Name: Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę przygotowania nanostrukturalnych cząstek hybrydowych z nanorurek węglowych i samoorganizujących się lipidów. Technika ta umożliwia stabilizację emulsji olej-woda o rozmiarze poniżej mikrona z biokompatybilnym rdzeniem kubicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Matthew J. Bakerowi, obecnie pracującemu na Uniwersytecie Strathclyde w Glasgow, za wsparcie w eksperymentach ramanowskich oraz panu Nickowi Gauntowi za jego wcześniejszą pracę nad tym projektem.

Uwaga: CNT użyte w tej pracy występują w formie nanocząsteczkowej, która może stwarzać dodatkowe zagrożenia w porównaniu z ich odpowiednikami w formie masowej. Inhalacja grafitu, zarówno naturalnego, jak i syntetycznego, może prowadzić do pylicy płuc62 podobnej do pylicy górniczej. Ponadto pojawiły się obawy dotyczące toksyczności nanostruktur opartych na węglu, a niektóre wcześniejsze badania sugerują toksyczność ostrą i przewlekłą związaną z inhalacją CNT63-68. Należy zatem unikać wdychania drobnego proszku CNT i obchodzić się z nim z dużą ostrożnością. W przypadku inhalacji należy wyjść na świeże powietrze. Jeśli oddychanie jest utrudnione, należy podać czysty tlen i skonsultować się z lekarzem. Roztwory i dyspersje CNT są stosunkowo bezpieczne w obsłudze.
Uwaga: Lipidy i surfaktanty użyte w tym badaniu są materiałami klasy spożywczej i co do zasady nie są niebezpieczne, jednak mogą podrażniać oczy i skórę, a ponadto są wysoce łatwopalne. W związku z tym prosimy o stosowanie wszelkich odpowiednich zasad bezpieczeństwa, takich jak wykorzystanie zabezpieczeń technicznych (dygestorium) oraz środków ochrony indywidualnej (okularów ochronnych, rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, długich spodni, pełnych butów), podczas obchodzenia się z próbkami nanocząsteczek lub ich przygotowywania. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami należy natychmiast przemyć skórę lub oczy dużą ilością wody przez co najmniej 15 min. W razie potrzeby należy zasięgnąć porady lekarskiej.
1. Przygotowanie objętościowych faz lipidowej i wodnej
Uwaga: Lipidy należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. Lipidy czystej klasy powinny być przechowywane w zamrażarce (-20 °C). Należy je podzielić na alykwoyty w małych szklanych fiolkach, aby uniknąć kontaminacji całego zapasu oraz dla wygody manipulacji. Pozostałe odczynniki, w tym CNT i surfaktanty, mogą być przechowywane w RT, jednak należy chronić je przed bezpośrednim światłem słonecznym.
<ol>
	<li>Zachowaj lipidy, t.j. Dimodan U (DU) i fitantriol (PT) pozostawić w temperaturze pokojowej przez 15–20 min przed otwarciem butelki/fiolki, aby uniknąć kondensacji wilgoci. 
	(Uwaga: DU to destylowany gliceryd składający się w 96% z monoglicerydów, a pozostałą część stanowią diglicerydy i wolne kwasy tłuszczowe. Dwiema głównymi składowymi monoglicerydów w DU są linoleinian (62%) i oleinian (25%). Zatem hydrofobowa część DU zawiera głównie łańcuchy C18 (91%), których dokładny skład jest następujący: C18:2 (61,9%), C18:1 (24,9%) oraz C18:0 (4,2%), gdzie C18 oznacza łańcuch 18-węglowy, a liczba po dwukropku wskazuje liczbę wiązań C=C. PT jest mieszaniną izomerów optycznych 3,7,11,15-tetrametylo-1,2,3-heksadekanotriolu. Nie zawiera on grupy funkcyjnej estru, lecz składa się z silnie rozgałęzionego ogona fitanylowego z grupą trihydroksylową w głowie. Zarówno DU, jak i PT tworzą fazy kubiczne w obecności nadmiaru wody, co ma również miejsce w przypadku rdzeni stabilizowanych cząsteczek lipidowych)13, 45).</li>
	<li>Rozpuść lipidy, umieszczając probówki w łaźni wodnej lub zlewce z wodą utrzymywaną powyżej 60 °C (mieszadło magnetyczne z funkcją grzania: 230 V, 50 Hz, 630 W lub podobne, do podgrzewania wody w zlewce).</li>
	<li>Alternatywnie probówki można ogrzewać za pomocą grzałek blokowych. Nie należy ogrzewać probówek zawierających lipidy bezpośrednio na płycie grzejnej, aby uniknąć powstania gradientu temperatury i następczej dekompozycji lipidów.</li>
	<li>Odważ 500 mg stopionego lipidu do wcześniej zważonej probówki do mikrocentryfugi (z stożkową zakrętką, 1,5 ml), używając szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką.</li>
	<li>Do powyższej probówki do mikrocentryfugi należy dodać 500 ml wody ultraczystej (rezystywność wody = 18,2 MΩ·cm).</li>
	<li>Mieszaj składniki ręcznie przez 15 min, używając niewielkiej (wykonanej samodzielnie) szpatułki. Taką szpatułkę można przygotować, spłaszczając ostry koniec igły do strzykawki (długość kaniuli 0,9 mm x 40 mm) za pomocą szczypiec.</li>
	<li>Odwiruj mieszaninę lipidowo-wodną przez 10 min przy prędkości 2000 x g. Ponownie wymieszaj mieszaninę ręcznie przez 10 min, a następnie pozostaw do równoważenia przez 24 h. Przed charakterystyką próbek mieszaj je przez 5 min, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby zapewnić utworzenie równowagowej fazy lipidowej w całej probówce, należy przeprowadzić około 10 cykli zamrażania i rozmrażania, przeplatając je etapem wirowania zgodnie z powyższym opisem. Zarówno DU, jak i PT tworzą wysokolepkie objętościowe fazy lipidowe, co utrudnia ich ręczną manipulację (Rycina 1). 
	Uwaga: Powyższy protokół (sekcja 1) jest konieczny tylko w przypadku, gdy chcemy porównać zachowanie nanostrukturalne (typ sieci i wymiary samoorganizacji) cząstek rozproszonych z fazą lipidową w formie objętościowej i/lub wykorzystać go jako kontrolę w celu potwierdzenia zachowania oryginalnej nanostruktury.</li>
</ol>
<img alt="Ultrasonikacja fazy lipidowej, schemat procesu emulsji stabilizowanej CNT, montaż cząsteczek lipidów." src="/files/ftp_upload/53489/53489fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie cząsteczkowej emulsji O/W o konsystencji płynnej z wysokolepkiej fazy lipidowej przy użyciu wysokiego nakładu energii (ultrasonikacji) oraz różnych stabilizatorów CNT, mianowicie SWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (rycina powielona z literatury [50] za zgodą The Royal Society of Chemistry). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53489/53489fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie cząsteczek lipidowych stabilizowanych surfaktantem
<ol>
	<li>Przygotować 0,2% (w/w) roztwór surfaktanta (pluronic F127) w wodzie.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 200 mg surfaktanta (biały puszysty proszek) w 100 ml wody ultrapurej poprzez mieszanie przez 20-30 min (na mieszadle magnetycznym z wykorzystaniem słupka magnetycznego). Pluronic F127 jest niejonowym surfaktantem i jest powszechnie stosowany jako stabilizator emulsji. Jest to kopolimer triblockowy PEO99-PPO67-PEO99, przez co długo rozpuszcza się w wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do szklanej fiolki (scyntylacyjna sodowo-wapniowa z zakrętką z mocznika wyłożoną folią, 20 ml) dodać 500 mg stopionego DU lub PT (używając szklanej pipety Pasteura).</li>
	<li>Dodać 9,5 g 0,2% roztworu F127.</li>
	<li>W urządzeniu do sonikacji sondowej mocno przymocować fiolkę do uchwytu statywu (zestaw statywu z podstawą, uchwytem, prętem, gumową trzypalczastą zaciskiem i głowicą), aby mogła ona wytrzymać wibracje generowane podczas sonikacji.</li>
	<li>Wprowadzić sondę z litego stopu tytanu (średnica 13 mm x długość 139 mm) przymocowaną do sonikatora komórkowego. Dostosować wysokość i pozycję fiolki tak, aby jej ścianki i dno nie dotykały sondy. Odległość 0,5 cm między końcówką sondy a dnem szklanej fiolki zapewnia dobre wyniki.</li>
	<li>Sonikować mieszaninę przez 10 min w trybie impulsowym z impulsem 1 s i przerwą 1 s przy mocy 35% (maksymalnej). Fiolka staje się bardzo gorąca z powodu ciepła generowanego podczas sonikacji. Dlatego należy pozwolić jej ostygnąć do RT przed zdjęciem z uchwytu.</li>
	<li>Przechowywać uzyskaną mleczną dyspersję w RT przez co najmniej 24 h przed dalszym użyciem. Ma to na celu zapewnienie jej stabilności przeciwko rozwarstwianiu faz. 
	Uwaga: Przed i po użyciu sondy należy ją oczyścić acetonem, osuszyć ręcznikiem papierowym, a następnie przepłukać wodą ultrapurej i ponownie osuszyć.</li>
</ol>
3. Przygotowanie dyspersji czystych CNT w wodzie
<ol>
	<li>W dwóch osobnych zlewkach odważ po 4 mg sproszkowanych MWCNT-OH i MWCNT-COOH, które mają kolor czarny.</li>
	<li>Do każdej zlewki dodaj 500 ml wody ultrapure. Za pomocą sonikatora probe sonikuj mieszaniny przez 2 min w trybie impulsów ciągłych przy mocy 40% (maksymalnej). Otrzymane stężenie dyspersji MWCNT wynosi 8 µg/ml (roztwór zapasowy).</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór zapasowy MWCNT odpowiednią ilością wody ultrapure, aby uzyskać dyspersje MWCNT o stężeniach 6,25, 5, 4, 2 µg/ml.</li>
	<li>Sonikuj te dyspersje w sposób opisany wcześniej (patrz 3.2).</li>
	<li>Analogicznie, rozprosz 3 mg sproszkowanych SWCNT (również o kolorze czarnym) w 500 ml wody ultrapure, aby przygotować dyspersję SWCNT o stężeniu 6 µg/ml (roztwór zapasowy).</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór zapasowy SWCNT i sonikuj je zgodnie z opisem powyżej (patrz 3.2), aby uzyskać dyspersje SWCNT o stężeniach 0,5, 0,4, 0,3125, 0,2 µg/ml. 
	Uwaga: Wszystkie dyspersje pozostają klarowne przez około 30 min, po czym CNT zaczynają osadzać się na dnie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie nanostrukturalnych cząstek lipidowych stabilizowanych CNT (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Odważyć 500 mg stopionego DU do szklanej fiolki.</li>
	<li>Do fiolki dodać 9,5 ml dyspersji SWCNT o stężeniu 6 µg/ml.</li>
	<li>Mieszaninę CNT-DU poddać sonikacji przy użyciu tych samych parametrów, które zastosowano do przygotowania czystych dyspersji CNT (patrz 3.2). Po ochłodzeniu do RT otrzymane zostaną cząstki lipidowe stabilizowane przez CNT z zachowaną wewnętrzną, samoorganizującą się nanostrukturą.</li>
	<li>W podobny sposób przygotować cząstki lipidowe, wykorzystując dyspersje SWCNT o stężeniach 0,4 µg/ml oraz 0,2 µg/ml.</li>
	<li>Postępować zgodnie z protokołami od 4.1 do 4.4 w celu przygotowania cząstek lipidowych z użyciem MWCNT-OH oraz MWCNT-COOH, stosując jednak inne stężenia, a mianowicie 8, 4 i 2 µg/ml CNT.</li>
	<li>Analogicznie przygotować trzy różne dyspersje CNT-PT, wykorzystując MWCNT-OH i MWCNT-COOH w stężeniu 4 µg/ml oraz SWCNT w stężeniu 0,4 µg/ml. Należy pamiętać, że dyspersje CNT-PT wymagają mniejszej mocy (35% mocy maksymalnej), lecz dłuższego czasu (15 min) w trybie impulsu ciągłego. Ochłodzić dyspersje do RT i pozostawić je na 24 h przed przeprowadzeniem charakterystyki. 
	Uwaga: Parametry sonikacji mogą różnić się w zależności od rodzaju lipidów (jak w przypadku DU i PT) oraz składu mieszaniny; muszą one zostać zoptymalizowane w celu uzyskania dobrze stabilnych dyspersji.</li>
</ol>
5. Monitorowanie stabilności dyspersji lipidowych stabilizowanych przez CNT
<ol>
	<li>Monitoruj stabilność dyspersji poprzez obserwację wizualną: sprawdź, czy dyspersje uległy destabilizacji lub czy w dyspersjach utworzyły się grudki.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia (aparatem cyfrowym) w regularnych odstępach czasu. Na przykład fotografuj dyspersje codziennie w pierwszym tygodniu, następnie co drugi dzień przez tydzień, potem raz w tygodniu przez kolejne dwa tygodnie, a na koniec raz w miesiącu, zgodnie z potrzebami.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Stabilizacja cząsteczek lipidów Trzy różne CNT są używane do stabilizacji dyspersji lipidowych; dwa z nich są wielościenne i funkcjonalizowane przy użyciu grup -OH i -COOH, a jeden jest jednościenny i niefunkcjonalizowany (nieskazitelny). Nanorurki węglowe różniły się wielkością w następujący sposób (średnica x długość): MWCNT-COOH: 9,5 nm x 1,5 μm; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 μm; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 μm. Sproszkowane CNT zostały zdyspergowane w wodzie za pomocą ultradźwięków sondy. Wyżej wymienione rozmi...

W ciągu ostatnich kilku dekad, nanotechnologia stała się potężnym narzędziem, szczególnie w dziedzinie przedklinicznego rozwoju medycyny do walki z osławionymi chorobami, takimi jak rak1. W tym kontekście struktury w nanoskali o wielkości <1000 nm są szeroko badane jako nośnik różnych aktywnych biomolekuł, takich jak leki, białka, kwasy nukleinowe, geny i środki do obrazowania diagnostycznego1-4. Te biomolekuły są albo zamknięte w nanocząstkach, albo sprzężone z powierzchnią nanocząstek i są uwalniane w miejscu działania przez czynniki wyzwalające, takie jak pH lub temperatura5,6. Pomimo niezwykle małych rozmiarów, duża powierzchnia tych nanocząstek okazuje się bardzo korzystna dla ukierunkowanego dostarczania aktywnych biomolekuł. Kontrola nad wielkością cząstek i biokompatybilnością ma ogromne znaczenie dla optymalizacji skuteczności terapeutycznej, a tym samym możliwości zastosowania nanocząstek7,8. Lipidy9-13, polimery14,15, metale16,17 i nanorurki węglowe18,19 są powszechnie stosowane jako nanonośniki do różnych zastosowań biomedycznych i farmaceutycznych.
Ponadto, zastosowania nanonośników oparte na samoorganizujących się nanostrukturach lipidowych mają szerokie znaczenie w wielu innych dyscyplinach, w tym w przemyśle spożywczym i kosmetycznym20,21. Na przykład są one stosowane w krystalizacji białek22, rozdzielaniu biomolekuł23, jako stabilizatory żywności, np. w deserach24 oraz w dostarczaniu aktywnych cząsteczek, takich jak składniki odżywcze, smaki i perfumy25-31. Samoorganizujące się nanostruktury lipidowe nie tylko mają zdolność do uwalniania cząsteczek bioaktywnych w kontrolowany i ukierunkowany sposób32-38, ale są również w stanie chronić cząsteczki funkcjonalne przed degradacją chemiczną i enzymatyczną39,40. Chociaż płaska dwuwarstwa płynu jest najczęstszą nanostrukturą utworzoną przez amfifilowe cząsteczki lipidów w obecności wody, często obserwuje się również inne struktury, takie jak sześciokątne i sześcienne20,41,42. Rodzaj powstającej nanostruktury zależy od struktury molekularnej lipidów, składu lipidów w wodzie, a także od zastosowanych warunków fizykochemicznych, takich jak temperatura i ciśnienie43. Możliwość zastosowania niepłaskich nanostruktur lipidowych, zwłaszcza faz sześciennych, jest ograniczona ze względu na ich wysoką lepkość i niejednorodną konsystencję domeny. Problemy te można przezwyciężyć poprzez dyspersję nanostruktur lipidowych w dużej ilości wody w celu wytworzenia emulsji typu olej w wodzie (O/W) zawierających cząsteczki lipidów o rozmiarach mikronowych lub submikronowych. W ten sposób można przygotować odpowiedni produkt o niskiej lepkości, zachowując jednocześnie pierwotną strukturę samoorganizującą się lipidów wewnątrz zdyspergowanych cząstek. Powstawanie tych wewnętrznie samoorganizujących się cząstek (w skrócie ISAsomy44, np. kubosomy z faz sześciennych i heksosomy z faz heksagonalnych) zwykle wymaga połączenia etapu wprowadzania wysokiej energii i dodania stabilizatorów, takich jak środki powierzchniowo czynne lub polimery. Ostatnie badania w tym kierunku wskazują na zastosowanie różnych cząstek stałych45 , w tym nanocząstek krzemionki46, gliny47-49 i nanorurek węglowych50 do stabilizacji wyżej wymienionych emulsji, odpowiednio określanych jako emulsje Pickeringa51 lub emulsje Ramsdena-Pickeringa52.
W ostatnich latach nanostruktury oparte na węglu, takie jak jednościenne nanorurki węglowe (SWCNTs), wielościenne nanorurki węglowe (MWCNTs) i fulereny, zyskały dużą uwagę jako nowe biomateriały53,54. Główne obawy to ich toksyczność55-58, nierozpuszczalność w wodzie59, a co za tym idzie ich biokompatybilność56. Skutecznym sposobem radzenia sobie z tymi problemami jest funkcjonalizacja powierzchni przy użyciu nietoksycznych i biokompatybilnych cząsteczek, takich jak lipidy. W obecności wody lipidy oddziałują z CNT w taki sposób, że hydrofobowa powierzchnia CNT jest osłonięta przed polarnym środowiskiem wodnym, podczas gdy hydrofilowe grupy główne lipidów wspomagają ich rozpuszczalność lub dyspersję w wodzie60,61. Lipidy są integralnymi składnikami organelli komórkowych, a także niektórych materiałów spożywczych, dlatego ich dekoracja powinna idealnie zmniejszać toksyczność CNT in vivo. Zastosowania biomedyczne oparte niezależnie na CNT18,19 i nanostrukturach lipidowych9-13 są intensywnie rozwijane, ale zastosowania, które łączą właściwości tych dwóch, nie są jeszcze dobrze zbadane.
W tej pracy używamy dwóch różnych typów lipidów i trzech typów CNT, z których SWCNT są w nieskazitelnej formie, podczas gdy MWCNT są funkcjonalizowane grupami hydroksylowymi i karboksylowymi. Do przygotowania dyspersji użyliśmy bardzo niskich stężeń CNT, których stabilność zależy od kilku czynników, np. rodzaju lipidu, rodzaju CNT, stosunku użytego lipidu do CNT, a także od zastosowanych parametrów sonikacji, takich jak moc i czas trwania. Ten protokół wideo zawiera szczegóły techniczne metody kinetycznej stabilizacji nanocząstek lipidowych przy użyciu różnych stabilizatorów CNT.

<table><tbody><tr><td>Dimodan U</td><td>Danisco</td><td>15312</td><td>Sklep pod adresem 4&nbsp; &deg;C. Nie jest szkodliwy. Działa drażniąco na oczy i skórę.</td></tr><tr><td>Fitantriol (> 95%, GC)</td><td>TCI Europe N.V.</td><td>P1674</td><td>Sklep pod adresem 4&nbsp; &deg;C. Nie jest szkodliwy. Działa drażniąco na oczy i skórę.</td></tr><tr><td>Jednościenne nanorurki węglowe (90%)</td><td>Nanostrukturalne i Materiały amorficzne, Inc.&nbsp;</td><td>1246YJS</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Z dala od bezpośredniego światła. Działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe.</td></tr><tr><td>Wielościenne nanorurki węglowe funkcjonalizowane kwasem karboksylowym (>&nbsp; 80% na bazie Caron, >&nbsp; 8% funkcjonalizowany kwasem karboksylowym)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC&nbsp;</td><td>755125</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Z dala od bezpośredniego światła. Działa drażniąco na oczy. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.</td></tr><tr><td>Grafityzowane, wielościenne, hydroksylizowane nanorurki węglowe (99,9%)</td><td>Nanostrukturalne i Materiały amorficzne, Inc. (NanoAmor)&nbsp;</td><td>1224YJF</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Z dala od bezpośredniego światła. Działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe.</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC&nbsp;</td><td>P2443</td><td>BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych. Nie jest substancją ani mieszaniną stwarzającą zagrożenie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Aceton (99,5%)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10134100</td><td>Wysoce łatwopalna ciecz. Działa drażniąco na oczy. Może powodować senność lub zawroty głowy.</td></tr><tr><td>Słoiki z luźnymi, zamykanymi pokrywkami (375&nbsp; ml)</td><td>VWR International Ltd</td><td>216-3308</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka, 1 000 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12942161</td><td>o dużej wytrzymałości, o niskim kształcie, z dziobkiem i podziałką</td></tr><tr><td>Pipeta szklana Pasteura (długość 150 mm) z bańką lateksową</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10006021</tr><tr><td>Rurka do mikrowirówki stożkowa zatrzaskowa 1,5&nbsp; ml</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>11558232</tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11352204</tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne grzewcze</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11715704</tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne (cylindryczne, nieprzezroczyste PTFE, 30&nbsp; mm x 7&nbsp; mm (dł. x średnica))Fisher</td> <td>Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10011792 Igła (0,9 mm x 40&nbsp; mm długość kaniuli)</td><td>Terumo UK Ltd</td><td>MN-2038MQ</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw stojaków retortowych - ze stojakiem, zaciskiem, podstawą, prętem, gumą 3-szczękową i głowicą Camlab</td><td>Ltd, Wielka Brytania</td><td>1177157</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt wodny Millipore</td><td>Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa mikrowirówka Progen Genfuge 24D</td><td>Progen Scientific</td><td>C-2400</td><td></td></tr><tr><td>Sonda ultradźwiękowa, z 13 mm&nbsp;</td><td>SONICS, Vibracell,&nbsp; Amerykański</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aparat 5 MP z autofokusem i lampą błyskową LED</td><td>Samsung Galaxy Fame Aparat</td><td></td><td></td>mobilny</tr><tr><td>Spektrometr Ramana</td><td>Horiba Jobin-Yvon Spektrometr</td><td></td><td></td>LabRAM HR800</tr><tr><td>Mastersizer 3000</td><td>&nbsp; Malvern Instruments Ltd, Malvern, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)</td><td>Kamera SAXSpace (Anton Paar, Graz, Austria), sprzęt do generowania promieniowania rentgenowskiego (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), zamknięty obieg wody (Chilly 35, HYFRA, Niemcy).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

Prezentujemy prostą metodę przygotowania nanostrukturalnych cząsteczek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe (CNT). Jednościenne (nieskazitelne) i wielościenne (funkcjonalizowane) CNT są stosowane jako stabilizatory do produkcji emulsji typu Pickering typu olej w wodzie (O/W). Jako emulgatory stosuje się lipidy, a mianowicie Dimodan U i Fitantriol, które w nadmiarze wody samoorganizują się do dwuciągłej sześciennej fazy Pn3m. Ta faza o wysokiej lepkości jest rozdrabniana na mniejsze cząstki za pomocą ultrasonografu sondowego w obecności konwencjonalnych stabilizatorów środków powierzchniowo czynnych lub CNT, jak to ma miejsce w tym przypadku. Początkowo CNT (w postaci proszku) są dyspergowane w wodzie, a następnie poddawane są dalszym ultradźwiękom ze stopionym lipidem w celu utworzenia końcowej emulsji. Podczas tego procesu CNT zostają pokryte cząsteczkami lipidów, które z kolei przypuszczalnie otaczają kropelki lipidów, tworząc emulsję cząstek stałych, która jest stabilna przez miesiące. Średnia wielkość nanostrukturalnych cząstek lipidowych stabilizowanych CNT mieści się w zakresie submikronowym, co dobrze wypada w porównaniu z cząstkami stabilizowanymi przy użyciu konwencjonalnych środków powierzchniowo czynnych. Dane dotyczące rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem potwierdzają zachowanie pierwotnej fazy sześciennej Pn3m w dyspersjach lipidowych stabilizowanych CNT w porównaniu z czystą fazą lipidową (stan masowy). Przesunięcie ku błękitowi i obniżenie intensywności w charakterystycznych pasmach G i G' CNT obserwowane w spektroskopii Ramana charakteryzują oddziaływanie między powierzchnią CNT a cząsteczkami lipidów. Wyniki te sugerują, że interakcje między CNT a lipidami są odpowiedzialne za ich wzajemną stabilizację w roztworach wodnych. Ponieważ stężenia CNT stosowanych do stabilizacji są bardzo niskie, a cząsteczki lipidów są w stanie funkcjonalizować CNT, oczekuje się, że toksyczność CNT będzie nieznaczna, a ich biokompatybilność znacznie wzrośnie. W związku z tym obecne podejście ma ogromny potencjał w różnych zastosowaniach biomedycznych, na przykład w opracowywaniu hybrydowych systemów nanonośników do dostarczania wielu funkcjonalnych cząsteczek, jak w terapii skojarzonej lub politerapii.

Poniższe wyniki przedstawiają a) stabilność dyspersji, b) rozkład wielkości cząsteczek lipidów, c) typ samoorganizacji oraz d) dowody na powlekanie CNT lipidami. Stabilność dyspersji (Rycina 2) monitorowano za pomocą aparatu 5 MP z autofokusem i lampą błyskową LED.
<img alt="Schemat dyspersji nanorurek węglowych; stosunki CNT do lipidów przy różnych stężeniach; MWCNT-OH, MWCNT-COOH, SWCNT." src="/files/ftp_uploa...

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Ogólnym celem opisanej metody jest przygotowanie nanostrukturalnych cząsteczek hybrydowych z wykorzystaniem nanorurek węglowych (CNT) oraz samoorganizujących się lipidów. Metoda ta przedstawia jedno z inteligentnych zastosowań nanorurek węglowych, w którym uzyskuje się stabilną emulsję nanostrukturalną z wewnętrznie samoorganizujących się cząsteczek lipidowych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że protokół jest stosunkowo prosty i łączy właściwości elementarne zarówno CNT, jak i nanostruktur lipidowych.Stabilizacja CNT prowadzi do powstania emulsji olejowo-wodnej, w której cząstki mają rozmiar około jednego mikrona lub mniejszy, a rdzeń zawiera bikontynuijną kubiczną nanostrukturę lipidową. Dzięki powłoce z biokompatybilnych cząsteczek lipidów przewiduje się, że ich toksyczność będzie niska. Niedawne doniesienia wykazały dotychczas, że funkcjonalizacja znacznie redukuje toksyczne i cytotoksyczne działanie CNT, zwiększając jednocześnie ich biokompatybilność.Procedurę zademonstrują Yogita Patil-Sen, post-doc z mojego laboratorium, oraz Amin Sadgehpour, post-doc z laboratorium profesora Rappolta. Przygotuj 0,2% roztwór surfaktantu w wodzie, rozpuszczając 200 mg surfaktantu w 100 ml ultra-czystej wody poprzez mieszanie przez 20 do 30 minut. Do szklanej fiolki dodaj 500 mg stopionego Dimodanu U (DU) lub Phytantriolu (PT).Następnie dodać 9,5 g 0,2% roztworu F127. W urządzeniu do sonikacji przy pomocy uchwytu statywu mocno zacisnąć fiolkę, aby mogła ona wytrzymać wibracje generowane podczas sonikacji. Wprowadzić stałą sondę z stopu tytanu przymocowaną do sonikatora komórkowego.Dostosuj wysokość i pozycję probówki, aby upewnić się, że jej ścianki i dno nie dotykają sondy. Sonicuj mieszaninę przez dziesięć minut w trybie impulsowym, stosując jednosekundowy impuls z jednosekundową przerwą przy mocy 35%. Probówka bardzo mocno nagrzewa się z powodu ciepła generowanego podczas sonikacji.Dlatego należy pozwolić na ostygnięcie próbki do temperatury pokojowej przed zdjęciem jej z zacisku. Powstałą mleczną dyspersję przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed dalszym użyciem. Ma to na celu zapewnienie jej stabilności i zapobieganie rozwarstwianiu faz.Przed i po użyciu sondy należy oczyścić ją acetonem i osuszyć ręcznikiem papierowym. Następnie należy wypłukać ją wodą ultrapure i ponownie osuszyć. W dwóch oddzielnych zlewkach odważyć po cztery miligramy sproszkowanych CNTs funkcjonalizowanych grupami hydroksylowymi oraz CNTs funkcjonalizowanych grupami karboksylowymi; oba materiały mają kolor czarny.Do każdego zlewka należy dodać 500 milliliters wody ultra-czystej. Przy użyciu sonikatora z sondą należy poddać mieszaniny sonikacji przez dwie minuty w trybie ciągłym przy mocy 40%. Uzyskane stężenie dyspersji wielościanowych CNT wynosi osiem micrograms per milliliter.Rozcieńczyć roztwór stokowy wielościennych CNT odpowiednią ilością ultraczystej wody, aby uzyskać dyspersje wielościennych CNT o kilku różnych stężeniach. Poddać te dyspersje sonikacji w sposób opisany wcześniej. Analogicznie, zdyspergować 3 mg sproszkowanych jednościennych CNT w 500 mL ultraczystej wody, aby przygotować roztwór stokowy dyspersji jednościennych CNT o stężeniu 6 µg/mL.Rozcieńczyć roztwór zapasowy jednościennych CNT i poddać sonikacji w ten sam sposób co wcześniej, aby uzyskać dyspersje jednościennych CNT o różnych stężeniach. Odważyć 500 mg stopionego DU do szklanej fiolki. Następnie dodać do fiolki 9,5 ml dyspersji jednościennych CNT o stężeniu 6 µg/ml.Poddaj mieszaninę CNT DU sonikacji, stosując te same parametry, które zostały użyte do przygotowania czystych dyspersji CNT. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej uzyskane zostaną stabilizowane przez CNT cząstki lipidowe z zachowaną wewnętrzną, samorzutnie uformowaną nanostrukturą. W analogiczny sposób przygotuj cząstki lipidowe, wykorzystując dyspersje jednościennych CNT o stężeniu 0,4 µg/mL oraz 0,2 µg/mL.Poddaj dyspersje CNT PT sonikacji przy mocy 35% przez dłuższy czas, wynoszący piętnaście minut, w trybie ciągłego impulsu. Schłodź dyspersje do temperatury pokojowej i pozostaw je na 24 godziny przed ich charakteryzacją. Monitoruj stabilność dyspersji za pomocą obserwacji wizualnej.Należy sprawdzić, czy dyspersje uległy destabilizacji lub czy w dyspersjach utworzyły się grudki. Zdjęcia należy wykonywać w regularnych odstępach czasu za pomocą aparatu cyfrowego. Przykładowo, w pierwszym tygodniu zdjęcia dyspersji należy robić codziennie.Następnie co drugi dzień przez tydzień. Kolejno raz w tygodniu przez następne dwa tygodnie, a na koniec raz w miesiącu, zgodnie z potrzebami. Technika małokątnego rozpraszania rentgenowskiego jest wykorzystywana do określenia typu sieci nanostruktury zstabilizowanych cząsteczek lipidowych.Napełnić próbkę w kapilarze kwarcowej o średnicy 1 mm i odpowiednio ją uszczelnić. Następnie umieścić kapilarę w stoliku obiektowym z kontrolą temperatury. Opróżnić komorę z próbką za pomocą pompy próżniowej.Zarejestruj jednowymiarowe wzory rozpraszania za pomocą mikrostripowego detektora rentgenowskiego sterowanego programowo. Po uzyskaniu trzech profili przy czasie ekspozycji 300 sekund, zintegruj te profile i przystąp do analizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Indeksuj wszystkie zarejestrowane wzory dyfrakcyjne przy użyciu grupy przestrzennej PN3M, w której wyraźnie widoczne są refleksy 110, 111, 200, 211, 220 oraz 221.Wysoce lepka lipidowa faza kubiczna jest defragmentowana na cząsteczki przy użyciu sonikacji. Czyste jednościenne lub funkcjonalizowane wielościenne CNT są wykorzystywane jako stabilizatory w celu wytworzenia emulsji olejowo-wodnej o konsystencji płynnej. Aby uzyskać homogeniczne i stabilne emulsje, wymagany jest optymalny stosunek CNT do lipidów.Emulsje z zbyt małą ilością CNT zawierają grudki lipidów. Natomiast emulsje z nadmiarem CNT zawierają grudki lipidowo-CNT. Wzory z rozpraszania rentgenowskiego w małych kątach potwierdzają, że fazy sześcienna PN3M, występująca również w przypadku objętościowego lipidu Phytantriol w nadmiarze wody, jest zachowana w emulsjach stabilizowanych F127, a także we wszystkich emulsjach stabilizowanych CNT.Badania statycznego rozpraszania światła wykazują, że rozkład wielkości kubosomów stabilizowanych przez F127 jest porównywalny z rozkładem wielkości kubosomów stabilizowanych przez CNT, a średnia wielkość cząstek mieści się w zakresie submikronowym. Charakterystyczne pasma G oraz G prime (CNTs) obserwowane w widmach Ramana wykazują przesunięcie w stronę niebieską dla cząstek lipidowych stabilizowanych przez CNT. Świadczy to o możliwym pokryciu CNT cząsteczkami lipidów, co przedstawiono na tym schemacie.Po obejrzeniu tego przeglądu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania hybrydowych cząstek lipidowych z CNT, co zostało zaprezentowane w kilku prostych krokach. Te nanostrukturalne cząstki lipidowe oraz poznanie funkcji cząsteczek w obrębie lipidowego samomontażu, a także na powierzchni CNT, torują drogę do badania hybrydowych nanocząsteczek w terapiach łączonych przeciwko głównym schorzeniom.

facile-preparation-internally-self-assembled-lipid-particles

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Prosta, solidna i skalowalna technika funkcjonalizacji i samodzielnego montażu makroskopowych warstw nanocząstek-ligandów na podłożach bez szablonów jest opisana w tym protokole.

Technika funkcjonalizacji i samoorganizacji makroskopowych warstw monowarstwowych nanocząstek-ligand na podłożach bez szablonów

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Prezentujemy syntezę amfifilowego heksaynu i jego zastosowanie w przygotowaniu nanoarkuszy węglowych na granicy powietrza i wody z samoorganizującej się monowarstwy tych reaktywnych, bogatych w węgiel prekursorów molekularnych.

Przygotowanie nanoarkuszy węglowych w temperaturze pokojowej

Przedstawiono metodę funkcjonalizacji nanorurek węglowych z polimerowymi warstwami enkapsulacyjnymi o zmiennej strukturze oraz charakterystyki strukturalnej za pomocą rozpraszania neutronów pod małym kątem.

Funkcjonalizacja jednościennych nanorurek węglowych z termoodwracalnymi kopolimerami blokowymi i charakterystyka za pomocą rozpraszania neutronów pod małym kątem

Przedstawiono procedurę syntezy wielościennych nanorurek węglowych szczepionych polistyrenem przy użyciu kolejnych etapów modyfikacji chemicznej w celu selektywnego wprowadzania łańcuchów polimerowych do ścian bocznych i ich samoorganizacji poprzez anizotropową niejednolitość.

Szczepienie wielościennych nanorurek węglowych polistyrenem w celu umożliwienia samoorganizacji i niejednolitości anizotropowej

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę przygotowania nanostrukturalnych cząstek hybrydowych z nanorurek węglowych i samoorganizujących się lipidów. Technika ta umożliwia stabilizację emulsji olej-woda o rozmiarze poniżej mikrona z biokompatybilnym rdzeniem kubicznym.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Przeglądaj więcej filmów