Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest śledzenie procesów enzymatycznych w czasie rzeczywistym przy użyciu magnetycznego rezonansu jądrowego wzmocnionego dynamiczną polaryzacją jąder. Rezonans magnetyczny w stanie ciekłym wzmocniony dynamiczną polaryzacją jąder, DNP, może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania: jak określić, na przykład, szybkość transformacji enzymatycznej pary cząsteczek w komórce lub in vivo bez konieczności jakiejkolwiek modyfikacji tej pary cząsteczek. Instalacja sprzętu do DNP z rozpuszczaniem w naszym laboratorium oraz przybycie dr. Riccarda Balzana, doktora z laboratorium Arnaud Comment w Lozannie, stanowią wielki krok naprzód w naszych badaniach.

DNP znacząco zwiększa czułość eksperymentów, które możemy przeprowadzać na naszych spektrometrach NMR o częstotliwości 500 MHz. Ten sprzęt DNP był pierwszym zainstalowanym we Francji i chciałbym zaznaczyć, że w procesie uruchamiania tego urządzenia zaangażowani byli wszyscy członkowie naszego zespołu NMR, a w szczególności Gildas Bertho, nasz inżynier badawczy, oraz Fatiha Kateb, nasza maitre de conférences. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią, w czasie rzeczywistym, kwantyfikację substratu i jego endogennych pochodnych z rozdzielczością czasową rzędu sekund.

W celu przygotowania roztworu polaryzującego, przygotuj dwa mililitry 1,12 molarnego roztworu pirogronianu sodu znakowanego węglem 13, domieszkowanego 33 milimolarnie rodnikiem TEMPO, w objętościach deuterowanej wody do deuterowanego etanolu w stosunku dwa do jednego dla obserwacji węgla 13. Obniż temperaturę kriostatu do dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) za pomocą procedury schładzania, klikając przycisk cooldown w interfejsie oprogramowania kriostatu. Napełnij kriostat DNP ciekłym hellem poprzez procedurę napełniania.

Kliknij przycisk napełniania w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie umieść 300 µL zoptymalizowanego roztworu polaryzacyjnego w pojemniku na próbkę dołączonym do polaryzatora DNP. Zamroź pojemnik wraz z zawartością, delikatnie zanurzając go w kąpieli z ciekłym azotem.

Usuń ciekły azot, który może znajdować się w pojemniku z próbką po procedurze zamrażania, wyjmując pojemnik z kąpieli w ciekłym azocie i obracając go do góry dnem. Następnie wprowadź próbkę do kriostatu, najpierw umieszczając pojemnik z próbką w uchwycie na próbki. Potem umieść uchwyt na próbki w głównym wkładzie kriostatu, a następnie wprowadź falowód mikrofalowy do uchwytu na próbki.

Obniż temperaturę kriostatu, uruchamiając procedurę chłodzenia o jeden kelwin. Kliknij przycisk chłodzenia o jeden kelwin w interfejsie oprogramowania kriostatu. Włącz źródło mikrofal i napromieniuj próbkę, klikając przycisk włączania mikrofal w interfejsie oprogramowania kriostatu.

Odłącz kabel koncentryczny kanału detekcji konsoli NMR od cewki spektrometru, obracając złącze o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyciągając je. Podłącz kabel koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego kriocewki NMR. Następnie włóż złącze męskie kabla konsoli NMR do złącza żeńskiego kriocewki NMR, zwracając uwagę na pin pozycjonujący.

Mocno dociśnij i obróć złącze o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Zmierz termiczny sygnał NMR w stanie stałym w miejscu kriostatu, stosując prostą sekwencję impuls-akwizycja z niekalibrowanymi impulsami o niskim kącie odchylenia (flip angle), powtarzanymi w odstępach t równych pięciu minutom. Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania i naciśnij enter na klawiaturze.

Po rozpoczęciu procedury polaryzacji, zmierz wzmocniony przez DNP sygnał NMR w stanie stałym, stosując tę samą procedurę i warunki, które zostały użyte do pomiaru sygnału termicznego. Odłącz koncentryczny kabel kanału detekcji konsoli NMR od cewki NMR kriostatu, obracając złącze o 90 stopni przeciwnie do ruchu wskazówek zegara i wyciągając je. Następnie podłącz kabel koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki spektrometru.

Włóż wtyk męski kabla konsoli NMR do gniazda żeńskiego cewki spektrometru, zwracając uwagę na pin orientacyjny. Dociśnij mocno i obróć złącze o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Przygotuj świeży roztwór LDH z mięśni królika o stężeniu 1 unit/mL w buforze reakcyjnym z dodatkiem 20 µg/mL albuminy surowicy bydlęcej.

Następnie zmieszaj 478 µL buforu reakcyjnego, 2 µL roztworu LDH oraz 20 µL wody deuterowanej, aby umożliwić stabilizację (blokowanie) pola spektrometru. Następnie przelej 500 µL roztworu do probówki NMR o średnicy 5 mm. Podłącz probówkę transferową do zautomatyzowanego, wykonanego na zamówienie urządzenia wtryskowego, które oddziela hiperpolaryzowany roztwór od helu używanego do transferu.

Urządzenie automatycznie dozuje 500 µL hiperpolaryzowanego roztworu do probówki z próbką. Przed rozpuszczaniem umieść pięciomilimetrową probówkę NMR zawierającą 500 µL próbki w izocentrum spektrometru NMR o indukcji 11,74 tesla. Wlej 5 mL wody deuterowanej do bojlera wkładu do rozpuszczania.

Zwiększ ciśnienie i podgrzej wodę deuterowaną za pomocą drutu oporowego, aż temperatura osiągnie około 180 do 200 stopni Celsjusza, klikając przycisk prepare heater w interfejsie oprogramowania kriostatu. Kliknij przycisk SS Operations w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie wyjmij prowadnicę mikrofalową z wkładu do rozpuszczania.

Wsuń wkład do rozpuszczania w dół do uchwytu na próbkę. Wkład do rozpuszczania musi dotrzeć do dna uchwytu i zostać mocno dociśnięty, aby zapewnić szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę, co zapobiegnie wyciekowi wody deuterowanej do kriostatu. Naciśnij wyzwalacz sprzętowy, aby rozpocząć sekwencję rozpuszczania, która jest zaprogramowaną w czasie sekwencją operacji zaworów pneumatycznych.

Bezpośrednio po rozpuszczeniu urządzenie wstrzykujące miesza 500 µL roztworu hiperpolaryzowanego z próbką umieszczoną w spektrometrze NMR. Po rozpuszczeniu należy zmierzyć hiperpolaryzowany sygnał NMR z próbki w spektrometrze, stosując serię sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia (flip angle) 10 stopni w odstępach 1,5 s, aby śledzić przebieg magnetyzacji substratu i produktu. Po skonfigurowaniu pomiaru należy wpisać zg w wierszu poleceń oprogramowania i nacisnąć enter.

Po całkowitym rozluźnieniu namagnesowania, zmierz termiczny sygnał NMR za pomocą serii sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia 90 stopni, rozdzielonych odstępami około trzech minut, co odpowiada około 3T1. Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania, a następnie naciśnij klawisz enter. Przedstawiony tutaj przebieg czasowy widm uzyskanych z powtarzających się impulsów z kątem odchylenia 10 stopni pokazuje czułość i rozdzielczość czasową tej techniki.

Po identyfikacji pików substratu pirogronianowego i produktu mleczanowego, ilościowe oznaczenie przeprowadzono poprzez całkowanie sygnałów metabolitów. Aktywność enzymatyczną określono na podstawie przebiegu sygnału produktu w czasie, dopasowując go do modelu liniowego. W celu walidacji pomiaru, tę samą wartość oceniono na podstawie początkowej szybkości reakcji, wyznaczonej z proporcji sygnałów produktu i substratu.

Po opanowaniu tej metody, pełny pomiar aktywności enzymatycznej można przeprowadzić w ciągu około dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo rozumieć, jak przygotować silnie spolaryzowany substrat do NMR, wstrzyknąć go do roztworu zawierającego enzym oraz monitorować aktywność enzymatyczną przy użyciu NMR z wzmocnieniem DNP. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest staranne przygotowanie roztworu enzymatycznego ze świeżym enzymem i kosubstratami oraz unikanie powstawania pęcherzyków powietrza w probówce z próbką.

Dzięki rozwojowi rezonansu magnetycznego z wzmocnieniem DNP w stanie ciekłym, badacze mogą teraz badać pobieranie substratu oraz jego transformację enzymatyczną wewnątrz różnych typów komórek poprzez pomiar szybkości powstawania produktu. Należy pamiętać, że praca z urządzeniami kriogenicznymi i wysokimi polami magnetycznymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tych pomiarów zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej przed kriogenami oraz weryfikacja braku przedmiotów magnetycznych.

W przeciwieństwie do klasycznego NMR, spektroskopia NMR oparta na DNP z rozpuszczaniem jest ograniczona do okna czasowego eksperymentu wynoszącego maksymalnie kilka minut, w zależności od substratu i aktualnego stanu życia. Stanowi to przeszkodę w wyjściu poza jednowymiarową spektroskopię. NMR z DNP z rozpuszczaniem wymaga dalszego rozwoju, aby osiągnąć poziom wszechstronności charakterystyczny dla klasycznego NMR wielowymiarowego.