Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie, w jaki sposób można nieinwazyjnie ocenić aktywność nadnerczy u koni poprzez ekstrakcję i analizę metabolitów glikokortokoidów w kale. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarze oceny dobrostanu poprzez przyjrzenie się fizjologicznemu wpływowi protokołów hodowlanych na konie domowe, aż po dzikie populacje afrykańskich zebr. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona nieinwazyjną opcję pomiaru długotrwałej aktywności nadnerczy zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących.

W dniu eksperymentu, po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej, należy ręcznie homogenizować próbki kału, mieszając je w każdym pojedynczym worku na próbki. Następnie dla każdej próbki odmierz odpowiednią ilość kału na mikrowadze w czystej łodzi wagowej i przenieś próbki do pojedynczych ośmiomililitrowych szklanych fiolek. Następnie wymieszaj pięć mililitrów 90% metanolu w wodzie z każdą próbką i wstrząśnij próbkami przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.

Następnego ranka należy odwirować próbki i odwirować je w dół. Pod koniec wirowania zdekantować frakcje metanolu do pojedynczych szklanych probówek o wymiarach 16 na 125 milimetrów. Następnie na krótko umieść rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie odparuj metanol pod powietrzem w dygestorium.

Gdy cały metanol się rozproszy, ponownie zawieś ekstrakty kałowe w jednym mililitrze 100% metanolu. Następnie przenieś ekstrakty do pojedynczych probówek polipropylenowych o wymiarach 12 na 75 milimetrów, zakryj probówki i przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu ich analizy. Przed rozpoczęciem analizy należy użyć powtarzalnej pipety z końcówką do pipety o pojemności 50 mikrolitrów, aby załadować 50 mikrolitrów poliklonalnej surowicy kortykosteronu CJM006, rozcieńczonej w buforze powlekającym, na dołek, do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Następnie przykryj płytkę uszczelniaczem do płytek i inkubuj surowicę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy, za pomocą automatycznej myjki do mikromiareczkowania należy pięciokrotnie umyć płytkę roztworem do mycia. Następnie załaduj niespecyficzne wiązania i dołki zerowe 50 mikrolitrami testu immunologicznego sprzężonego z enzymem lub buforu EIA na studzienkę, standardowe studzienki z odpowiednimi stężeniami kortykosteronu, a studzienki eksperymentalne próbkami ekstraktu kałowego rozcieńczonymi w buforze EIA.

Po załadowaniu ostatniej próbki natychmiast dodać 50 mikrolitrów koniugatu perodiksazy chrzanowej rozcieńczonego w buforze EIA do każdej studzienki i inkubować płytkę mikromiareczkową w ciemności przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć płytkę pięciokrotnym roztworem do mycia. Następnie inkubować próbki w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę świeżo przygotowanego substratu o temperaturze pokojowej w ciemności w temperaturze pokojowej, z okresowym odczytem płytki przy 405 nanometrach na spektrofotometrze.

Inkubację uważa się za zakończoną, gdy gęstość optyczna studzienek zerowych osiągnie 0,8 do 1,0. Aby przeprowadzić biochemiczną walidację równoległości, wykonaj seryjne rozcieńczanie na zbiorczych ekstraktach kałowych, najlepiej pobranych z próbek o podejrzanym wysokim i niskim stężeniu hormonów od kilku osób. Następnie uruchom próbki na OOŚ, jak właśnie pokazano.

Uważa się, że równoległość została osiągnięta, gdy seryjne rozcieńczenia ekstraktów kałowych dają krzywą przemieszczenia równoległą do krzywej standardowej, a wyniki regresji liniowej wykazują R do kwadratu większe niż 0,9, nachylenie większe niż 0,5 i P mniejsze niż 05. Aby przeprowadzić biochemiczną walidację interferencji, należy połączyć 200 mikrolitrów seryjnie rozcieńczonych wzorców z 200 mikrolitrami odpowiedniego zbiorczego ekstraktu kałowego, rozcieńczonego przy 50% wiązaniu, jak określono w teście równoległości. Następnie uruchom próbki na OOŚ, jak pokazano.

Po przeprowadzeniu analizy OOŚ należy sporządzić wykres zaobserwowanego stężenia pomniejszonego o stężenie tła próbki zerowej w stosunku do oczekiwanego stężenia. Żadna interferencja nie jest uważana za osiągniętą, jeśli dodanie rozcieńczonego zbiorczego ekstraktu kałowego do wzorców nie zmienia znacząco oczekiwanej ilości, a wyniki regresji liniowej dają R do kwadratu większe niż 0,9, nachylenie bliskie jednemu i P mniejsze niż 05. Aby przeprowadzić walidację biologiczną, należy uruchomić próbki pobrane przed i po trudnym zdarzeniu w OOŚ, jak właśnie pokazano.

Walidacja biologiczna jest kluczowym krokiem w walidacji EIA i uważa się, że została osiągnięta, gdy obserwuje się znaczny wzrost metabolitów glikokortykosteroidów po trudnym zdarzeniu. Dane na wykresach A i B pokazują walidację biochemiczną dorosłych samców i samic koni domowych, wykazując równoległość do krzywej standardowej kortykosteronu. Nie uzyskano walidacji biochemicznej za pomocą EIA kortyzolu, ponieważ nie było równoległości między zbiorczym ekstraktem kałowym a krzywą standardową kortyzolu.

Te dane od prowokowanych samców i samic koni domowych wykazują walidację biologiczną, ponieważ stężenie kortykosteronu w kale wzrastało wraz ze wzrostem poziomu izolacji u tych zwierząt. Rzeczywiście, konie w izolowanych pomieszczeniach inwentarskich wykazywały znacznie wyższy poziom kortykosteronu w kale w porównaniu ze wszystkimi innymi konstrukcjami pomieszczeń. Tak więc ocena stężenia hormonów w ślinie lub osoczu zwykle polega na przyjrzeniu się rodzimemu hormonowi, ale kiedy oceniamy go w materiale kałowym, patrzymy na rozkład tego produktu i patrzymy na metaboliczne produkty końcowe tego hormonu.

Rzeczywiście, pobieranie próbek kału zapewnia zbiorcze stężenie glikokortokosteroidów w czasie, a nie pojedynczy punkt odbity przez ślinę lub osocze. To sprawia, że jest bardziej odpowiedni do pomiaru długotrwałej, przewlekłej lub sezonowej aktywności nadnerczy. Ponieważ pobieranie próbek kału jest nieinwazyjne dla zwierzęcia, jest szeroko stosowane do monitorowania aktywności nadnerczy koni w wielu naturalnych i eksperymentalnych okolicznościach.

Podczas wykonywania EIA ważne jest, aby zminimalizować czas ładowania płytki mikromiareczkowej do mniej niż 10 minut, ponieważ dłuższe czasy spowodują dryft. Ważne jest również zapewnienie, aby zduplikowane próbki miały współczynnik zmienności mniejszy niż 10 %, a kontrole miały współczynnik zmienności wewnątrz i między testami wynoszący odpowiednio 10 % i 15 %. Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie, jak ekstrahować metabolity glikokortokoidów w kale, analizować te ekstrakty w teście immunoenzymatycznem, a także wykonywać wymagane kroki walidacji.