Izolacja mysich fibroblastów skórnych za pomocą FACS

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie fibroblastów za pomocą FACS, a tym samym rezygnacja z hodowli in vitro, która, jak wykazano, powoduje zmianę fenotypową w tych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i gojenia się ran, takie jak identyfikacja podtypów fibroblastów zaangażowanych w bliznowacenie i zwłóknienie. Główną zaletą tej techniki jest to, że unika się eksperymentów in vitro, ponieważ przyleganie do plastiku, męskiego do fenotypu fibroblastu.

Ta metoda może nie tylko zapewnić wgląd w fibroblasty skóry, ale może być również stosowana do innych układów, takich jak fibroblasty otrzewnej i zrosty brzuszne. Zacznij od golenia i depilacji skóry grzbietowej interesującej nas myszy. Następnie zanurz obnażoną mysz w 70% etanolu i umieść zwierzę na czystej, sterylnej powierzchni do wyschnięcia.

Następnie, zaczynając od podstawy ogona, użyj kleszczy, aby namiotować skórę i wykonaj poprzeczne cięcie nożyczkami preparacyjnymi. Następnie wypreparuj wzdłuż płaszczyzny nadpowięziowej, aby pobrać tkankę grzbietową. Po usunięciu kawałka skóry o wymiarach 60 na 100 milimetrów użyj krawędzi skalpela, aby ostrożnie usunąć tłuszcz podskórny.

Następnie opłucz zebraną skórę w betadynie, a następnie wykonaj pięć płukań PBS na lodzie. Za pomocą żyletek i nożyczek preparacyjnych zmiel kawałki skóry właściwej w sterylnym naczyniu, aż próbki będą miały jednolitą wielkość około dwóch do trzech milimetrów. Następnie przenieś fragmenty tkanek z maksymalnie pięciu myszy do odpowiedniej liczby pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 20 mililitrów kolagenazy 4 w dmem.

Energicznie mieszać próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie przenieś probówki do sterylnego kaptura i przepuść krążki tkanek przez niepotrzebną 10-mililitrową strzykawkę trzy do pięciu razy. Umieść próbki z powrotem w wytrząsarce na kolejne 30 minut, a następnie wykonaj kolejne trzy do pięciu pipet za pomocą 10-mililitrowej strzykawki.

Następnie przefiltruj próbki przez sitko o średnicy 100 mikronów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i umyj siatkę 20 mililitrami dmem, uzupełnionymi FBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 40 mililitrów. Następnie odwiruj komórki i użyj sterylnej szklanej pipety, aby zassać górną warstwę tłuszczu. Po usunięciu zanieczyszczających miejsc tłuszczowych należy użyć nowej szklanej pipety, aby usunąć resztę supernatantu i ponownie zawiesić granulki w 20 mililitrach dmem plus FBS.

Teraz przefiltruj komórki przez sitko o grubości 75 mikronów i przepłucz siatkę 10 mililitrami dmem plus FBS. Następnie ponownie odwiruj komórki i usuń tłuszcz i supernatant, jak właśnie pokazano. Ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach buforu FACS, odkładając pięciomililitrową porcję na niezabarwioną kontrolę.

Następnie odwirować pozostałą próbkę, wyrzucić supernatant i umieścić osad na lodzie. Aby wyizolować fibroblasty za pomocą FACS, ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach mieszanki inkubacyjnej przeciwciał liniowych na lodzie. Po 20 minutach delikatnie wymieszaj pięć mililitrów buforu FACS, uzupełnionego DNazą z komórkami i odwiruj je.

Umyj granulki w drugich pięciu mililitrach DNazy. Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu FACS i DNazy, rezerwując 50 mikrolitrów podwielokrotności komórek do kontroli barwnika żywotności. Na koniec dodaj barwnik żywotności do pozostałej próbki i posortuj komórki zgodnie ze schematem.

Stosowanie podejścia opartego na ujemnym uszczupleniu linii zamiast podejścia opartego na selekcji pozytywnej pozwala uniknąć wstępnej selekcji dla określonych subpopulacji. Analiza mikromacierzy transkryptomu typu pull ujawnia, że hodowane fibroblasty wyizolowane za pomocą metodologii żywego zbioru i eksplantacji tkanek mają wysoki stopień podobieństwa na poziomie całego transkryptomu ze współczynnikiem korelacji iloczynu Pearsona wynoszącym 0,92. Dla porównania, hodowane fibroblasty różniły się znacznie od żywych pobranych niehodowanych fibroblastów, co potwierdza znaczenie analizy żywych zebranych fibroblastów w porównaniu z hodowanymi fibroblastami.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową i gojeniem ran, aby potwierdzić heterogeniczność fibroblastów i zidentyfikować subpopulacje odpowiedzialne za bliznowacenie i inne formy zwłóknień.