Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbudowanie i przetestowanie mikrofluidycznego urządzenia wykonanego w całości z polidimetylosiloksanu, które wykorzystuje koaksjalną ogniskowanie przepływu do generowania podwójnych emulsji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chemii i biologii wymagające przesiewania o ultrawysokiej przepustowości, takich jak ukierunkowana ewolucja enzymów oraz identyfikacja rzadkich fenotypów. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie szybkiej produkcji generatorów podwójnych emulsji przy użyciu litografii miękkiej, bez konieczności stosowania specjalistycznych obróbek powierzchniowych.

Aby rozpocząć, należy zaprojektować struktury mikroprzepływowe dla dwuwarstwowego procesu wytwarzania. Korzystając z oprogramowania AutoCAD, należy wydrukować projekty na folii do obwodów drukowanych z rozdzielczością 10 mikronów, zgodnie z opisem w przywołanej tutaj referencji. Na środek uprzednio oczyszczonego wafla krzemowego o średnicy trzech cali, umieszczonego na powlekaczu wirówkowym i przymocowanego do uchwytu, należy nanieść od jednego do dwóch mililitrów SU 8 30 35.

Wirować przez 20 sekund przy 500 RPM, a następnie przez 30 sekund przy 2000 RPM. Wyjąć wafer i wypiekać go na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut. Pozostawić wafer do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.

Następnie naświetlaj powleczony wafer przez maskę pierwszej warstwy pod kolimowanym światłem LED przez 90 sekund. Po naświetleniu umieść wafer z powrotem na płycie grzewczej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę. Po ochłodzeniu nanieś od jednego do dwóch mililitrów SUH 2050 na środek wafera.

Umieść wafelek z powrotem w spin coderze i wiruj przez 20 sekund przy 500 RPMs. Następnie wiruj przez 30 sekund przy 1 375 RPMs. Po zatrzymaniu spin codera wyjmij wafelek i umieść go ponownie na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 30 minut.

Następnie schłodź wafelek z powrotem do temperatury pokojowej przed przejściem do kolejnego kroku. Dopasuj maskę dla drugiej warstwy do geometrii uformowanej w poprzednich krokach i ponownie naświetl powleczony wafelek światłem UV przez trzy minuty; po naświetlaniu umieść wafelek na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na jedną minutę. Po ostygnięciu wywołaj maski, zanurzając wafelek w mieszanej kąpieli z octanem glikolu propylenu, monometylkowego eteru.

Po 30 minutach w kąpieli wyjmij wafer i przemyj go izopropanolem. Następnie wypal wafer na płycie grzewczej o temperaturze 135 °C przez jedną minutę. Ostudź wafer, a następnie umieść wywołany wzorzec w 100 mm czarce Petriego.

Przygotuj partię PDMS, łącząc 50 gramów bazy silikonowej z pięcioma gramami utwardzacza w plastikowym kubku. Użyj narzędzia rotacyjnego z zamontowaną mieszadłową końcówką, aby wymieszać składniki, a następnie odgazuj mieszaninę w deskrypcie przez około 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Następnie wylej PDMS na matrycę do grubości trzech milimetrów.

Następnie umieść szalkę Petriego w eksykatorze w celu dalszego odgazowania. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza wypiecz urządzenie w temperaturze 60 °C przez dwie godziny. Wytnij urządzenie z PDMS z formy za pomocą skalpela i połóż je na czystej powierzchni stroną z wzorem do góry.

Następnie przetnij PDMS na pół za pomocą żyletki, aby rozdzielić dwie strony urządzenia na fragmencie zawierającym geometryczne struktury do prowadzenia płynów o rozmiarze 50 mikrometrów odciśnięte z pierwszej matrycy. Wykonaj otwory wlotowe i wylotowe układu mikroprzepływowego za pomocą biopsyjnego dziurkacza o średnicy 0,75 milimetra. Następnie umieść fragmenty PDMS stroną z wzorem skierowaną do góry w komorze plazmowej.

Poddaj urządzenie działaniu plazmy tlenowej przy ciśnieniu 1 mbar przez 60 sekund w czyszczarce plazmowej o mocy 300 W. Następnie wyjmij próbki i zwilż powierzchnię nieutwardzonego fragmentu PDMS kroplą wody DI, aby służyła ona jako tymczasowy lubrykant podczas oglądania urządzenia pod mikroskopem stereoskopowym. Złóż ze sobą powierzchnie potraktowane plazmą i przesuń je względem siebie, aż do uzyskania blokady mechanicznej.

Gdy ramki wgłębne i wypukłe zostaną dopasowane, po zmontowaniu urządzenia umieść je w piecu w temperaturze 60 °C i wypalaj przez dwa dni, aby odparować wodę i zakończyć proces wiązania. Następnie przytwierdź zmontowane urządzenie do szkiełka przedmiotowego, używając kilku kropel nieutwardzonego PDMS, i wypalaj konstrukcję w piecu w temperaturze 60 °C przez jedną godzinę. Aby utwardzić PDMS, umieść chip mikroprzepływowy na stole mikroskopu odwróconego połączonego z kamerą cyfrową, która umożliwia zastosowanie czasu naświetlania wynoszącego co najmniej 100 µs.

Następnie zamocuj trzy strzykawki o pojemności 10 ml na pompach strzykawkowych i przymocuj do każdej z nich igły o rozmiarze 27G. Do każdej z igieł podłącz około 30 cm rurki PE 2 i wprowadź wolne końce rurek do odpowiednich otworów w urządzeniu. Następnie wprowadź odcinek rurki PE 2 o długości 10 cm do portu wylotowego urządzenia, a drugi koniec umieść w pojemniku na odpady.

Po przygotowaniu urządzenia należy je zaprawić, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużą prędkością. Następnie należy zatrzymać pompy. Gdy ciecz w odcinkach przewodów dotrze do portów wlotowych urządzenia, należy ustawić ostrość mikroskopu na obszarze chipa zawierającym otwór o wymiarach 50 by 50 micrometer i dostosować kadr tak, aby obejmował on znajdujący się poniżej kanał wylotowy.

Ustaw pompy strzykawkowe tak, aby dostarczały ciecz do generatora podwójnej emulsji z szybkością przepływu 250 µL/h dla fazy wewnętrznej, 100 µL/h dla fazy środkowej oraz 700 µL/h dla fazy ciągłej. Odczekaj 10 minut, aż system osiągnie stan równowagi.

Następnie zwiększ przepływ fazy zewnętrznej do 1050 µL/h. Odczekaj dodatkowe trzy do pięciu minut, aż generowanie podwójnych emulsji ustabilizuje się w tych warunkach przepływu. Po stabilizacji zarejestruj pięć sekund obrazów wideo przy częstotliwości 30 Hz.

Zapisz filmy do późniejszej obróbki offline poprzez ręczną analizę obrazu. Powtórz ten proces, zmieniając szybkość przepływu fazy zewnętrznej zgodnie z wartościami podanymi w tabeli 1 towarzyszącego protokołu tekstowego. Zachowaj stałe szybkości przepływu fazy wewnętrznej i środkowej.

Podczas tego procesu urządzenie do tworzenia podwójnych emulsji testowano przy różnych warunkach przepływu. Aby zademonstrować tworzenie monodyspersyjnych podwójnych emulsji o różnych rozmiarach, nad każdym obrazem przedstawiono stosunek fazy ciągłej do sumy fazy wewnętrznej i środkowej. Histogramy średnic kropel dla wybranych stosunków przepływu wykazują względną jednorodność rozmiarów generowanych kropel.

Otrzymane podwójne emulsje charakteryzują się średnim współczynnikiem zmienności średnicy wynoszącym 5,2%. Urządzenie wykazuje zdolność do tworzenia podwójnych emulsji o rozmiarach znacznie mniejszych niż szerokość otworu, wykazując wyraźną tendencję spadkową wraz ze wzrostem stosunku przepływów. Przy najwyższym przetestowanym przepływie fazy nośnej, przy użyciu otworu o wymiarach 50 by 50 mikrometrów, utworzono podwójne emulsje o rozmiarze 14 mikrometrów. Po opracowaniu technika ta otwiera przed badaczami z zakresu chemii i biologii drogę do przeprowadzania eksperymentów z mikrofluidyką kropelkową, które są kompatybilne ze standardowymi platformami detekcji cytometrii przepływowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wytwarzać i testować mikrofluidalne generatory podwójnych emulsji, w których zastosowano proste techniki konstrukcyjne oparte wyłącznie na PDMS.