Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej
December 31st, 2015
Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest stworzenie modelu organotypowego, który naśladuje mikrośrodowisko otrzewnej, aby lepiej zrozumieć biologię raka jajnika. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka jajnika, takie jak to, w jaki sposób interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem przyczyniają się do patogenezy choroby oraz jak można testować potencjalne inhibitory tych interakcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że rzeczywiste pierwotne komórki ludzkie, które tworzą powierzchnie linii międzybłonka w jamie mięśniowej mięśnia święceń, są wykorzystywane w kohodowli komórek raka jajnika.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w raka jajnika, może być również stosowana do badania innych nowotworów, które rozprzestrzeniają się w jamie otrzewnej, takich jak rak żołądka, trzustki i jelita grubego. Po pobraniu chirurgicznej próbki ludzkiej sieci natychmiast zanurz próbkę w PBS o temperaturze pokojowej. W ciągu dwóch godzin od zanurzenia przenieś sieć do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 20 mililitrów świeżego PBS, przenieś pozostały płyn do płukania PBS zawierający pierwotne ludzkie komórki międzybłonka lub HPMC i czerwone krwinki do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki i odwiruj komórki.
Następnie wlej zawartość probówki do 10-centymetrowego sterylnego naczynia hodowlanego i użyj dwóch skalpeli, aby zmielić tkankę na pięć milimetrowych kawałków. Aby wyizolować pierwotne ludzkie komórki międzybłonka lub HPMC, przenieś kawałki sieci do 50-mililitrowej stożkowej rurki i odczekaj minutę. Aby stałe kawałki unosiły się na górze, HPMC osiądzie na dnie probówki z czerwonymi krwinkami.
Za pomocą pipety przenieść płyn do płukania PBS zawierający komórki międzybłonka i krwinki czerwone do probówki zawierającej komórki granulowane i odwirować komórki. Następnie dodaj 20 mililitrów świeżego PBS do sieci i zbierz PBS zawierający HPMC i RB C3 więcej razy, co po prostu pokazano oryginalnym granulowanym komórkom. Po ostatniej płytce wirowej komórki w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pełnej pożywki wzrostowej.
Aby wyizolować dodatkowy HPMC z próbki sieci moczowej, wstrząśnij pozostałą tkanką stałą w 20 mililitrach PBS przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Po 10 minutach odstawić próbkę na jedną minutę, aby tkanka stała mogła wznieść się do górnej części probówki. Następnie zbierz HPMC i RBC z dna probówki, jak właśnie pokazano.
Teraz odwiruj komórki z tego wtórnego prania i umieść je w osobnej kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pełnego podłoża wzrostowego. Aby wyizolować pozostały HPMC, potrząsaj tkanką przez kolejne 10 minut, tym razem w mieszaninie PBS i 10 mililitrów tripsin EDTA i umieść te HPMC i RBC w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, a następnie inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym środowisku, karmiąc posiane komórki 15 mililitrami świeżego, Pełne podłoże wzrostowe w trzecim i piątym dniu bez usuwania zużytego podłoża. HPMC można zidentyfikować po ich prostopadłościennym kształcie i ekspresji cytokeratyny ósemki i mentonu.
Aby wyizolować normalne fibroblasty sieci oczywistej, potraktować pozostałą rozdrobnioną tkankę sieci 10 mililitrami świeżo przygotowanego 10 x roztworu kolagenazy typu trzy rozcieńczonego w pożywce wolnej od surowicy przez sześć godzin z wytrząsaniem pod koniec okresu inkubacji, strawiona tkanka stanie się nieprzezroczysta roztworem zawierającym pewne włókniste szczątki, odwirować normalną zawiesinę fibroblastów sieci komórkowej, A potem kultura. Komórki w 13 mililitrach pełnego podłoża wzrostowego. Po 24 godzinach zastąp starą pożywkę 15 mililitrami świeżej, pełnej pożywki.
Normalne fibroblasty sieci można rozpoznać po ich płaskim, wydłużonym kształcie, ekspresji wimentyny i braku ekspresji pomocy cytokeratyny. Aby uwolnić normalne fibroblasty sieci z hodowli, przepłucz kolbę hodowlaną 10 mililitrami PBS, a następnie trzema mililitrami trypsyny przez nie więcej niż pięć minut. Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę co najmniej trzykrotną objętością pełnej pożywki wzrostowej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
Zakręć komórki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pełnego podłoża wzrostowego. Następnie policz komórki i rozcieńcz je od dwóch do czterech razy 10 do trzeciego fibroblastu na 100 mikrolitrów pełnego wzrostu, średnie stężenie. Następnie dodaj 0,5 mikrograma na 100 mikrolitrów kolagenu z ogona szczura, jeden do komórek i umieść 100 mikrolitrów komórek na studzienku na czarnej, przezroczystej płytce 96-dołkowej z dnem.
Następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na co najmniej cztery godziny lub do momentu, gdy komórki przylegają do powierzchni płytki, podczas gdy fibroblasty o normalnym pędzie osiadają. Odłączyć HPMC od kolb hodowlanych i rozcieńczyć te komórki do jednego do dwóch razy od 10 do czwartego HPMC na 50 mikrolitrów pełnej pożywki wzrostowej. Następnie dodać 50 mikrolitrów HPMC na studzienkę do dołączonych normalnych fibroblastów sieci i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na co najmniej 18 godzin przed eksperymentem.
Następnego dnia należy użyć nasion, 3D ORGANOTYPOWYCH kultur ko, z GFP wykazujących ekspresję komórek raka jajnika z 80 do 90% zlewającej się hodowli w odpowiednim rozcieńczeniu dla pożądanego dalszego testu, peptydu RGD i przeciwciał blokujących przeciwko alfa pięć, beta jeden i alfa pięć. Beta trzecia. Integryny hamują adhezję komórek raka jajnika do hodowli organotypowej, podczas gdy peptyd RAD oraz przeciwciała kontrolne i integryny beta cztery nie.
Peptyd RRG D i przeciwciała blokujące przeciwko integrynie alfa pięć i beta jeden również hamują proliferację komórek raka jajnika w kulturze organotypowej, podczas gdy peptyd RAD i kontrolne przeciwciała integryny alfa pięć, beta trzy i beta cztery nie. Ponadto peptyd RGD i przeciwciała blokujące przeciwko integrynie alfa pięć i beta jeden hamują inwazję hodowli 3D ORGANOTYPOWYCH komórek raka jajnika. Podczas gdy przeciwciało integryny alfa pięć beta trzy wzmacnia ten proces, zgodnie z oczekiwaniami na podstawie danych z testów adhezji i proliferacji, peptyd RAD i przeciwciała kontrolne oraz integryny beta cztery również nie wykazywały wpływu na inwazję komórek rakowych.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu do 12 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze korzystać z szafy bezpieczeństwa biologicznego i odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym fartucha laboratoryjnego i rękawic zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak testy adhezji, inwazji i proliferacji, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji komórek rakowych z mikrośrodowiskiem po ich rozwoju.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem jajnika do zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko wpływa na interakcje komórek rakowych z ludzkimi komórkami jamy otrzewnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki pierwotne od ludzkiego pędu i jak zbudować organotypową kulturę wyściółki mięśnia peral
.View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej z wykorzystaniem pierwotnych ludzkich komórek mezotelialnych i fibroblastów. Model ten służy jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania nad rakiem jajnika
- Biologia komórki
- Modelowanie in vitro
Tło
- Środowisko otrzewnej odgrywa kluczową rolę w biologii raka jajnika.
- Rozumienie interakcji między komórkami rakowymi a ich mikrośrodowiskiem jest istotne dla patogenezy choroby.
- Model ten może być również stosowany do innych nowotworów rozprzestrzeniających się w jamie otrzewnej.
- Pierwotne ludzkie komórki są używane do stworzenia bardziej dokładnego przedstawienia mezoteliomu.
Cel badania
- Opracowanie organotypowego modelu, który naśladuje mikrośrodowisko otrzewnej.
- Zbadanie, jak interakcje komórek rakowych z mikrośrodowiskiem przyczyniają się do raka jajnika.
- Testowanie potencjalnych inhibitorów tych interakcji.
Stosowane metody
- Pobranie chirurgicznych próbek sieroci z ludzkiego otrzewnej.
- Zanurzenie próbek w PBS w celu ekstrakcji komórek.
- Izolacja pierwotnych ludzkich komórek mezotelialnych poprzez wirowanie.
- Współhodowla komórek raka jajnika z izolowanymi komórkami.
Główne wyniki
- Model z powodzeniem naśladuje mikrośrodowisko otrzewnej.
- Uzyskano wgląd w zachowanie komórek raka jajnika.
- Technikę tę można zaadaptować do badania innych nowotworów otrzewnej.
- W tym modelu można testować potencjalne inhibitory.
Wnioski
- Ten model in vitro jest cennym narzędziem do badania raka jajnika.
- Poprawia rozumienie interakcji komórek rakowych z mikrośrodowiskiem.
- Metodologia może być stosowana do innych nowotworów dotyczących jamy otrzewnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Modeling early ovarian cancer dissemination in a human organotypic peritoneal culture addresses a critical gap in recapitulating disease-relevant metastatic processes for discovery-stage research. This system enables mechanistic de-risking and predictive confidence in evaluating cancer cell-microenvironment interactions and anti-metastatic strategies. Its translational alignment supports portfolio decisions at the interface of target validation and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation in a physiologically relevant microenvironment.
- Supports mechanistic de-risking by modeling human peritoneal interactions with primary cells.
- Facilitates functional target validation for anti-metastatic interventions.
- Provides predictive confidence for triaging candidate inhibitors of dissemination.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D co-culture systems for quantitative adhesion, invasion, and proliferation assays.
- Enables high-throughput screening of candidate compounds targeting metastatic processes.
- Supports assay reproducibility and standardization using primary human cells.
- Allows reliable evaluation of integrin-blocking agents and peptide inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant metastatic pathways for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from in vitro discovery to preclinical validation of anti-metastatic strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated microenvironmental efficacy.
- Supports adaptation to other peritoneal-disseminating cancers as justified by the model.
Pipeline & Workflow Integration
This organotypic culture model bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of metastatic mechanisms and candidate inhibitors in a human-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cell-microenvironment interactions and integrin-mediated dissemination.
- Screening: Provides a platform for quantitative, reproducible adhesion and invasion assays.
- Analytics: Delivers measurable outputs for comparing inhibitor efficacy and mechanistic impact.
- Translational Research: Facilitates alignment with clinical metastatic processes for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable model for multiple cancer types disseminating in the peritoneal cavity.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metastatic modeling.
- Operational Value: Standardizes 3D co-culture workflows and supports scalable screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for anti-metastatic candidates and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and preclinical assets targeting dissemination.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and 3D co-culture techniques.
- Demands access to surgical human omentum specimens and cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible assay outputs.
- Adaptation to other cancer types requires validation of microenvironmental relevance.
- Practical limitations include specimen availability and technical mastery of cell isolation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Primary Human Mesothelial Cell (HPMC) Isolation and Culture
3:57
Normal Omentum Fibroblast (NOF) Isolation and Culture
4:54
Organotypic Culture Plating
6:47
Results: The Role of Integrins in Ovarian Cancer Cell Adherence, Proliferation and Invasion
7:59
Conclusion
