Name: Izolacja mysich fibroblastów skórnych za pomocą FACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Naucz się izolować fibroblasty skórne myszy metodą FACS bez hodowli in vitro. Technika zachowuje natywny fenotyp komórek i umożliwia badanie podtypów fibroblastów odpowiedzialnych za bliznowacenie i fibrozę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo wspierana przez grant z NIH grant R01 GM087609 (dla H.P.L.), prezent od Ingrid Lai i Billa Shu na cześć Anthony'ego Shu (dla H.P.L.), grant NIH U01 HL099776 (dla M.T.L.), Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine i The Oak Foundation (dla M.T.L., G.C.G. i H.P.L.). G.G.W. był wspierany przez Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program oraz grant szkoleniowy NIGMS GM07365. Projekt Z.N.M. był wspierany przez Plastic Surgery Foundation Research Fellowship Grant oraz Hagey Family Fund. MSH był wspierany przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159, American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award oraz Transplant and Tissue Engineering Fellowship Award.

Ten protokół jest zgodny z metodami zatwierdzonymi przez Panel Administracyjny Uniwersytetu Stanforda ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.
1. Trawienie mysiej skóry właściwej
<ol>
	<li>Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy 100 mg/kg + ksylazyny 20 mg/kg + acepromazyny 3 mg/kg. 
	Uwaga: Można używać różnych grup wiekowych i środowisk.</li>
	<li>Ogol i wypiluj skórę grzbietową. Około 100 000 komórek można wyizolować z kawałka skóry grzbietowej o wymiarach 60 mm x 100 mm.</li>
	<li>Zanurz mysz w 70% etanolu i umieść na czystej, sterylnej powierzchni do wyschnięcia.</li>
	<li>Natychmiast zbierz grzbietową skórę myszy za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. U samic myszy należy unikać włączania tkanki sutkowej.</li>
	<li>Zaczynając od podstawy ogona, użyj kleszczy, aby zwinąć skórę i wykonać poprzeczne cięcie przed rozcięciem wzdłuż płaszczyzny nado-powięziowej.</li>
	<li>Ostrożnie unikaj dodawania tłuszczu podskórnego podczas pobierania skóry. Zbadaj zebraną skórę pod kątem podskórnego tłuszczu i ostrożnie zeskrob ją krawędzią skalpela.</li>
	<li>Pobraną skórę opłukać w betadynie, a następnie przemyć 5 razy PBS na lodzie. 
	Uwaga: Ważne jest, aby skóra była jak najbardziej sterylna, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zmielić skórę za pomocą żyletek i nożyczek do preparowania w sterylnym naczyniu, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy 2-3 mm.</li>
	<li>Przygotować 50 ml stożkowych probówek zawierających 20 ml kolagenazy dożylnej o stężeniu 1 mg/ml w DMEM. Podziel skórę właściwą na probówki na podstawie pięciu myszy w probówce.</li>
	<li>Próbki należy energicznie mieszać podczas inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w łaźni wodnej lub w piecu.</li>
	<li>Wyjąć próbki z inkubatora i przepuścić przez strzykawkę o pojemności 10 ml bez igły 3-5 razy w sterylnym kapturze.</li>
	<li>Umieścić próbki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i energicznie wstrząsać przez kolejne 30 minut.</li>
	<li>W sterylnym kapturze pipetować próbki w górę i w dół 3-5 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pobrać pipetę próbki przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepuść 20 ml 10% FBS DMEM przez ten sam filtr, aby zmaksymalizować wydajność komórek i doprowadzić całkowitą objętość do 40 ml. Wirować przy 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety, zwracając szczególną uwagę, aby najpierw usunąć górną warstwę tłuszczu przed pozostawieniem supernatantu. 
	Uwaga: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia adipocytów.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki w 20 ml 10% FBS DMEM.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórki/DMEM przez filtr 70 μm.</li>
	<li>Przepłukać filtr 10 ml 10% FBS DMEM i odwirować przefiltrowaną zawiesinę o sile 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad za pomocą sterylnej szklanej pipety, ponownie uważając, aby najpierw usunąć pozostałą warstwę tłuszczu.</li>
	<li>W przypadku znacznego zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi (osad jest widocznie czerwony), należy ponownie zawiesić granulki w 20 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie należy przejść do kroku 24.</li>
	<li>Dodać równą objętość (20 ml) buforu FACS (PBS, 10% FBS, 0,1% azydku sodu), następnie wymieszać i odłożyć na bok 5 ml podwielokrotności jako niebarwioną kontrolę. Pozostałą próbkę odwirować w temperaturze 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i umieścić osad na lodzie. Komórki mogą zostać zamrożone w tym momencie, jeśli czas FACS nie jest dostępny.</li>
</ol>
2. Izolacja fibroblastów przez FACS
<ol>
	<li>Przygotuj 500 μl mieszanki do inkubacji przeciwciał linii produkcyjnej dla każdej osadki. W tym celu należy najpierw dodać 475 μl buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg / ml) do probówki, a następnie dodać sprzężone z fluoroforem CD31 (1:100), CD45 (1:200), Tie2 (1:50), Ter-119 (1:200) i EpCAM (1:100) przeciwciała, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie dla każdego przeciwciała.</li>
	<li>Ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 μl mieszanki do inkubacji przeciwciał linii prostej i inkubować tę zawiesinę na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg/ml) do próbki i delikatnie wymieszać. Wirować przy 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy 5 ml buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg/ml) i odwirować w takich samych warunkach, jak w kroku 26.</li>
	<li>Zawiesić osad w 500 μl buforze FACS zawierającym DNazę (10 μg/ml) i odłożyć 50 μl podwielokrotności jako kontrolę żywotności barwnika.</li>
	<li>Do pozostałej próbki dodać wybrany barwnik żywotności w stężeniu wskazanym dla wybranego barwnika.</li>
	<li>Wykonaj analizę FACS31 i sortowanie pod kątem ogniw Viability Dye-/CD31-/CD45-/Tie2-/Ter-119-/EpCAM- (patrz rysunek 2A). Sortuj bezpośrednio do bufora FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts.+I.+Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease.</a> The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Wilson, M. S., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrosis%3A+pathogenesis%2C+etiology+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation.</a> Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).</li>
<li>Hinz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast%3A+one+function%2C+multiple+origins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast: one function, multiple origins.</a> The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).</li>
<li>Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%3A+force+generation+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement.</a> J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).</li>
<li>Wong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+oral+mucosa+results+in+reduced+scar+formation+as+compared+with+skin%3A+evidence+from+the+red+Duroc+pig+model+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration+%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).</li>
<li>Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+fetal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Adult and fetal wound healing.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).</li>
<li>Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+skin+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fetal skin wound healing.</a> Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors%3A+wounds+that+do+not+heal.+Similarities+between+tumor+stroma+generation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing.</a> The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).</li>
<li>Dumont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+early+dissemination%2C+tumorigenesis%2C+and+metastasis+through+alteration+of+extracellular+matrix+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics.</a> Neoplasia. 15, 249-262 (2013).</li>
<li>Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sentinel+cells+to+inflammatory+culprits%3A+cancer-associated+fibroblasts+in+tumour-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation.</a> The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cancer-stroma+interaction%3A+a+potential+approach+for+pancreatic+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment.</a> Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).</li>
<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity%3A+more+than+skin+deep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).</li>
<li>Cormack, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCormack%2C+DH+%22Ham%27s+Histology%22">Ham's Histology</a>. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+interactions.+Adult+follicle-derived+cell+populations+and+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+clinics%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth.</a> Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+sheath+cells%3A+unsung+participants+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing.</a> Lancet. 358, 1445-1448 (2001).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bilayered+dermal+equivalent+containing+human+papillary+and+reticular+dermal+fibroblasts%3A+use+of+fluorescent+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes.</a> Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).</li>
<li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis%3A+differences+in+growth+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204, 526-527 (1979).</li>
<li>Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+fibroblasts+derived+from+the+papillary+and+reticular+dermis+of+infants+and+adults%3A+growth+kinetics%2C+packing+density+at+confluence+and+surface+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology.</a> Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-matched+papillary+and+reticular+human+dermal+fibroblasts+differ+in+their+release+of+specific+growth+factors%2Fcytokines+and+in+their+interaction+with+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes.</a> Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425(2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
<li>Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+a+Dermal+Lineage+with+Intrinsic+Fibrogenic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature protocols. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Klein, M., Fitzgerald, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+separation+of+intact+epidermal+sheets+from+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin.</a> The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).</li>
<li>Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yThree+blocks+are+not+enough+-+Blocking+of+the+murine+IgG+receptor+FcgammaRIV+is+crucial+for+proper+characterization+of+cells+by+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis.</a> European journal of immunology. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w tym manuskrypcie oferuje sposób izolacji fibroblastów za pomocą sortowania opartego na FACS, w porównaniu z istniejącymi metodami, które albo selekcjonują subpopulację, albo wymagają czasu w hodowli komórkowej przed kolejnymi analizami. Czas potrzebny od pobrania skóry do sortowania fibroblastów wynosi około 6 godzin; Jednak liczba myszy wykorzystanych w zbiorach będzie miała wpływ na te szacunki.
Kilka punktów w protokole wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym z nich jest ogra...

Fibroblasty są często definiowane morfologicznie jako wrzecionowate komórki, które przylegają do plastikowych substratów. Fibroblasty są głównym typem komórek odpowiedzialnych za syntezę i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej w narządach embrionalnych i dorosłych1. Fibroblasty mają zatem kluczowe znaczenie dla rozwoju ssaków i w znacznym stopniu przyczyniają się do rozwoju środowiska zewnątrzkomórkowego, które wpływa na zachowanie sąsiednich typów komórek obecnych w każdej tkance i narządzie.
Fibroblasty są również głównym typem komórek stojącym za różnorodnym zestawem schorzeń, które powodują ogromne obciążenie kliniczne. Patologiczna aktywność fibroblastów upośledza normalne funkcjonowanie tkanek i obejmuje zwłóknienie tkanek i narządów (takich jak płuca i wątroba), bliznowacenie po gojeniu się ran skóry, miażdżycę, twardzinę układową i tworzenie się blaszek miażdżycowych po uszkodzeniu naczyń krwionośnych2-5. W szczególności gojenie się ran, zarówno ostre, jak i przewlekłe, polega na odkładaniu się tkanki bliznowatej, która ani nie przypomina normalnej tkanki, która ją otacza, ani nie funkcjonuje jak nią, i prowadzi do znacznej zachorowalności w różnych stanach patologicznych. Po urazie następuje przejście fibroblastów do miofibroblastów, które następnie wydzielają strukturalne składniki ECM, wywierają parakrynne działanie na sąsiednie typy komórek i przywracają stabilność mechaniczną poprzez odkładanie tkanki bliznowatej6.
W tkankach skórnych występują znaczne różnice w jakości gojenia ran w czasie rozwoju i między miejscami anatomicznymi. W pierwszych dwóch trymestrach życia płód goi się bez blizn; Jednak od trzeciego trymestru i przez cały okres dorosłości ludzie goją się z blizną. Istnieją różnice w gojeniu się ran w zależności od miejsca, a także wieku. Przebudowa ran w jamie ustnej z minimalnym tworzeniem się blizn7,8, podczas gdy odkładanie się tkanki bliznowatej w obrębie ran skórnych jest znaczące9. Utrzymują się kontrowersje dotyczące względnego wpływu środowiska w porównaniu z wewnętrznymi właściwościami miejscowych fibroblastów na wynik gojenia się ran, zarówno w odniesieniu do wieku, jak i lokalizacji10,11. Biorąc pod uwagę znaczące różnice w gojeniu się skóry właściwej jamy ustnej myszy i skóry właściwej oraz wcześniejszej embrionalnej (E15) i późniejszej embrionalnej (E18) skóry właściwej, prawdopodobne jest, że istnieją wewnętrzne różnice w populacjach fibroblastów w określonym wieku rozwojowym i między różnymi miejscami anatomicznymi.
W 1986 roku Harold F. Dvorak stwierdził, że nowotwory to rany, które się niegoją. Dvorak doszedł do wniosku, że guzy zachowują się jak rany w ciele i indukują ich zrąb poprzez aktywację reakcji gospodarza na gojenie się ran. Od tego czasu w licznych badaniach analizowano udział fibroblastów w progresji nowotworów13-15, ale podobnie jak w przypadku gojenia się ran, tożsamość i pochodzenie embrionalne fibroblastów, które przyczyniają się do powstawania przedziału zrębowego raków skóry, nie zostało odpowiednio określone. Odpowiedź na to pytanie ma znaczenie medyczne, biorąc pod uwagę ostatnie badania, które wykazały, że fibroblasty związane z nowotworem są potencjalnie skutecznym celem terapii przeciwnowotworowej16.
Identyfikacja i prospektywne wyizolowanie linii fibroblastów obdarzonych potencjałem fibrogennym in vivo jest niezbędnym krokiem w kierunku skutecznego manipulowania ich reakcją na uraz w szerokim zakresie ostrych i przewlekłych stanów chorobowych. W 1987 roku Cormack wykazał dwie subpopulacje fibroblastów, jedną znajdującą się w brodawkowatej, a drugą w siatkowatej skórze właściwej17,18. Stwierdzono, że trzecia subpopulacja jest związana z mieszkami włosowymi w obszarze brodawki skórnej mieszka włosowego19,20. Podczas hodowli te podtypy fibroblastów wykazują różnice w potencjale wzrostu, morfologii i profilach czynników wzrostu/cytokin21-24.
Do tej pory, badania badające heterogeniczność fibroblastów w dużej mierze nie zdołały odpowiednio scharakteryzować rozwojowej i funkcjonalnej różnorodności wśród fibroblastów in vivo. Jest to częściowo wynikiem polegania na hodowanych populacjach fibroblastów i homogenizującym efekcie hodowli komórkowej lub selekcji pozytywnej na podstawie receptora na własnej powierzchni, który nie ulega ekspresji we wszystkich fibroblastach25. Niedawne badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało głęboki marker powierzchniowy i przesunięcie transkrypcji w hodowanych i niehodowanych fibroblastach izolowanych za pomocą metodologii izolacji opartej na FACS przedstawionej w tym manuskrypcie26.
Następnie zidentyfikowaliśmy specyficzną linię fibroblastów w obrębie mysiej grzbietowej skóry właściwej i ustaliliśmy, że ta linia, zdefiniowana przez embrionalną ekspresję Engrailed-1, jest przede wszystkim odpowiedzialna za odkładanie się tkanki łącznej w skórze grzbietowej. Linia funkcjonuje zarówno podczas ostrych, jak i przewlekłych form zwłóknienia, w tym gojenia się ran, tworzenia zrębu nowotworowego i zwłóknienia wywołanego promieniowaniem27. Charakterystyka odrębnych linii fibroblastów ma kluczowe implikacje dla terapii mających na celu modulowanie zachowań fibrogennych.
Zamiast korzystać z istniejących protokołów, które opierają się na manipulacji in vitro w celu osiągnięcia izolacji komórek28,29, protokół zbioru (Rysunek 1) opisany tutaj pomoże uzyskać pouczające analizy fibroblastów, które dokładniej ujmują fenotyp i zachowanie in vivo.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Kent Scientific INS650916</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Jodine Prep Solution</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (krem do depilacji)</td><td>Church i Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastaza</td><td>Abcam ab95133</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtry</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtry</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtry</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny (barwnik żywotności PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą facs

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasty są głównym typem komórek odpowiedzialnym za wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej i są krytycznym składnikiem wielu narządów i tkanek. Fizjologia i patologia fibroblastów leżą u podstaw spektrum jednostek klinicznych, w tym zwłóknień w wielu narządach, blizn przerostowych po oparzeniach, utraty funkcji serca po niedokrwieniu i tworzeniu się zrębu nowotworowego. Jednak fibroblasty pozostają słabo scharakteryzowanym typem komórek, głównie ze względu na ich nieodłączną niejednorodność. Istniejące metody izolacji fibroblastów wymagają czasu spędzonego w hodowli komórkowej, co ma głęboki wpływ na fenotyp i zachowanie komórek. W związku z tym wiele badań nad biologią fibroblastów opiera się na manipulacji in vitro i nie rejestruje dokładnie zachowania fibroblastów in vivo. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów ze skóry grzbietowej dorosłych myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej, zachowując w ten sposób fizjologiczny profil transkrypcyjny i proteomiczny każdej komórki. Nasza strategia pozwala na wykluczenie linii niemezenchymalnych za pomocą bramki ujemnej linii (Lin-), a nie strategii selekcji pozytywnej, aby uniknąć wstępnej selekcji lub wzbogacenia subpopulacji fibroblastów wyrażających określone markery powierzchniowe i być jak najbardziej inkluzywnym w tym heterogenicznym typie komórek.

Poprawność tej metody (Rycyna 1) została zweryfikowana na kilka sposobów, które można szczegółowo przeanalizować w naszej niedawnej publikacji27. Obejmują one immunocytochemię posortowanych komórek oraz analizę transkrypcyjną pojedynczych komórek i analizę masową świeżo posortowanych komórek. Sortowanie fibroblastów bezpośrednio, zamiast polegania na hodowli, dokładniej oddaje ich fenotyp in vivo. Zastosowanie metody ubytkowej dla linii negatywnych (Rycina 2A) zamiast metody selekcji pozy...

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie fibroblastów za pomocą metody FACS, co pozwala uniknąć hodowli in vitro, która – jak wykazano – powoduje zmiany fenotypowe w tych komórkach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i gojenia ran, takie jak identyfikacja podtypów fibroblastów uczestniczących w bliznowaceniu i włóknieniu. Główną zaletą tej techniki jest uniknięcie eksperymentów in vitro, ponieważ przyleganie do tworzywa sztucznego wpływa na fenotyp fibroblastów.Metoda ta pozwala nie tylko na uzyskanie informacji o fibroblastach skóry właściwej, ale może być również zastosowana w innych układach, takich jak fibroblasty otrzewnej i zrosty w jamie brzusznej. W pierwszej kolejności należy ogolić i poddać depilacji skórę grzbietową wybranej myszy. Następnie mysz należy zanurzyć w 70% etanolu, a potem umieścić zwierzę na czystej, sterylnej powierzchni do wyschnięcia.Następnie, zaczynając od nasady ogona, za pomocą pęsety unieść skórę i wykonać cięcie poprzeczne nożyczkami preparacyjnymi. Następnie przeprowadzić dysekcję wzdłuż płaszczyzny nadpowiezkowej, aby pobrać tkankę grzbietową. Po usunięciu fragmentu skóry o wymiarach 60 by 100 milimetrów, należy za pomocą tępego ostrza skalpela ostrożnie usunąć całą tkankę tłuszczową podskórną.Następnie opłucz pobraną skórę w betadynie, a następnie przemyj pięciokrotnie roztworem PBS w warunkach chłodniczych. Używając żyletki i nożyczek sekcyjnych, posiekaj fragmenty skóry właściwej w sterylnym naczyniu, aż próbki osiągną jednolity rozmiar około 2–3 mm. Następnie przenieś fragmenty tkanek od maksymalnie pięciu myszy do odpowiedniej liczby pojedynczych probówek stożkowych o pojemności 50 ml zawierających 20 ml kolagenazy 4 w DMEM.Wigorystycznie agituje się próbki w temperaturze 37 °C. Po godzinie przenosi się probówki do sterylnego dygestora i przepuszcza zawiesiny tkankowe przez strzykawkę 10 ml bez igły od trzech do pięciu razy. Próbki zwraca się na wytrząsarkę na kolejne 30 minut, po czym ponownie wykonuje się od trzech do pięciu pipetowań za pomocą strzykawki 10 ml.Następnie przefiltruj próbki przez sitko o oczkach 100 µm do nowej probówki o pojemności 50 ml i przemyj siatkę 20 ml DMEM uzupełnionego o FBS, aby całkowita objętość wyniosła 40 ml. Następnie odwiruj komórki i za pomocą sterylnej pipety szklanej odessij górną warstwę tłuszczu. Po usunięciu zanieczyszczeń w postaci tkanki tłuszczowej użyj nowej pipety szklanej, aby usunąć resztę supernatantu, a następnie resuspenduj osad w 20 ml DMEM z dodatkiem FBS.Następnie przefiltruj komórki przez sito o oczkach 75 µm i przepłucz siatkę 10 ml DMEM z dodatkiem FBS. Potem ponownie odwirowuj komórki i usuń tłuszcz oraz nadsącz, tak jak przed chwilą zaprezentowano. Resuspenduj osad w 20 ml buforu FACS, odkładając alykwot 5 ml dla kontroli niebarwionej.Następnie odwiruj pozostałą próbkę, odlej nadsącz i umieść osad na lodzie. Aby wyizolować fibroblasty metodą FACS, resuspenduj osady w 500 µL mieszaniny inkubacyjnej przeciwciał przeciwko liniom komórkowym na lodzie. Po 20 minutach delikatnie wymieszaj komórki z pięcioma mililitrami buforu FACS uzupełnionego o DNazę, a następnie je odwiruj.Przemyj osad w kolejnych pięciu mililitrach DNazy. Następnie resuspenduj komórki w 500 mikrolitrach buforu FACS i DNazy, zachowując 50 mikrolitrów komórek jako alikwot do kontroli barwnika żywotności. Na koniec dodaj barwnik żywotności do pozostałej próbki i posortuj komórki zgodnie ze schematem.Zastosowanie podejścia polegającego na usuwaniu komórek wykazujących markery linii komórkowych (lineage negative depletion) zamiast selekcji pozytywnej pozwala uniknąć wstępnego wybierania konkretnych subpopulacji. Analiza mikrotablic transkryptomicznych wykazuje, że fibroblasty hodowlane izolowane metodami poboru na żywo oraz metodą eksplantacji tkankowej wykazują wysoki stopień podobieństwa na poziomie całego transkryptomu, przy współczynniku korelacji Pearsona wynoszącym 0,92. W porównaniu z nimi, fibroblasty hodowlane znacząco różniły się od niehodowanych fibroblastów pobranych na żywo, co potwierdza wagę analizowania fibroblastów pobranych na żywo w stosunku do fibroblastów hodowlanych.Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii rozwoju i gojenia ran do potwierdzenia heterogeniczności fibroblastów oraz identyfikacji subpopulacji odpowiedzialnych za bliznowacenie i inne formy włóknienia.

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę dysocjacji starzejących się gruczołów łzowych myszy w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne i delikatne traktowanie zachowują integralność komórek, dając wysokiej jakości zawiesiny odpowiednie do izolacji specyficznej dla typu komórki oraz analizy transkryptomicznej zmian związanych ze starzeniem się w populacjach gruczołów łzowych.

Protokół dotyczący dysocjacji pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA oraz izolacji komórek i fibroblastów mioepitelowych z starzejących się gruczołów łzowych i ślinowych

Naucz się izolować fibroblasty skórne myszy metodą FACS bez hodowli in vitro. Technika zachowuje natywny fenotyp komórek i umożliwia badanie podtypów fibroblastów odpowiedzialnych za bliznowacenie i fibrozę.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Przeglądaj więcej filmów