Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie i przetestowanie urządzenia mikroprzepływowego wykonanego w całości z polidimetylosuboksanu, które wykorzystuje współosiowe ogniskowanie przepływu do generowania podwójnych emulsji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu chemii i biologii, które wymagają ultra wysokoprzepustowych badań przesiewowych, takich jak ukierunkowana ewolucja enzymów i identyfikacja rzadkich fenotypów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia szybką produkcję generatorów podwójnej emulsji przy użyciu miękkiej litografii bez specjalistycznej obróbki powierzchni.

Na początek zaprojektuj struktury mikroprzepływowe do produkcji dwuwarstwowej. Korzystając z oprogramowania AutoCAD, wydrukuj projekty na folii obwodów drukowanych o rozdzielczości 10 mikronów, jak opisano w przedstawionym tutaj odniesieniu. Nałóż od jednego do dwóch mililitrów SU 8 30 35 na środek wstępnie oczyszczonej płytki krzemowej o średnicy trzech cali na koderze wirującym i przymocuj go do uchwytu.

Wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 2000 obr./min. Wyjmij wafel i piecz go na gorącej płycie o temperaturze 135 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.

Teraz wystaw powlekaną wafel na działanie maski przez pierwszą warstwę pod magazynkowanym światłem LED przez 90 sekund. Po naświetleniu umieść wafel z powrotem na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę. Po schłodzeniu nałóż od jednego do dwóch mililitrów SUH 2050 na środek wafla.

Umieść wafel z powrotem na koderze wirowym i wiruj przez 20 sekund z prędkością 500 obr./min. Następnie wiruj przez 30 sekund z prędkością 1 375 obr./min. Gdy koder wirowy przestanie się obracać, wyjmij wafel i umieść go z powrotem na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na 30 minut.

Następnie schłodzić wafel z powrotem do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku. Dopasuj maskę dla drugiej warstwy do geometrii, która została wzorowana w poprzednich krokach i ponownie wystaw powlekaną płytkę na działanie światła UV przez trzy minuty po naświetleniu, umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę. Po schłodzeniu wywołaj maski, zanurzając płytkę w mieszanej kąpieli glikolu propylenowego, octanu eteru monometylowego.

Po 30 minutach w kąpieli wyjmij wafel i umyj go w izopropanolu. Następnie piecz wafelek na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza przez minutę. Ostudzić wafel, a następnie umieścić rozwiniętego mistrza na 100-milimetrowej szalce Petriego.

Przygotuj partię PDMS, łącząc 50 gramów bazy silikonowej z pięcioma gramami utwardzacza w plastikowym kubku. Za pomocą narzędzia obrotowego wyposażonego w patyczek do mieszania wymieszaj składniki, a następnie odgazowuj mieszaninę wewnątrz osuszacza przez około 30 minut lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte. Następnie wylej PDMS na mistrza na grubość trzech milimetrów.

Następnie umieść szalkę Petriego w osuszaczu w celu dalszego odgazowania. Po usunięciu wszystkich bąbelków piecz urządzenie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Odetnij urządzenie PDMS z formy za pomocą skalpela i umieść je na czystej powierzchni stroną ze wzorem do góry.

Następnie przetnij PDMS na pół żyletką, aby oddzielić dwie strony urządzenia na elemencie zawierającym 50-mikrometrową geometrię obsługi płynów wydrukowaną przez mistrza pierwszego. Przebij wloty i wyloty płynów za pomocą 0,75 milimetra stempla biopsyjnego. Następnie umieść kawałki PDMS wzorzystymi bokami do góry w komorze plazmowej.

Potraktuj urządzenie plazmą tlenową o ciśnieniu jednego milibara przez 60 sekund w 300-watowym odkurzaczu plazmowym. Następnie usuń próbki i zwilż powierzchnię niehartowanego kawałka PDMS kroplą wody DI, aby służyła jako tymczasowy smar podczas oglądania urządzenia przez mikroskop stereoskopowy. Umieść powierzchnie poddane obróbce plazmowej razem i przesuwaj powierzchnie, aż do uzyskania blokady mechanicznej.

Gdy wpuszczane ramki i wystające ramki połączą się ze sobą, po zmontowaniu umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza i piecz przez dwa dni, aby odparować wodę i zakończyć wiązanie. Następnie przymocuj zmontowane urządzenie do szkiełka za pomocą kilku kropli nieutwardzonego PDMS, piecz konstrukcję w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby utwardzić PDMS, chip mikroprzepływowy na stoliku odwróconego mikroskopu sprzężony z kamerą cyfrową, która jest w stanie ustawić czas otwarcia migawki co najmniej 100 mikrosekund.

Następnie zamontuj trzy 10-mililitrowe strzykawki na pompach strzykawkowych i przymocuj do każdej z nich 27 igieł. Przymocuj około 30 centymetrów dwóch rurek PE do każdej z igieł i włóż luźne końce rurek do odpowiednich wybitych otworów w urządzeniu. Następnie włóż 10-centymetrowy PE dwa do portu wyjściowego urządzenia, a drugi koniec umieść w pojemniku na odpady.

Po skonfigurowaniu zalej urządzenie, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużą prędkością. Zatrzymaj pompy. Gdy płyn w segmentach rurki dotrze do portów wlotowych urządzenia, skoncentruj mikroskop na obszarze chipa, który zawiera otwór o wymiarach 50 na 50 mikrometrów i wyreguluj ramkę tak, aby zawierała dolny kanał wyjściowy

Ustaw pompy strzykawkowe tak, aby dostarczały płyn do podwójnego generatora emulsji z natężeniem przepływu 250 mikrolitrów na godzinę dla fazy wewnętrznej, 100 mikrolitrów na godzinę dla fazy środkowej i 700 mikrolitrów na godzinę. Do fazy ciągłej. Odczekaj 10 minut, aż system się zrównoważy.

Następnie zwiększ natężenie przepływu fazy zewnętrznej do 1050 mikrolitrów na godzinę. Poczekaj dodatkowe trzy do pięciu minut, aż podwójne emulsje ustabilizują się w tym zestawie warunków przepływu. Po ustabilizowaniu utrwal się pięciosekundowym obrazem wideo z częstotliwością 30 Hz.

Zapisz filmy do przetwarzania w trybie offline za pomocą ręcznej analizy obrazu. Powtórzyć ten proces, zmieniając natężenie przepływu fazy zewnętrznej, korzystając z wartości znajdujących się w tabeli pierwszej dołączonego protokołu tekstowego. Utrzymuj tempo fazy wewnętrznej i środkowej.

Podczas tego procesu urządzenie z podwójną emulsją zostało przetestowane w różnych warunkach przepływu. Aby zademonstrować tworzenie podwójnych emulsji mono rozproszonych o różnej wielkości, stosunek fazy ciągłej do sumy fazy wewnętrznej i środkowej jest pokazany powyżej każdego obrazu. Histogramy średnic kropel dla wybranych współczynników przepływu pokazują względną jednorodność wielkości wytwarzanych kropel.

Powstałe podwójne emulsje wytwarzają średnią zmianę współczynnika średnicy wynoszącą 5,2%Urządzenie wykazuje zdolność do tworzenia podwójnych emulsji znacznie mniejszych niż szerokość kryzy i wykazuje wyraźną tendencję spadkową wraz ze wzrostem współczynników przepływu. W najwyższej badanej fazie nośnej utworzono podwójne emulsje o wymiarach 14 mikrometrów przy użyciu otworu o wymiarach 50 na 50 mikrometrów Po jego opracowaniu. Technika ta toruje drogę badaczom chemicznym i biologicznym do przeprowadzania eksperymentów mikrofluidycznych kropelkowych, które są kompatybilne ze standardowymi platformami detekcji cytometrii przepływowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać i testować mikroprzepływowe, podwójne generatory emulsji, które wykorzystują proste techniki budowy PDMS.