energii słonecznej, konieczne jest zrozumienie interakcji białko-pigment i pigment-pigment oraz ich wpływu na dynamikę wzbudzoną. Jednym ze sposobów uzyskania takiego zrozumienia jest konstruowanie i badanie kompleksów Chls z prostymi, rozpuszczalnymi w wodzie rekombinowanymi białkami. Jednak włączenie lipofilowych Chls i BChl do białek rozpuszczalnych w wodzie jest trudne. Co więcej, nie istnieje ogólna metoda, którą można by zastosować do łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z pigmentami hydrofobowymi. Demonstrujemy tutaj prosty i wysokoprzepustowy system oparty na emulsjach typu woda w oleju, który umożliwia łączenie rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi Chls. Nowa metoda została zwalidowana poprzez połączenie rekombinowanych wersji rozpuszczalnego w wodzie białka wiążącego chlorofil roślin Brassicaceae (WSCP) z Chl a. Pokazujemy udane składanie Chl a przy użyciu surowych lizatów WSCP eksprymujących komórkę E. coli, które mogą być wykorzystane do opracowania genetycznego systemu przesiewowego dla nowych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących Chl oraz do badań interakcji i procesów składania Chl-białko.

Rekombinowane apobiałka WSCP zostały zmontowane z Chl a w emulsjach W/O zgodnie z protokołem opisanym w poprzedniej sekcji. Protokół wdrożono przy użyciu faz wodnych zawierających albo czyste WSCPs, albo lizaty komórek E.coli nadekspresujących WSCP (Rycina 1). Protokół jest prosty, szybki i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza homogenizatorem tkankowym.
Widma absorbancji i CD kompl...

Ten manuskrypt opisuje prostą i wysokoprzepustową metodę łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi pigmentami, która opiera się na emulsjach typu woda w oleju. Wykazano skuteczność metody w łączeniu natywnych chlorofili z czterema wariantami rekombinowanych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil (WSCP) roślin kapustnych ulegających ekspresji w E. coli.

Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Ogólnym celem tej techniki jest umożliwienie włączenia nierozpuszczalnych w wodzie chlorofili do miejsc wiążących białek rozpuszczalnych w wodzie. Metoda ta pozwala na składanie chlorofili z białkami rekombinowanymi, co umożliwia rygorystyczne badania oddziaływań chlorofil-białko i otwiera nowe możliwości konstruowania nowatorskich kompleksów chlorofil-białko. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona znakowania ani unieruchamiania białek.W związku z tym metoda ta doskonale nadaje się do testów przesiewowych. Procedurę zaprezentuje Dominica Bednarczyk, post-doc w mojej grupie badawczej. Podczas przygotowywania następujących roztworów zapasowych należy przeprowadzić wszystkie etapy przygotowania chlorofilu w dygestorium pod zielonym światłem lub w ciemności, aby zminimalizować uszkodzenia spowodowane działaniem światła.Przed zamrożeniem pigmentów do przechowywania zawsze należy dodać azot lub argon oraz upewnić się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy analitycznej. Na początek odważ około pięciu gramów liofilizowanych komórek Spirulina platensis lub innych komórek cyjanobakterii zawierających w błonach tylakoidów wyłącznie chlorofil a lub chlorofil-a i rozetrzyj je za

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Ten artykuł opisuje praktyczne metody przygotowania hydrożeli w foliach wolnostojących i impregnowanych membranach oraz charakteryzuje ich właściwości fizyczne, w tym właściwości transportu wody.

Synteza hydrożeli o właściwościach przeciwporostowych jako membran do oczyszczania wody

Ten protokół opisuje klinicznie stosowany sposób rozpuszczania związków hydrofobowych w środowisku wodnym przy użyciu kombinacji samoorganizujących się roztworów peptydów i aminokwasów. Nasza metoda rozwiązuje główne ograniczenie terapii hydrofobowych, w których brakuje bezpiecznych, skutecznych środków rozpuszczalności i metod dostarczania do warunków klinicznych.

Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

Oleje używane do dostarczania leków mogą zaburzać profil lipidowy pacjentów, co jest niepożądane w chorobach sercowo-naczyniowych. Oleje bogate w kwasy tłuszczowe omega-3 są zdrową alternatywą dla konwencjonalnych olejów i mają ogromny potencjał dla samoemulgowanych systemów dostarczania leków.

Samo-nanoemulgacja zdrowych olejów w celu zwiększenia rozpuszczalności leków lipofilowych

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj metodę emulsji woda-w-olej do łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z hydrofobowymi pigmentami. Technika umożliwia badanie interakcji białko-chlorofil bez konieczności tagowania.

Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Przeglądaj więcej filmów