Name: Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj test immunoprecypitacji chromatyny ChIP do badania interakcji białko-DNA in vivo u Arabidopsis. Ta metoda pozwala identyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i regulację genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować The Plant Cell za umożliwienie wykorzystania niektórych danych opublikowanych w tym czasopiśmie do opracowania reprezentatywnych wyników opisanych tutaj na rysunku 4. Prace te były wspierane przez unijną sieć szkoleń wstępnych Marie Curie-Curie-EpiTRAITS (umowa o grant 316965) oraz przez hiszpańskie Ministerio de Economìa y Competitividad (granty BIO2010-15589 i BIO2013-43098-R).

1. Sieciowanie materiału roślinnego (1 godz.)
<ol>
	<li>Hoduj linie Arabidopsis użyte w eksperymencie (typ dziki - WT - kontra mutanty i/lub linie wyrażające znakowaną wersję białka, które Cię interesują, kontra linie wyrażające znacznik niepołączony z żadnym białkiem) przez 12-18 dni na dużych szalkach Petriego (150 mm) z pożywką MS-agar (1 L: 1x sole Murashige i Skoog, 10 g sacharozy, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternatywnie, uprawiaj rośliny na doniczkach zawierających mieszankę gleby i wermikulitu w proporcji 3:1. 
	ostrożność! Formaldehyd jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu, i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Kroki 1.2 – 1.6 należy wykonać pod wyciągiem.</li>
	<li>Wykonaj małe otwory w pokrywie probówek o pojemności 50 ml za pomocą igły podgrzewanej w palniku laboratoryjnym. Dodać 40 ml buforu 1x PBS i 1,08 ml formaldehydu do końcowego stężenia 1% (podstawowy 37% roztwór). Zbierz 1,5 g materiału roślinnego w tych 50 ml probówkach. Utrzymuj rurki na lodzie podczas sieciowania.</li>
	<li>Zamknąć probówki o pojemności 50 ml pokrywką. Umieścić probówki w eksykatorze i zastosować podciśnienie. Infiltruj próżniowo tkankę przez 10 minut, a następnie ostrożnie zwolnij próżnię, aby zapobiec ubijaniu roztworu. Wymieszać próbkę. Powtórz dwa razy. Po infiltracji obserwuj materiał roślinny i upewnij się, że staje się on lekko przezroczysty i ma tendencję do opadania na dno rurki (ryc. 2).</li>
	<li>Dodać 2,5 ml 2 M glicyny, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 M. Stosować próżnię przez 5 minut. Glicyna działa jako konkurencyjny inhibitor sieciowania formaldehydu.</li>
	<li>Wyrzucić roztwór formaldehydu i glicyny PBS, odwracając zamkniętą probówkę o pojemności 50 ml z otworami w pokrywce.</li>
	<li>Opłucz sadzonki dwukrotnie 1x PBS i raz wodą, wylewając roztwór myjący, jak opisano w kroku 1.5. Osusz je na ręczniku papierowym i zamroź w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze –80 °C przez tygodnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przeciwciał (1 dzień)
UWAGA: Do immunoprecypitacji zaleca się stosowanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami za pośrednictwem łącznika białka G lub białka A o wysokim powinowactwie do stałej domeny łańcucha ciężkiego przeciwciała. Kompleksy DNA-białko mogą przyczepiać się niespecyficznie do powierzchni koniugatów kulki-przeciwciało. Z tego powodu konieczne jest przeprowadzanie kontroli bez swoistych przeciwciał w celu ilościowego określenia niespecyficznego wiązania tła.
<ol>
	<li>Do każdej immunoprecypitacji należy przygotować 15 μl kulek magnetycznych w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ilość kulek zależy od ilości chromatyny użytej do immunoprecypitacji, a także od przeciwciał.</li>
	<li>Aby przemyć, dodać 1 ml buforu rozcieńczającego immunoprecypitację chromatyny (ChIP) do kulek, wymieszać przez obracanie i umieścić 1,5 ml probówki mikrowirówkowej w stojaku magnetycznym. Odczekaj około 1 minuty, aby koraliki przyczepiły się do magnesu. Gdy probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml nadal znajdują się w stojaku, usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz dwa razy. 
	UWAGA: Dla każdej linii roślin potrzebne są dwa zestawy immunoprecypitacyjne: jeden z kulkami i przeciwciałami (Ab) oraz drugi z grupą kontrolną bez przeciwciał (No-Ab) z samymi kulkami magnetycznymi.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 200 μl buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać wymaganą ilość określonego Ab do jednej z dwóch probówek przygotowanych dla każdej linii roślinnej (dokładne rozcieńczenie różni się dla każdego Ab i musi być zoptymalizowane eksperymentalnie lub, w przypadku przeciwciał dostępnych na rynku, postępować zgodnie z instrukcjami producenta). Użyj tej próbki do immunoprecypitacji. Dodać taką samą ilość niespecyficznej IgG do drugiej probówki, która zostanie użyta jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Inkubować O/N na obracającym się kole w temperaturze 4 °C, aby przeciwciało mogło przyłączyć się do kulek.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja chromatyny (4 godz.)
<ol>
	<li>Dokładnie zmiel zamrożony materiał roślinny w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka, aż proszek stanie się jednorodny i jasnozielony. Przenieść proszek do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W przypadku stopni 3.2 – 3.6 pracuj pod wyciągiem. Dodać 30 ml buforu ekstrakcyjnego 1 (ExB 1) i dobrze wymieszać, aby namoczyć sproszkowaną tkankę. Począwszy od tego etapu, próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C przez cały czas. Zamrożona tkanka i resztki ciekłego azotu spowodują zamarznięcie buforu. Upewnij się, że całkowicie rozmroziłeś zamrożoną tkankę, odwracając probówki 4-5 razy co 2 minuty.</li>
	<li>Oczyścić gnojowicę, przepuszczając ją przez tkankę filtracyjną o wielkości porów 22-25 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie jądra i wszystkie organelle zostaną osadzone. ExB 1 zawiera wystarczającą ilość sacharozy, aby zapewnić wysoką gęstość i zapobiec zaburzeniu struktury organelli.</li>
	<li>Delikatnie usunąć supernatant przez dekantację. Na tym etapie obserwuj zieloną granulkę o pojemności około 2 ml.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml ExB 2. Ponowne zawieszenie śrutu będzie w tym momencie trudne. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: ExB 2 zawiera 1% Triton X-100, który pomaga rozerwać chloroplasty i usunąć chlorofil.</li>
	<li>Zawiesić osad w 300 μl buforu ekstrakcyjnego 3 (ExB 3).</li>
	<li>Do czystej probówki do mikrofuge dodaj 600 μl ExB 3. Weź ponownie zawieszony osad z kroku 3.6 i ostrożnie ułóż go na wierzchu czystego ExB 3.</li>
	<li>Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ten krok pomaga usunąć detergent z próbki.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez zasysanie pipetą. Zawiesić osad jądrowy w 300 μl buforu sonikacyjnego, powoli pipetując w górę iw dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które mogą wpływać na wydajność sonikacji. Ostrożnie odpipetować całą zawiesinę i przenieść ją do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Ten bufor zawiera SDS, do lizy jąder i uwalniania chromatyny.</li>
	<li>Sonikować zawiesinę, aby lizować jądra i losowo ścinać chromatynę na małe fragmenty. Stosować warunki sonikacji, które powodują, że chromatyna jest wzbogacona we fragmenty w zakresie 200-800 pz (20-30 cykli z ustawieniami 30 sekund WŁĄCZONYCH / 30 sekund WYŁĄCZONYCH w temperaturze 4 °C dla dostępnego urządzenia do sonikacji opisanego w Tabeli materiałów/odczynników). Sprawdź skuteczność sonikacji poprzez elektroforetyczne rozdzielanie otrzymanych fragmentów DNA na żelu agarozowym13, ładując 2 μl sonikowanej chromatyny (ryc. 3). 
	ostrożność! Upewnij się, że nosisz sprzęt ochronny słuchu podczas etapu sonikacji, na wypadek, gdyby urządzenie ultrasonograficzne nie znajdowało się w dźwiękoszczelnej szafce. 
	Kluczowy krok! Fragmentacja chromatyny w dużej mierze zależy od sprzętu do sonikacji. Warunki sonikacji powinny być dostosowane tak, aby osiągnąć wzbogacenie w odpowiednie rozmiary DNA. Na rysunku 3 przedstawiono przykład optymalizacji fragmentacji chromatyny.</li>
	<li>Wirować roztwór raz w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant przez pipetowanie do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę. Pobrać 1/10 supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, oznaczyć ją jako Wejście i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć chromatynę 10x buforem rozcieńczającym ChIP w celu rozcieńczenia SDS do końcowego stężenia 0,1%. 
	Uwaga: Próbki można zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja białka będącego przedmiotem zainteresowania i ratowanie DNA (1 dzień, 3 godziny)
<ol>
	<li>Przemyć kulki pokryte Ab z kroku 2.4 trzykrotnie 1 ml buforu rozcieńczającego ChIP w celu usunięcia nadmiaru przeciwciała, jak opisano w kroku 2.2. Zawiesić w 200 μl buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać 50 μl wyizolowanej chromatyny. Inkubować O/N na obracającym się kole w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Sprawdź stężenie chromatyny w mikroobjętościowym spektrofotometrze UV-Vis. 50 μl wyizolowanej chromatyny powinno zawierać więcej niż 10 μg DNA.</li>
	<li>Dla stopni 4.2-4.5 pracować w 4 °C. Umyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu do płukania o niskiej zawartości soli, jak opisano w kroku 2.2.</li>
	<li>Umyj kulki raz w 1 ml buforu do prania o wysokiej zawartości soli.</li>
	<li>Umyj kulki raz w 1 ml buforu myjącego LiCl.</li>
	<li>Umyj kulki dwukrotnie w 1 ml buforu TE. Po ostatnim praniu należy upewnić się, że bufor TE pozostawiony w probówce został całkowicie usunięty przez zassanie pipetą.</li>
	<li>Wyjmij próbki INPUT (krok 3.9). Przenieść 5 μl INPUT do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i kontynuować tak jak w przypadku próbek ChIP. Odwrotne sieciowanie poprzez dodanie 200 μl 5% chelatującej żywicy jonowymiennej i inkubację przez 10 minut w temperaturze 95 °C, wytrząsając co 2-3 minuty. Wirować w temperaturze 16 000 x g przez 30 sekund i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, pipetując. 
	UWAGA: Podczas gdy tradycyjna metoda odwrócenia sieciowania obejmuje inkubację O/N z NaCl, inkubacja z chelatującą żywicą jonową w temperaturze 95 °C pozwala na skuteczne sieciowanie i elucję DNA w ciągu 10 minut, dzięki czemu protokół jest o jeden dzień krótszy</li>.
	<li>Dodać 2 μl proteinazy K (10 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu strawienia białek i uwolnienia DNA.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Szybko wirować z prędkością 16 000 x g przez 30 sekund i przenieść supernatant do nowej probówki metodą pipetowania.</li>
	<li>Wyczyść wyizolowane DNA za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania fragmentów DNA. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przenieś kolumnę wiążącą DNA z zestawu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Eluować oczyszczone DNA, dodając 20 μl wody wolnej od DNaz do środka kolumny i wirując z prędkością 16 000 x g przez 60 sekund. Punkt zatrzymania: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
5. Pomiar obfitości miejsc wiązania w immunologicznie wytrąconym DNA za pomocą qPCR (4 godz.)
UWAGA: DNA wyizolowane z wytrąconej chromatyny musi być analizowane w celu określenia, które fragmenty DNA zostały ChIP z całkowitej chromatyny, ze względu na jego wiązanie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery dla interesujących regionów genomu o temperaturze topnienia (Tm) 60 °C i zawartości GC 30%-80%. Ponieważ chromatyna ulega fragmentacji w procesie sonikacji, długość amplifikowanej sekwencji nie powinna być dłuższa niż 150-200 nukleotydów (Tabela 1). 
	UWAGA: Przydatnym narzędziem do projektowania podkładów jest program Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Dodatkowe wytyczne dotyczące projektowania podkładów są dostępne w poprzednich raportach 8,14,15.</li>
	<li>Użyj programu BLAST, aby upewnić się, że startery są specyficzne (zwłaszcza promotory mogą mieć podobne sekwencje wiążące TF) i przetestuj skuteczność startera za pomocą rozcieńczeń 1:10 w wodzie wejściowego DNA (krok 4.9). Niektóre regiony genomu zostaną oczyszczone lepiej niż inne. Dlatego ważne jest, aby zaprojektować startery PCR i sprawdzić je na rozcieńczonym wejściowym DNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć oczyszczony DNA w stosunku 1:10 wodą i odpipetować 5 μl rozcieńczonego DNA w probówce PCR dla każdej reakcji. 
	UWAGA: Rozcieńczyć tylko potrzebną ilość, ponieważ DNA może przyczepić się do ścianek probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wielokrotne cykle rozmrażania i zamrażania zwiększają liczbę przyłączonych cząsteczek DNA. Dla każdej pary starterów należy przeanalizować wzmocnienie na wejściu, Ab-ChIP i No-Ab ChIP.</li>
	<li>Aby uzupełnić mieszaninę PCR, dodaj mieszankę główną Sybr Green PCR do końcowego stężenia 1x i 0,5 μM każdego startera. Napełnij do 20 μl wodą wolną od DNaz.</li>
	<li>Reakcję qPCR należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta mieszanki wzorcowej Sybr Green PCR.</li>
</ol>
6. Analiza danych
UWAGA: Spośród istniejących sposobów analizy danych ChIP, najczęściej używane są dwa. Pierwszą z nich jest metoda wzbogacania fałdowego, nazywana również "wzbogaceniem względnym", "sygnałem na tle" lub "względem kontroli bez przeciwciał". Druga metoda nosi nazwę "% danych wejściowych".
<ol>
	<li>Analiza danych metodą wzbogacania fałd.
	<ol>
		<li>Utwórz arkusz kalkulacyjny z nazwami próbek i surowymi wartościami Ct, które zostały uzyskane po reakcji qPCR.</li>
		<li>Dla każdej próbki należy odjąć od jej surowej wartości Ct wartość surowego Ct uzyskaną dla odpowiedniej kontroli No-Ab. UWAGA: Po tej operacji matematycznej wartość Ct dla próbki No-Ab będzie równa 0.</li>
		<li>Obliczać wzbogacanie krotne przez operację potęgowania o podstawie 2 i wykładniku (potęga) równym ujemnej reszcie uzyskanej w kroku 6.1.2 (tabela 2). 
		wzbogacenie fałdy = 2 - (Ct(próbka) - Ct(No-Ab)) 
		UWAGA: W tej metodzie liczebność określonego fragmentu DNA w próbce ChIP-ed jest porównywana z obfitością tego fragmentu w kontroli No-Ab. Założeniem tej metody jest to, że poziom sygnału tła jest odtwarzalny między różnymi zestawami starterów, próbkami i powtórzonymi eksperymentami. Jednak te poziomy sygnału "szumu" różnią się między zestawami starterów, próbkami i eksperymentami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych metodą % danych wejściowych.
	<ol>
		<li>Utwórz arkusz kalkulacyjny z nazwami próbek i surowymi wartościami Ct, które zostały dla nich uzyskane po reakcji qPCR.</li>
		<li>Dostosuj surowe wartości Ct dla próbek wejściowych, odejmując wartość logarytmu o podstawie 2 od frakcji całkowitej wyekstrahowanej chromatyny, która została przyjęta jako dane wejściowe. 
		UWAGA: W tym protokole odjęta wartość wynosi 3,32, ponieważ 10% całkowitej chromatyny zostało przyjęte jako dane wejściowe w tym protokole. Log2(10) równa się 3,32.</li>
		<li>Obliczyć % danych wejściowych, mnożąc przez 100 wartość operacji potęgowania o podstawie 2 i wykładniku (potędze) równą pozostałości skorygowanych wartości wejściowych odjętych od surowych wartości Ct próbki (tabela 3). 
		% danych wejściowych = 100*2 (skorygowane wejście – Ct(próbka)) 
		UWAGA: W tej procedurze oblicza się zależność między określoną obfitością DNA w próbce ChIP-ed a całkowitą izolowaną chromatyną (próbką wejściową). Więcej szczegółów na temat analizy danych ChIP można znaleźć w Haring et al.Rozdział 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li>
<li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+flowering+by+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li>
<li>Jarillo, J. A., Piñeiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li>
<li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%28r%29evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction%3A+a+two-decade+history%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li>
<li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+regulation+of+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li>
<li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li>
<li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+%28ChIP-SEQ%29+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+%28ChIP-CHIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li>
<li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((early+bolting+in+short+days%3A+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li>
<li>Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li>
<li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li>
<li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li>
<li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).</li>
<li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3%3A+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół ChIP jest powtarzalną i potężną techniką analizy interakcji między białkami i określonymi sekwencjami DNA in vivo u roślin Arabidopsis. Skuteczna identyfikacja miejsc wiązania białek będących przedmiotem zainteresowania wymaga odpowiedniego doboru organów roślinnych lub etapów rozwoju, w których faktycznie zachodzą odpowiednie interakcje. Ponadto bardzo ważne jest uzyskanie odpowiedniego utrwalenia materiału roślinnego i optymalnego ścinania chromatyny za pomocą sonikacji. Niezbędne są rów...

W ostatnich latach rozwinięto szeroki zakres narzędzi genetycznych, molekularnych i genomicznych w gatunku modelowym Arabidopsis thaliana. Technologia ta ogromnie ułatwiła postęp w zrozumieniu, w jaki sposób regulowany jest rozwój roślin. Wśród procesów rozwojowych badanych przy użyciu rzodkiewnika jako modelu, szeroko analizowano genetyczną kontrolę czasu kwitnienia. Badania te wykazały, że rośliny bardzo precyzyjnie modulują czas kwitnienia w odpowiedzi na endogenne sygnały, takie jak hormony i wiek rośliny, a także na sygnały środowiskowe, takie jak fotoperiod i temperatura, które synchronizują czas kwitnienia z naturalnym cyklem pórroku 1,2. Izolacja i charakterystyka mutantów Arabidopsis ze zmianami w czasie kwitnienia była determinantem w odkryciu złożonej sieci genów, które regulują czas kwitnienia w odpowiedzi na czynniki endogenne i środowiskowe. Te obwody genetyczne są zintegrowane na poziomie kilku głównych genów, które działają jak przełączniki kwitnienia, a dokładny czas inicjacji kwiatowej zależy od równowagi działań promujących i tłumiących kwitnienie, które działają przed genami integratora kwiatów1,3.
Funkcjonalna charakterystyka genów zidentyfikowanych ze względu na ich rolę w kontroli inicjacji kwitnienia, wspomagana przez niedawne zastosowanie metod genomicznych, ujawniła centralną rolę regulacji transkrypcji w modulacji czasu kwitnienia. W rzeczywistości wiele głównych genów kwitnienia koduje czynniki transkrypcyjne4. Ponadto szereg kompleksów białkowych przebudowujących chromatynę wpływa na ekspresję głównych genów kwitnienia. Okazało się, że pewna liczba mutantów rzodkiewnika wyizolowanych ze względu na ich zmieniony czas kwitnienia jest nosicielami mutacji w genach kodujących różne modyfikatory chromatyny. Różne remodelery chromatyny, które wprowadzają modyfikacje potranslacyjne w ogonach histonów, repozycję nukleosomów względem DNA lub wymianę histonów kanonicznych na warianty histonów, są niezbędne do prawidłowej regulacji kwitnienia u Arabidopsis5,6. Niektóre z tych działań przebudowy chromatyny katalizują osadzanie się lub usuwanie modyfikacji kowalencyjnych, takich jak acetylacja lub metylacja w określonych resztach histonów. Te znaczniki histonowe są specyficznie rozpoznawane przez wyspecjalizowane efektory, które rekrutują inne kompleksy przebudowujące chromatynę, czynniki transkrypcyjne lub składniki maszynerii transkrypcyjnej w celu regulacji aktywności transkrypcyjnej genów kwitnienia.
ImmunoPrecypitacja chromatyny (ChIP) pozwala na identyfikację in vivo miejsc wiązania DNA dla interesujących białek (Rysunek 1). Procedura ta wykorzystuje zdolność niektórych substancji chemicznych do sieciowania białek z DNA. Powstałe kompleksy DNA-białko można następnie immunoprecypitować za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko czynnikom transkrypcyjnym, białkom wiążącym chromatynę lub określonym modyfikacjom i heterologicznym epitopom (powszechnie określanym jako "znaczniki") przyłączonym do wybranego białka. DNA oczyszczone z tych immunoprecypitatów może być wykorzystane jako matryca w ilościowych reakcjach PCR (qPCR) w celu oceny wzbogacenia określonych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania. W ten sposób można ustalić miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych lub rozmieszczenie znaczników histonowych w poszczególnych genach7,8. Ponadto, w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), które umożliwia masowe sekwencjonowanie równoległe, technologia ChIP umożliwiła identyfikację miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie, a także odsłonięcie epigenomicznego krajobrazu modyfikacji histonów. Co więcej, jednoczesna analiza ekspresji genów pozwala na monitorowanie, w jaki sposób wiązanie regulatorów transkrypcji lub odkładanie się poszczególnych znaczników histonów koreluje z aktywnością transkrypcyjną genów9.
Użycie protokołów ChIP u Arabidopsis pozwoliło ocenić wpływ różnych regulatorów transkrypcji na organizację chromatyny głównych genów kwitnienia i jak te zmiany strukturalne wpływają na ekspresję genów5,6. Poprzednie wyniki wykazały, że locus Arabidopsis EARLY BOLTING IN SHORT DAYS (EBS) działa jako represor kwitnienia, a mutanty w tym genie wykazują przyspieszenie kwitnienia i regulację w górę głównego genu kwitnienia FT. Ponadto, mutacje powodujące utratę funkcji w FT całkowicie hamują fenotyp wczesnego kwitnienia roślin z mutacją ebs, co wskazuje, że FT jest wymagany do przedwczesnego kwitnienia mutantów ebs i że EBS jest niezbędny do tłumienia tego głównego genu kwitnienia10,11. EBS koduje białko zawierające PHD, które może specyficznie wiązać histon H3 di- i trimetylowany w reszcie lizyny 4 (H3K4me2/3), co sugeruje rolę EBS w represji FT12 za pośrednictwem chromatyny. Zastosowanie podejścia ChIP wykazało, że białko EBS10,11 zawierające rzodkiewnik zawiera PHD, wiąże regiony regulatorowe genu integratora kwiatów FT w celu stłumienia jego ekspresji12. Dodatkowe dane uzyskane dzięki zastosowaniu technologii ChIP wykazały, że białko to jest niezbędne do utrzymania niskiego poziomu acetylacji histonów, cechy charakterystycznej aktywnej transkrypcji, w chromatynie tego głównego genu kwitnienia w początkowych stadiach rozwoju rzodkiewnika. Obserwacje te, wraz z danymi genetycznymi i danymi dotyczącymi ekspresji genów, pokazują, że to białko zawierające rzodkiewnik odgrywa kluczową rolę w precyzyjnym dostrojeniu czasu kwitnienia poprzez modulację ekspresji genu integratora kwiatów FT12. Przedstawione tutaj prace zapewniają zoptymalizowaną metodę przydatną nie tylko do analizy histonów, ale także do innych białek związanych z chromatyną, ze zwiększoną wydajnością i skróconym czasem eksperymentu. Co więcej, raport ten ilustruje, w jaki sposób zastosowanie protokołów ChIP dostarczyło nowych informacji na temat związku między zmianami w modyfikacjach chromatyny a stanami transkrypcyjnymi genów roślinnych oraz jak te mechanizmy kontroli ekspresji genów, w których pośredniczą chromatyna, wpływają na początek kwitnienia rzodkiewnika.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (mieszanina soli bazalnej Murashige i Skoog)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Stosować pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Mieszanka inhibitorów proteazy cOmplete ULTRA Tabletki, Mini, bez EDTA, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td> Bioruptor Standardowe urządzenie do sonikacji Diagenode B01010002 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>(UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Dynabeads sprzężone z białkiem A lub białkiem G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Sprawdź producenta" s instrukcja powinowactwa przeciwciał</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution Life</td><td>Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr> <tr><td>(mysz, szczur, królik i hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny - Przeciwciało poliklonalne DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Chelex 100</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Myc Tag, klon 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-dna arabidopsis in vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Skomplikowane sieci regulacji genów koordynują procesy biologiczne i przemiany rozwojowe w roślinach. Selektywna aktywacja transkrypcyjna i wyciszanie genów pośredniczą w odpowiedzi roślin na sygnały środowiskowe i sygnały rozwojowe. Dlatego wgląd w mechanizmy kontrolujące ekspresję genów roślin jest niezbędny do dogłębnego zrozumienia, w jaki sposób procesy biologiczne są regulowane w roślinach. Opisana tutaj technika immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) jest procedurą mającą na celu identyfikację miejsc wiązania DNA białek w genach lub regionach genomu modelowego gatunku Arabidopsis thaliana. Interakcje z DNA białek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak czynniki transkrypcyjne, białka chromatyny lub potranslacyjnie zmodyfikowane wersje histonów, mogą być skutecznie analizowane za pomocą protokołu ChIP. Metoda ta opiera się na utrwalaniu interakcji białko-DNA in vivo, losowej fragmentacji chromatyny, immunoprecypitacji kompleksów białko-DNA ze specyficznymi przeciwciałami oraz kwantyfikacji DNA związanego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą technik PCR. Zastosowanie tej metodologii w przypadku rzodkiewnika znacząco przyczyniło się do odkrycia transkrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych, które kontrolują różnorodne procesy biologiczne roślin. Podejście to pozwoliło na zidentyfikowanie miejsc wiązania białka chromatyny EBS Arabidopsis z regionami regulatorowymi głównego genu FT podczas kwitnienia. Wpływ tego białka na akumulację określonych znaczników histonowych w regionie genomowym FT został również ujawniony poprzez analizę ChIP.

W tym protokole ChIP służącym do identyfikacji oddziaływań białko-DNA in vivo można wyróżnić osiem głównych etapów, obejmujących hodowlę i zbiór materiału roślinnego, sieciowanie chromatyny, izolację chromatyny, fragmentację chromatyny, selektywną izolację kompleksów DNA i badanego białka poprzez immunoprecypitację, trawienie białek, puryfikację DNA oraz analizę qPCR (Rysunek 1). Kluczowym etapem protokołu ChIP jest utrwalenie oddziaływań DNA-białko w reakcji sieciowania. W ChIP roślin stosuje s...

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Ogólnym celem tej procedury jest ujawnienie oddziaływań między białkami a DNA w chromatynie komórek arabidopsis. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak to, które geny są regulowane przez dany czynnik transkrypcyjny lub jakie modyfikacje systemowe są powiązane ze stanem transkrypcyjnym genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki etapowi sieciowania możliwe jest utrwalenie i uchwycenie zmian w organizacji chromatyny zachodzących podczas rozwoju rośliny.Chociaż metoda ta pozwala na wgląd w oddziaływania białek u Arabidopsis thaliana, można ją również zastosować w odniesieniu do różnych rzędów roślin oraz dostosować do innych gatunków roślin. Procedurę tę zaprezentują Dorota Komar i Alfonso Mouriz, dwaj doktoranci w naszym laboratorium. Po wyhodowaniu Arabidopsis zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać 1,5 grama materiału roślinnego do probówek o pojemności 50 mililitrów i przechowywać je w lodzie podczas procesu sieciowania.Następnie, za pomocą igły podgrzanej w palniku laboratoryjnym, wykonaj niewielkie otwory w zakrętkach probówek. Do probówek dodaj 40 ml 1x pbs oraz 1,08 ml formaldehydu. Zakręć probówki i umieść je w eksykatorem.Infiltruj próżniowo przez 10 minut, a następnie ostrożnie zwolnij próżnię, aby zapobiec wzburzeniu roztworu. Po wymieszaniu próbki powtórz etapy próżniowania i mieszania. Po infiltracji zaobserwuj materiał roślinny i potwierdź, że stał się lekko półprzezroczysty i opadł na dno probówki.Dodaj 2,5 mililitrów glicyny o stężeniu dwóch molarnym do uzyskania stężenia końcowego 0,125 molarnego i zastosuj próżnię przez pięć minut. Po zwolnieniu próżni usuń roztwór, odwracając probówki i pozwalając mu wyciec przez otwory w nakrętkach. Przemyj siewki roślin dwukrotnie za pomocą pbs, a następnie raz wodą.Następnie osuszyć sadzonki na ręczniku papierowym przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Dla każdej immunoprecypitacji przygotować 15 µL kulek magnetycznych w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Do kulek dodać 1 ml buforu do rozcieńczeń w immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), wymieszać przez rotację i umieścić probówkę 1,5 ml w statywie magnetycznym.Po pozostawieniu kulek na magnesie przez około minutę, należy użyć Pipetmana do usunięcia supernatantu przed powtórzeniem płukania. Kulek należy ponownie zawiesić w 200 µl buforu rozcieńczającego do chipów. W przypadku immunoprecypitacji dodaje się wymaganą ilość specyficznego przeciwciała do jednej z dwóch probówek przygotowanych dla każdej ślepej próby roślinnej.Kluczowym czynnikiem w udanym eksperymencie ChIP jest dobór przeciwciała do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przeciwciała wytworzone przeciwko roślinnym czynnikom transkrypcyjnym mogą być użyteczne w eksperymentach ChIP, jednak serum musi zostać poddane dokładnym testom. Na przykład przeciwciała zweryfikowane wyłącznie w analizie Western blot niekoniecznie nadają się do zastosowania w technice ChIP.Jako kontrolę negatywną, dodaj taką samą ilość nieswoistego IGG do drugiej probówki. Inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na rotatorze, aby umożliwić przyłączenie przeciwciała do kulek. Używając moździerza i tłuczka, dokładnie utrzyj zamrożony materiał roślinny w ciekłym azocie, aż proszek stanie się jednorodny i jasnozielony.Przenieś proszek do nowej probówki o pojemności 50 ml. Pod wyciągiem dodaj 30 ml buforu do ekstrakcji nr 1 i wymieszaj dokładnie, aby nasączyć proszek tkankowy. Od tego momentu próbki należy przez cały czas przechowywać w temperaturze 4 °C i upewnić się, że tkanka jest całkowicie rozmrożona przed przejściem do kolejnego etapu.Oczyść zawiesinę, przepuszczając ją przez tkaninę filtracyjną o rozmiarze porów od 22 do 25 µm do nowej probówki o pojemności 50 mL. Następnie odwiruj w wiroworce przy 1 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Ostrożnie odlej nadsącz z osadu, którego objętość powinna wynosić około dwóch mililitrów.Osad ponownie zawiesić w 5 ml buforu do ekstrakcji dwa. Następnie odwirować przy 1 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Po odlaniu nadsączu osad ponownie zawiesić w 300 µl buforu do ekstrakcji trzy.Do oddzielnej probówki dodaj 600 µl buforu do ekstrakcji trzy, a następnie ostrożnie nałóż zawiesinę osadu na powierzchnię czystego buforu. Wirowkę ustaw na jedną godzinę przy 16 000 ×g w temperaturze 4 °C, po czym odessij nadsącz za pomocą pipety. Następnie użyj 300 µl buforu do sonikacji, aby powoli resuspender osad jądrowy, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, które mogą wpłynąć na wydajność sonikacji.Ostrożnie przenieś zawiesinę do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Poddaj zawiesinę sonikacji w celu lizy jąder i losowego rozbicia chromatyny na fragmenty o długości od 200 do 600 par zasad. Zweryfikuj rozmiary fragmentów DNA na żelu agarozowym, a następnie odwiruj roztwór przy 12 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, a pellet odrzuć. Alikwotuj jedną dziesiątą supernatantu do nowej probówki i oznacz ją jako „input” przed zamrożeniem w temperaturze -20 °C. Na koniec wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie chromatyny w buforze do rozcieńczania ChIP, aby uzyskać końcowe stężenie SDS wynoszące 0,1%.Próbki można następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -20°C przez kilka tygodni. Po inkubacji kulek z przeciwciałami przez noc, należy użyć 1 ml buforu do rozcieńczania na chipie, aby trzykrotnie wypłukać kulki, a następnie ponownie zawiesić kulki w 1 ml rozcieńczonej chromatyny i inkubować probówkę przez noc na rotatorze w temperaturze 4°C. Następnego dnia kulki należy umieścić na statywie magnetycznym w temperaturze 4°C, a po usunięciu roztworu użyć 1 ml niskosolnego buforu do płukania, aby dwukrotnie wypłukać kulki, a następnie raz wypłukać kulki wysokosolnym buforem do płukania.Po jednorazowym przemyciu kulek za pomocą 1 ml buforu piorącego z chlorkiem litu, przemyj kulki dwukrotnie, używając 1 ml buforu TE. Odsakuj ciecz, aby dokładnie usunąć bufor piorący TE. Po rozmrożeniu próbek wejściowych przenieś 5 µL każdej z nich do nowych probówek o pojemności 1,5 ml; następnie traktuj je w ten sam sposób, co próbki z chipa.Odwróć sieciowanie, dodając 200 µL pięcioprocentowej chelatującej żywicy wymiany jonowej, a następnie inkubuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut, potrząsając co dwie do trzech minut. Odwiruj przy 16 000 ×g przez 30 sekund i ostrożnie przenieś nadsącz do nowych probówek do wirówek. Dodaj 2 µL proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby strawić białka i uwolnić DNA.Aby zatrzymać reakcję, inkubuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut, szybko wiruj przy 16 000 ×g przez 30 sekund i przenieś supernatant do nowej probówki. Po oczyszczeniu DNA zgodnie z protokołem tekstowym, rozcieńcz próbkę w stosunku 1:10 wodą i użyj 5 µL na reakcję, aby zmierzyć liczebność miejsc wiązania za pomocą qPCR. Przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.Liście Arabidopsis są pokryte warstwami wosku, a trichomy sprzyjają powstawaniu pęcherzyków powietrza; oba te czynniki utrudniają przenikanie odczynników sieciujących do tkanki roślinnej. Przedstawione tutaj próbki siewek zostały poddane sieciowaniu w próżni w celu zwiększenia wydajności fiksacji. Rysunek ten pokazuje, że zwiększenie liczby cykli sonikacji stopniowo zmniejsza średnią wielkość DNA w próbkach na chipie, osiągając optymalne wzbogacenie w zakresie od 200 do 600 par zasad po 20 do 30 cyklach, co tutaj zademonstrowano.Jak widać na tej ilustracji, do analizy wybrano cztery regiony istotne dla regulacji transkrypcyjnej locus FT, głównego genu kwitnienia. Wyniki Chip wykazują, że białko EBS związało się z jednym z czterech badanych regionów – sekwencją regulacyjną znajdującą się w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji FT. Wreszcie, analizy chip przeprowadzone z użyciem przeciwciała skierowanego przeciwko histonie h3 acetylowanej w lizynach dziewiątej i czternastej, co koreluje z transkrypcyjnie aktywną chromatyną, ujawniły wyższą zawartość H3K9/14ac w mutantach DBS w porównaniu do roślin typu dzikiego we wszystkich czterech badanych fragmentach genomowych FT, co jest zgodne z obserwowaną nadekspresją tego głównego genu kwitnienia u tego mutanta. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu dwóch dni.Przeprowadzenie tej procedury, wraz z innymi działaniami, takimi jak analiza ekspresji genów, może pomóc w odpowiedzi na inne pytania, takie jak: Jaka jest biologiczna rola wiązania białka z DNA? Czy wiąże się ono z aktywacją, czy represją transkrypcyjną? I jakie modyfikacje histonów z tym współistnieją?Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie epigenetyki roślin do badania stanów chromatyny w naszych komórkach redukcyjnych. Można go również zastosować w odniesieniu do innych gatunków roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak analizować wiązanie wybranego białka Arabidopsis z DNA in vivo.Należy pamiętać, że praca z 2-metoksyetanolem, formaldehydem lub odczynnikami do sonikacji, patogenami oraz mutacjami macierzystymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas stosowania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak odzież ochronna, rękawice lub ochrona słuchu.

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Ten film opisuje protokół testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), który jest klasyczną techniką demonstracji interakcji białko-DNA. Technika ta służy do identyfikacji docelowych genów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej.

Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Poznaj test immunoprecypitacji chromatyny ChIP do badania interakcji białko-DNA in vivo u Arabidopsis. Ta metoda pozwala identyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i regulację genów.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Przeglądaj więcej filmów