Mysi model resekcji wierzchołkowej do badania wczesnej regeneracji serca ssaków
23 stycznia 2016
W tym badaniu pokazano protokół wideo krok po kroku resekcji wierzchołkowej. Resekcja wierzchołkowa jest ostatnio wyróżnionym podejściem chirurgicznym w badaniach nad regeneracją serca u ssaków. Badanie to może promować zastosowanie resekcji wierzchołkowej jako standardowej metodologii w badaniach nad mechanizmem leżącym u podstaw regeneracji serca.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie resekcji wierzchołka serca u noworodków myszy w celu zbadania wczesnej regeneracji serca ssaków. Może to pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak jakie mechanizmy molekularne i komórkowe leżą u podstaw wczesnej regeneracji mięśnia sercowego ssaków. Główną zaletą tej techniki jest to, że model mysi z resekcją wierzchołka serca zapewnia stosunkowo proste i bezpośrednie podejście do badania wczesnej regeneracji serca ssaków.
Przed rozpoczęciem procedury przenieś wszystkie szczenięta myszy C57 black six w pierwszym dniu po urodzeniu od matki karmiącej do czystej klatki dla myszy ze świeżą ściółką i materiałami do gniazdowania. Następnie dla każdego noworodka z kolei przenieś szczenię z podłoża lodowego do obszaru operacyjnego i unieruchom kończyny przednie, tylne oraz ogon w pozycji grzbietnej. Zdezynfekuj klatkę piersiową betadyną, a następnie delikatnie przemyj sterylnym wkładem nasączonym 70% alkoholem.
Następnie wykonaj nacięcie skóry wzdłuż czwartego obszaru międzyżebrowego klatki piersiowej. Użyj nożyczek sprężynowych, aby wykonać nacięcie w szczycie serca. Aby uzyskać dostęp do serca, użyj nożyczek sprężynowych do wykonania nacięcia w szczycie serca, a następnie przeprowadź tępe rozczepianie mięśni międzyżebrowych.
Użyj sterylnych szwów 6-0, aby zszyć żebra i mięśnie. Za pomocą kleju tkankowego ostrożnie zamknij nacięcie skóry i pozwól noworodkowi dojść do siebie pod lampą grzewczą przez około trzy minuty. Następnie użyj gazika nasączonego 70% alkoholem, aby oczyścić szczenię z krwi i pozostałości kleju, a następnie zwróć zwierzę do reszty miotu.
Po wykonaniu wszystkich operacji wymieszaj szczenięta z ściółką i odchodami matki, a następnie zwróć noworodki do gniazda matki. Jeden dzień po operacji policz liczbę szczeniąt z grupy kontrolnej (sham) oraz grupy operacyjnej, aby określić przeżywalność w każdej grupie. W odpowiednim punkcie czasowym po operacji, dla każdego zwierzęcia z kolei, oczyść klatkę piersiową 70% etanolem i wykonaj nacięcie skóry oraz mięśni w linii środkowej klatki piersiowej.
Usuń całe serce z jamy klatki piersiowej i utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie (warstwa 5 mm) przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przenieś próbki do 70% etanolu na maksymalnie jeden tydzień przed zatopieniem w parafinie. Po przygotowaniu sekcji z parafiny o grubości 5 µm z całej komory, wybarw próbki hematoksyliną i eozyną oraz trichromem Massona, aby odpowiednio ocenić zastępowanie mięśnia i reakcje włókniste w wyciętych sercach.
Używając skanera preparatów, ręcznie uzyskaj co najmniej trzy ogniska na próbkę. Następnie przeanalizuj obrazy próbek przy powiększeniu 40X zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z domyślnych parametrów skanera. W przypadku udanej resekcji wierzchołkowej, w ciągu jednego dnia od zabiegu, skutecznie formuje się skrzep krwi, który uszczelnia lewą komorę serca.
Następnie obserwuje się postępujący resorpcję skrzepu krwi oraz wczesną włóknienie mięśnia sercowego z jego stopniowym zastępowaniem przez tkankę mięśnia sercowego, aż do całkowitej regeneracji mięśnia sercowego w 21 dniu po resekcji. Rzeczywiście, w ciągu trzech tygodni po operacji analiza morfologiczna nie wykazuje żadnych różnic między sercami poddanymi resekcji a sercami w grupie kontrolnej (sham operated). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zachowaniu warunków sterylnych.
Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne pomiary, takie jak znakowanie oraz analiza liniowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące proliferacji kardiomiocytów i resekcji wierzchołkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić resekcję wierzchołkową u noworodkowych myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie prezentuje krok po kroku protokół wideo resekcji wierzchołkowej, będącej podejściem chirurgicznym w badaniach nad regeneracją serca u ssaków. Technika ta ma na celu pogłębienie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw regeneracji serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Regeneracja serca
- Techniki chirurgiczne u noworodków myszy
- Molekularne mechanizmy naprawy serca
Wstęp
- Regeneracja serca jest kluczowym obszarem badań w kardiologii.
- Resekcja wierzchołkowa to nowatorska technika badania naprawy serca.
- Zrozumienie wczesnej regeneracji może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- W niniejszym badaniu jako organizm model wykorzystano noworodki myszy.
Cel badania
- Zbadanie komórkowych i molekularnych mechanizmów regeneracji serca.
- Ustanowienie resekcji koniuszkowej jako standardowej metodologii badawczej.
- Zapewnienie prostego podejścia do badania regeneracji serca.
Zastosowane metody
- Przeniesienie jednodniowych myszy C57 black six do czystej klatki.
- Unieruchomienie noworodków przed zabiegami chirurgicznymi.
- Dezynfekcja okolic klatki piersiowej przed operacją.
- Wykonanie resekcji wierzchołka serca w celu zbadania regeneracji serca.
Główne wyniki
- Prezentacja techniki resekcji wierzchołkowej u noworodków myszy.
- Zapewnienie przejrzystego protokołu do przyszłych zastosowań badawczych.
- Wgląd we wczesne etapy regeneracji serca.
- Potencjał do standaryzacji metodologii w badaniach nad regeneracją serca.
Wnioski
- Resekcja wierzchołkowa jest cenną techniką badania regeneracji serca.
- Niniejsze badanie może ułatwić dalsze prace nad mechanizmami naprawy mięśnia sercowego.
- Standaryzacja tej metody mogłaby zwiększyć powtarzalność wyników badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie powtarzalnych modeli wczesnej regeneracji serca ssaków pozwala na wypełnienie krytycznej luki w badaniach i rozwoju w obszarze układu sercowo-naczyniowego, gdzie ograniczona zdolność regeneracyjna utrudnia opracowywanie terapii. Myszie model resekcji koniuszka serca umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków naprawy serca podczas przedklinicznej walidacji punktów uchwytu. Wspiera to pewność prognostyczną w identyfikacji modulatorów proliferacji kardiomiocytów oraz rozdzielczości włóknienia.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących proliferacji kardiomiocytów i tworzenia się blizn.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośredni system in vivo do funkcjonalnej walidacji celów w obrębie szlaków związanych z regeneracją.
- Wartość predykcyjna: Wspiera selekcję portfolio poprzez rozróżnianie związków promujących rzeczywistą regenerację mięśnia sercowego od tych wywołujących włóknienie.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne punkty końcowe histologiczne (np. grubość mięśnia sercowego, obszar włóknienia) do przesiewowych badań związków.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowana procedura chirurgiczna zapewnia powtarzalność między laboratoriami i punktami czasowymi.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych skrawków tkanek do wysokoprzepustowego obrazowania i analizy (high-content imaging).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje wczesne postnatalne okno regeneracyjne istotne dla kardiologii rozwojowej i strategii naprawy wad wrodzonych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę naprawy tkanek, od rozpuszczania skrzepu po regenerację mięśnia sercowego do 21 dnia.
- Zgodność translacyjna: Wspiera odkrywanie biomarkerów (np. dynamiki macierzy zewnątrzkomórkowej) stosowalnych w ludzkich modelach uszkodzeń serca.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model resekcji wierzchołkowej wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celu po przedkliniczną ocenę skuteczności – zapewniając system istotny dla przebiegu choroby w celu zmniejszenia ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Testuje specyficzne dla danej ścieżki efekty w zakresie obrotu kardiomiocytów i odpowiedzi włóknistej po urazie.
- Screening: Dostarcza ilościowych odczytów histologicznych umożliwiających określenie zależności dawka-odpowiedź oraz profilowanie czasowe związków regeneracyjnych.
- Analityka: Generuje wyniki morfometryczne i oparte na barwieniu (H&E, trichrome Massona) w celu obiektywnego porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne mechanizmy regeneracji z walidacją przedkliniczną poprzez określone kamienie milowe w wymiarze czasowym i morfologicznym.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną do walidacji celów sercowo-naczyniowych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją serca dzięki określonym ramom czasowym urazu i rekonwalescencji.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom znieczulenia, chirurgicznym oraz pooperacyjnym.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie, czy badani kandydaci stymulują regenerację, czy jedynie hamują włóknienie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o potencjał regeneracyjny w systemie ssaczym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obchodzenia się z noworodkami myszy oraz technik mikrochirurgicznych.
- Metoda jest zależna od dostępności sterylnego instrumentarium chirurgicznego, szwów oraz infrastruktury do przetwarzania tkanek.
- Niezbędna jest standaryzacja znieczulenia, opieki pooperacyjnej i analizy histologicznej pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych modeli musi uwzględniać gatunkową zdolność regeneracyjną oraz wykonalność chirurgiczną.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność osobniczą noworodków oraz zależność przeżywalności od spójności wykonywanych procedur.
