Name: Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę analizy metabolitów glikokortykosteroidów w kale koniowatych do oceny aktywności nadnerczy. Technika ta pozwala badać długoterminowy stres u koni domowych i dzikich zebr.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Fundusze na produkcję tego rękopisu zostały zapewnione przez Nottingham Trent University. Autorzy pragną podziękować kierowniczce stoczni uniwersyteckiej, Annie Gregory, za wykorzystanie jej koni i udostępnienie próbek kału do wykorzystania w protokole. Podziękowania również dla Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory za korzystanie z ich obiektów.

Oświadczenie etyczne: procedury obejmujące pobieranie próbek w terenie i badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez School of Animal, Rural and Environmental Science (ARES) na Uniwersytecie Trent w Nottingham.
1. Pobieranie próbek kału
UWAGA: Podczas pracy z próbkami kału i metanolem należy nosić rękawice. Jeśli istnieje silne podejrzenie, że zwierzę może cierpieć na chorobę odzwierzęcą, należy również nosić odzież ochronną, taką jak fartuch laboratoryjny.
<ol>
	<li>Zbierz próbki kału tak szybko, jak to możliwe (w ciągu minut do kilku godzin) po wypróżnieniu i umieść je w torbie na próbki. Z każdej wypróżnionej próbki należy pobrać od trzech do pięciu podpróbek o łącznej masie około 10 g. Oznaczyć worek godziną i datą pobrania, indywidualnym identyfikatorem i zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
	<li>Aby zminimalizować błąd, należy zamrozić wszystkie próbki w temperaturze -20 °C do czasu zakończenia badania, a następnie zebrać próbki do analizy jako pojedynczą partię.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja hormonów kałowych
<ol>
	<li>Pozostaw próbki kału do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Upewnij się, że próbki są homogenizowane, ręcznie mieszając każdą próbkę w osobnej torbie na próbki.</li>
	<li>Dla każdej próbki odważyć 0,50 (± 0,003 g) kału na mikrowadze w łódce wagowej, a następnie przenieść kał do szklanej fiolki o pojemności 8 ml. Użyj nowej łódki wagowej dla każdej próbki i wyczyść pęsetę 30% metanolem między każdą próbką.</li>
	<li>Połączyć 0,5 g materiału kałowego z 5 ml 90% metanolu: wodą i wstrząsnąć O/N na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnego ranka należy zagwirować próbkę, a następnie odwirować przez 20 minut przy sile 600 g.</li>
	<li>Zdekantować frakcję metanolu do szklanej rurki o wymiarach 16 x 125mm2 i umieścić na stojaku w łaźni wodnej nastawionej na temperaturę 37 °C. Odparować do sucha za pomocą powietrza w dygestorium. Przepłukać fiolkę ekstrakcyjną i umieścić pozostały granulat kału w worku na odpady kliniczne w celu usunięcia.</li>
	<li>Ponownie zawiesić ekstrakty kałowe w 100%, 1 ml metanolu i przenieść do probówki polipropylenowej o wymiarach 12 x 75mm2. Natychmiast zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
3. Analiza hormonalna
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę za pomocą testu immunoenzymatycznego (EIA) przy użyciu poliklonalnej surowicy kortykosteronu CJM006. 
	UWAGA: Przeprowadzono drugą ocenę oddziaływania na środowisko (surowica przeciw kortyzolowi R4866, ale nie udało się osiągnąć etapu walidacji biochemicznej (patrz punkt 4.1). Surowica poliklonalnego kortykosteronu CJM006 i surowica kortyzolu R4866 oraz odpowiednie HRP są dostarczane przez CJ Munro, Uniwersytet Kalifornijski, Davis, Kalifornia.</li>
	<li>Rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:15 000 w buforze powlekającym (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) za pomocą powtarzalnej pipety i końcówki pipety o pojemności 50 μl, załadować 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania 50 μl/dołek. Przykryć płytkę zgrzewarką do płytek i inkubować O/N w temperaturze 4 °C. Pozostawić dwie studzienki niepokryte, aby reprezentowały dołki niespecyficzne wiążące (NSB).</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem umyć płytki do mikromiareczkowania pięciokrotnie za pomocą automatycznej myjki do mikromiareczkowania (roztwór do mycia; 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).</li>
	<li>Załadować płytki tylko 50 μl na studzienkę dla studni NSB i studzienek "zerowych" [bufor EIA (0,1 M NaPO4, 0,149 M NaCl, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, pH 7,0)], wzorce (kortykosteron, 3,9 - 1000 pg/studzienkę) lub próbki ekstraktu kałowego (odpowiednio rozcieńczone w buforze EIA 1:20, patrz sekcja 4.1). Standardy i zera powinny być uruchamiane odpowiednio w trzech i czterech powtórzeniach. Rozcieńczone próbki ekstraktu kałowego i NSB należy przeprowadzić w dwóch egzemplarzach.</li>
	<li>Następnie należy natychmiast dodać 50 μl/studzienkę koniugatu etykietowej peroksydazychrzanowej ε rozcieńczonego w buforze EIA do proporcji 1:70 000.</li>
	<li>Inkubować płytki do mikromiareczkowania w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć płytki do mikromiareczkowania roztworem do przemywania 5 razy i inkubować płytki w temperaturze pokojowej w ciemności ze 100 μl/basenik substratu RT [0,4 mM sól diamonowa 2,2′-azyno-di-(kwasu 3-etylobenztiazolinosulfonowego), 1,6 mMH2O2, 0,05 M cytrynian, pH 4,0]. Podłoże należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Do odczytu płytek mikromiareczkowych należy użyć spektrohomera o długości fali 405 nm. Inkubację płytek uważa się za zakończoną, gdy gęstość optyczna studzienek zerowych osiągnie 0,8 do 1,0.</li>
	<li>Aby zapewnić powtarzalność, należy użyć kontroli [normy EIA lub próbka biologiczna rozcieńczona w buforze EIA w celu związania na poziomie około 30% (norma EIA), 50% (próbka biologiczna, np. pula ekstraktu z kału konia domowego) i 70% (norma EIA)] w celu wykazania współczynników zmienności wewnątrz i między testami wynoszących odpowiednio < 10% i < 15%.</li>
</ol>
4. Test immunologiczny związany z enzymami: walidacja dla badanego gatunku i płci
<ol>
	<li>Walidacja biochemiczna (równoległość)
	<ol>
		<li>Korzystając z buforu EIA, przeprowadzić seryjne rozcieńczanie na zbiorczym ekstrakcie kałowym, najlepiej pobranym z próbek o podejrzanym wysokim i niskim stężeniu hormonów od kilku osób (zakres: czysty, 1:2 do 1:8192) i uruchomić na EIA zgodnie z opisem w sekcji 3. 
		UWAGA: Uważa się, że równoległość została osiągnięta, gdy seryjne rozcieńczenia ekstraktów kałowych dają krzywą przemieszczenia równoległą do krzywej standardowej, a wyniki regresji liniowej wykazują R2 > 0,90, nachylenie > 0,50 i p < 0,05. Seryjnie rozcieńczony ekstrakt kału, który wiąże około 50% na krzywej standardowej, powinien być uważany za idealne rozcieńczenie do uruchomienia wszystkich ekstraktów kałowych (np. 1:20). W teście nie ma uwzględnienia zakłóceń, gdy wyniki regresji liniowej wykazują R2 > 0,90 i p < 0,05.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja biochemiczna (interferencja)
	<ol>
		<li>Połączyć 200 μl seryjnie rozcieńczonych wzorców (zero, 3,9 do 1000 ng/studzienkę kortykosteronu) z 200 μl odpowiednio rozcieńczonego zbiorczego ekstraktu kałowego [rozcieńczonego przy 50% wiązaniu określonym przez równoległość (1:20)] i uruchomić na OOŚ, jak w sekcji 3. Po przeprowadzeniu analizy OOŚ wykreślić zaobserwowane stężenie pomniejszone o tło (stężenie próbki zerowej) w stosunku do oczekiwanego stężenia. 
		UWAGA: Jeśli dodanie rozcieńczonego ekstraktu kałowego do wzorców nie zmienia znacząco oczekiwanej ilości, a wyniki regresji liniowej dają R2 > 0,90, nachylenie bliskie 1,0 i p < 0,05. Nie osiągnięto żadnej ingerencji w OOŚ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja biologiczna: 
	UWAGA: Wykazanie, że wybrana EIA ma zdolność do pomiaru biologicznie istotnych zmian hormonu będącego przedmiotem zainteresowania [np. wzrost stężenia glikokortykosteroidów po prowokacji farmakologicznej (ACTH jest często licencjonowaną procedurą) lub biologicznej (np. psychologicznej i/lub środowiskowej; bardziej prawdopodobne, że jest to oportunistyczne nieuregulowane zdarzenie)].
	<ol>
		<li>Wybierać, ekstrahować i analizować próbki kału pod kątem stężeń metabolitów glikokortykosteroidów przy użyciu procesu opisanego w sekcjach 1–3 przed i po trudnym zdarzeniu. 
		UWAGA: Trudne wydarzenie będzie zależało od gatunku. Poniżej przedstawiono przykładową metodę dla konia domowego. Wcześniej opublikowano pełne przykłady trudnych wydarzeń dla koni, w tym stosowanie zarządzania9 i procedur hodowlanych16. Znaczny wzrost stężenia metabolitów glikokortykosteroidów po zdarzeniu prowokacyjnym musi być obserwowany i potwierdzony za pomocą analizy statystycznej. Musi to obejmować, w stosownych przypadkach, efekt powtarzanych pomiarów, datę pobrania próbki i dane indywidualne. Walidację biologiczną uznaje się wówczas za osiągniętą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mormède, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+function+as+a+tool+to+evaluate+animal+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare.</a> Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).</li>
<li>Lane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+non-invasive+glucocorticoid+measures+be+used+as+reliable+indicators+of+stress+in+animals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Welfare%22%5BJournal%5D)">Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?</a> Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).</li>
<li>Morgan, K. N., Tromborg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+stress+in+captivity%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Animal+Behaviour+Science%22%5BJournal%5D)">Sources of stress in captivity.</a> Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).</li>
<li>Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+RJ+%22An+introduction+to+behavioural+endocrinology+%283rd+Ed%29%22">An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed)</a>. , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).</li>
<li>Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Do+Glucocorticoids+Influence+Stress+Responses%3F+Integrating+Permissive%2C+Suppressive%2C+Stimulatory%2C+and+Preparative+Actions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).</li>
<li>Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+steroids+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Degradation of steroids in the human gut.</a> Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).</li>
<li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+adrenocortical+activity+in+carnivores+by+fecal+glucocorticoid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis.</a> General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).</li>
<li>Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+causes+increased+concentrations+of+glucocorticoid+metabolites+in+horse+faeces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Equine+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces.</a> Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).</li>
<li>Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domesticated+horses+differ+in+their+behavioural+and+physiological+responses+to+isolated+and+group+housing%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing.</a> Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).</li>
<li>Wielebnowski, N., Watters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+fecal+endocrine+monitoring+to+conservation+and+behaviour+studies+of+wild+mammals%3A+important+considerations+and+preliminary+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+journal+of+ecology+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests.</a> Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).</li>
<li>Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fecal+steroids%3A+guidelines+for+a+practical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).</li>
<li>Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+liquid+and+solid+digesta+retention+in+ruminants%2C+equines+and+rabbits+given+timothy+hay%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay.</a> British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).</li>
<li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+hormones+in+bird+droppings%3A+biological+validations%2C+sampling%2C+extraction%2C+sex+differences+and+the+influence+of+diet+on+hormone+metabolite+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).</li>
<li>Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sex+and+time+of+day+on+metabolism+and+excretion+of+corticosterone+in+urine+and+feces+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice.</a> General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).</li>
<li>Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+corticosterone+metabolites+in+chicken+droppings%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings.</a> British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).</li>
<li>Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+aversive+nature+of+an+animal+management+procedure+using+behavioural+and+physiological+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behaviour%22%5BJournal%5D)">An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures.</a> Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).</li>
<li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+non-invasive+hormone+research+in+uncontrolled%2C+natural+environments%3A+the+problem+with+sex%2C+diet%2C+metabolic+rate+and+the+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual.</a> Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).</li>
<li>Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+stress+in+wildlife%3A+techniques+for+quantifying+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li>
<li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li>
<li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds%3A+the+importance+of+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li>
<li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research%3A+considerations+for+application+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza kortykosteronu w kale zapewnia sposób oceny długoterminowych wzorców aktywności nadnerczy u koni. Nieinwazyjny charakter metody pozwala przezwyciężyć mylący wpływ innych metod pobierania próbek stosowanych do oceny aktywności nadnerczy, w tym analizy śliny i osocza9. Ponadto technika ta ma wyraźną, nieinwazyjną zaletę w przypadku badania koni z wolnego wybiegu.
Istnieje kilka kluczowych punktów do omówienia dotyczących tej metody i jej właściwego stosowania. Kluczowym krokie...

Opisana metoda ma na celu analizę stężeń kortykosteronu w kale koni w celu zapewnienia nieinwazyjnej oceny aktywności nadnerczy. Pomiar aktywności osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA) jest akceptowanym podejściem do badania reakcji na potencjalnie awersyjne sytuacje zarówno u gatunków żyjących w niewoli, jak i domowych. Techniką referencyjną i najczęściej stosowaną metodą jest wykorzystanie osocza krwi1, jednak opracowano alternatywne metody, takie jak analiza kału, w celu przezwyciężenia stresu wywołanego samym pobieraniem próbek krwi i umożliwienia monitorowania gatunków żyjących na wolności.
Podczas sytuacji awersyjnej, fizjologiczna homeostaza zostaje zakłócona. Podwzgórze w mózgu uwalnia hormon uwalniający kortykotropinę (CRH), który działa na przedni płat przysadki mózgowej i stymuluje uwalnianie hormonu adrenokortykotropowego (ACTH). ACTH dostaje się do krwiobiegu i stymuluje korę nadnerczy do wydzielania specyficznych dla gatunku glikokortykosteroidów (GC). Glikokortykosteroidy są ściśle związane ze stresującymi wydarzeniami, a nie są konsekwentnie wytwarzane we wszystkich stanach podwyższonej energii, dlatego często mierzy się je w stosunku do innych hormonów związanych ze stresem2. Glikokortykosteroidy są odpowiedzialne za kilka efektów adaptacyjnych u koni. Energia jest szybko mobilizowana z miejsc magazynowania w organizmie w postaci kwasów tłuszczowych i glukozy, zwiększa się pobór tlenu, poprawiają się funkcje czuciowe3, a przepływ krwi do obszarów niepotrzebnych do ruchu4. Oprócz działania jako mechanizm radzenia sobie, wywołany stresem wzrost glikokortykosteroidów może również pomóc w przygotowaniu zwierzęcia na kolejny stresor5.
Ocena poziomu hormonów w osoczu i ślinie polega na pomiarze rzeczywistego krążącego hormonu, jednak pomiar metabolitów w kale mierzy końcowy produkt metaboliczny hormonu. Krążące sterydy są katabolizowane w wątrobie przed wydaleniem do żółci, gdzie ulegają dalszym zmianom, ułatwionym przez aktywność enzymatyczną flory bakteryjnej w obrębie przewodu pokarmowego6. W związku z tym testy immunologiczne ukierunkowane na glikokortykosteroidy we krwi mogą nie być odpowiednie do analizy metabolitów glikokortykosteroidów w kale7.
Ponieważ pobieranie kału może odbywać się bez zakłóceń dla konia, analiza kału pod kątem kortykosteronu była szeroko stosowana do monitorowania aktywności HPA w wielu okolicznościach. Zgłaszano podwyższone stężenie kortykosteronu w kale koni w odpowiedzi na sytuacje potencjalnie awersyjne, w tym podczas pooperacyjnego leczenia weterynaryjnego8 i w restrykcyjnych warunkach mieszkaniowych9. Pobieranie próbek kału odzwierciedla zbiorczy poziom glikokortykosteroidów w czasie, a nie pobieranie próbek w momencie oferowanym przez osocze i ślinę, co czyni je odpowiednimi do monitorowania wzorców długoterminowych, przewlekłych lub sezonowych10. Ze względu na nieinwazyjny charakter metody, próbki mogą być pobierane wielokrotnie od danej osoby bez konieczności chwytania lub krępowania11. Przy planowaniu protokołu pobierania próbek należy jednak wziąć pod uwagę specyficzny dla danego gatunku czas pasażu jelitowego. U koni czas pasażu jelitowego wynosi około 18 godzin12, dlatego odpowiedź nadnerczy i późniejsze metabolity kortykosteronu można wykryć w kale jeden dzień po początkowej aktywacji osi HPA.
Podczas korzystania z nieinwazyjnych technik immunologicznych, niezbędna jest dokładna walidacja badanego gatunku13. Ponadto zgłaszano różnice płci w wydalaniu metabolitów hormonów, prawdopodobnie z powodu różnic w tempie metabolizmu i rodzaju metabolitu kortykosteronu wydalanego u różnych gatunków, w tym myszy14 i kurcząt15. W związku z tym ważne było, aby w ramach tej metody test został zatwierdzony do stosowania zarówno u samców, jak i samic koni domowych, jak szczegółowo opisano w protokole. Ta różnica w metabolizmie hormonów między płciami ma wpływ na jakość danych, ale rzadko jest uwzględniana i uwzględniana w ramach walidacji testu.
Ta nieinwazyjna metoda pozwala na długoterminową ocenę aktywności nadnerczy u koni domowych. Protokół szczegółowo opisuje zarówno walidację testu, jak i samą technikę testu.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało przeciwko kortykosteronowi i Zestaw HRP</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>Nie jest już dostępny przez UC Davis - zobacz Testy Arbor Przeciwciała</td></tr><tr><td>kortyzolu i Zestaw HRP</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>Nie jest już dostępny przez UC Davis - zobacz Testy Arbor Syntetyczny</td></tr><tr><td>standardowy hormon kortykosteronu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-23-7</td><td>Harnful w przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą. Stosować w dygestorium</td></tr><tr><td>Kortyzol syntetyczny standardowy hormon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15087-01-1</td><td>Działa szkodliwie w przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą. Stosować w dygestorium</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>Drażniący. Do stosowania w dygestorium</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>węglan sodu bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>497-19-8</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10049-21-5</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-92-9</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>ABTS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30931-67-0</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Kapsułki buforowe - pH 4</td><td>VWR</td><td>332732B</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułki buforowe - pH 7</td><td>VWR</td><td>332742D</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułki buforowe - pH 10</td><td>VWR</td><td>332762H</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td>Drażniący. Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5881</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BFS-525-010A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sprężarki</td><td></td><td></td><td></td>powietrza</tr><tr><td>Komputer + drukarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lodówko-zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suszenie aparatura</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>+ przewody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa do przechowywania cieczy łatwopalnych</td><td>VWR</td><td>649-002</td><td></td></tr><tr><td>Dygestoria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło z płytą grzejną</td><td>VWR</td><td>640-282</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myjka do mikropłytek</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Miernik</td><td>Pipety VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&reg; - opakowanie zbiorcze, opcja 2</td> Pipety <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 1 000 i mikro; l</td> Pipeta <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 200 i mikro; l</td> Pipeta <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 20 i mikro; l</td> Pipeta <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repeater</td><td></td> Napełniacz do pipet VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Progen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hilsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>w ciepłej wodzie</tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Milipory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. W sytuacji potencjalnie awersyjnej hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) jest uwalniany z podwzgórza w mózgu. Stymuluje to uwalnianie hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) z przysadki mózgowej, co z kolei stymuluje uwalnianie glikokortykosteroidów z nadnerczy. U koni glikokortykosteroid kortykosteron jest odpowiedzialny za kilka adaptacji potrzebnych do wspierania zachowań koni podczas lotu, a następnie usuwania z sytuacji awersyjnej. Metabolity kortykosteronu można wykryć w kale koni, a ocena oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców aktywności nadnerczy. Ocena kału ma przewagę nad innymi technikami monitorowania aktywności nadnerczy, w tym analizą osocza krwi i śliny. Nieinwazyjny charakter metody pozwala uniknąć stresu związanego z pobieraniem próbek, który może zakłócić wyniki. Daje również możliwość wielokrotnego pobierania próbek w czasie i jest idealny do badań na koniach żyjących na wolnym wybiegu. Protokół ten opisuje test immunologiczny sprzężony z enzymem (EIA) stosowany do oceny kału pod kątem kortykosteronu, oprócz powiązanej walidacji biochemicznej.

Konie domowe (n = 16, 8 klaczy, 8 wałachów) o średnim wieku 15 lat (± 3) podzielono według płci i poddano czterem wariantom utrzymania o zwiększającym się stopniu izolacji społecznej (n = 4 koni/grupa). Wariant 1 polegał na utrzymywaniu koni w stadzie, co ściśle symulowało ich naturalne środowisko. Wariant 2 polegał na utrzymywaniu koni w parach w stajni krytej. Wariant 3 polegał na utrzymywaniu koni pojedynczo w boksach, ale z kontaktem wizualnym z innymi końmi, natomiast wariant 4 poleg...

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie, w jaki sposób można nieinwazyjnie ocenić aktywność nadnerczy u koniowatych poprzez ekstrakcję i analizę fekalnych metabolitów glukokortykoidów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze oceny dobrostanu poprzez badanie fizjologicznego wpływu protokołów chowu na konie udomowione, aż po dzikie populacje zebr afrykańskich. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona nieinwazyjną opcję pomiaru długoterminowej aktywności nadnerczy zarówno u koni udomowionych, jak i żyjących na wolności.W dniu przeprowadzenia eksperymentu, po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej, należy ręcznie zhomogenizować próbki kału, mieszając zawartość każdego poszczególnego worka z próbką. Następnie, dla każdej próbki, odważyć odpowiednią ilość kału na mikrowadze w czystej łódzce wagowej i przenieść próbki do oddzielnych szklanych fiolek o pojemności 8 ml. W kolejnym kroku do każdej próbki dodać 5 ml 90%metanolu w wodzie, a następnie inkubować próbki przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.Następnego dnia rano wymieszać próbki w wirówce typu vortex i odwirować. Po zakończeniu wirowania zlać frakcje metanolu

fecal-glucocorticoid-analysis-non-invasive-adrenal-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.

Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego

Kortyzol (CORT) gromadzi się w rosnących łodygach włosów ludzi i naczelnych. Opisujemy metody ekstrakcji i analizy włosów CORT z dużą precyzją i czułością. Pomiar CORT włosów jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny przewlekłego stresu w okresach od tygodni do miesięcy.

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny stresu. W artykule opisano prosty protokół wykorzystujący obrazowanie termiczne do wykrywania znaczącej reakcji temperatury okolicy oczu u dzikich sikorek modraszkich na łagodny ostry stresor.

Obrazowanie termowizyjne do nieinwazyjnego badania stresu u nieskrępowanych ptaków

'Super-selektywne' pobieranie próbek z żył nadnerczy (ssAVS, zwane również segmentalnym próbkowaniem z żył nadnerczy: sAVS) zostało przeprowadzone przy użyciu mikrocewnika w celu identyfikacji segmentów nadnerczy, które produkują nadmierne ilości hormonów. Opisano technikę ssAVS, przedstawiono przypadki, w których za pomocą ssAVS zidentyfikowano zmiany segmentowe nadnerczy, a także omówiono przydatność ssAVS w przyszłych badaniach nadnerczy.

Nowatorska metoda: superselektywne pobieranie próbek z nadnerczy

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Przedstawiamy protokół do określenia optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do pomiaru kortyzolu z futra koali. Rozpuszczalnikami stosowanymi w tym protokole są metanol, etanol i izopropanol. Określenie optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego pomoże w wiarygodnym pomiarze sierści w celu określenia wpływu przewlekłego stresu na koale.

Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus)

Glej jelitowy staje się coraz bardziej rozpoznawalny ze względu na swoją rolę w homeostazie jelit i procesach chorobowych, w tym powikłaniach pooperacyjnych. Pacjenci koni powracający do zdrowia po laparotomii zwiadowczej w nagłych wypadkach cierpią na wysokie ryzyko wystąpienia stanów zapalnych pooperacyjnych, co podkreśla znaczenie ustalenia powtarzalnej hodowli pierwotnych komórek glejowych jelit koni do badania.

Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Systemy hodowli komórek chromafinowych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z wydzielaniem w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wykorzystywaną do wycięcia nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinowych.

Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Poznaj nieinwazyjną metodę analizy metabolitów glikokortykosteroidów w kale koniowatych do oceny aktywności nadnerczy. Technika ta pozwala badać długoterminowy stres u koni domowych i dzikich zebr.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Przeglądaj więcej filmów