Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR
23 lutego 2016
Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest śledzenie procesów enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej wzmocnionej magnetycznym rezonansem jądrowym. Rezonans magnetyczny w stanie ciekłym wzmocniony dynamiczną polaryzacją jądrową (DNP) może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania: jak określić na przykład szybkość przemian enzymatycznych pary cząsteczek w komórce lub in vivo bez konieczności jakiejkolwiek zmiany tej pary cząsteczek w jakikolwiek sposób. Zainstalowanie naszego sprzętu do rozpuszczania DNP w naszym laboratorium i przybycie tutaj dr Riccardo Balzana, doktora w Arnaud Comment Laboratory w Lozannie, jest dużym krokiem naprzód dla naszych badań.
DNP znacznie zwiększa czułość eksperymentów, które możemy przeprowadzić na naszych 500-megahercowych spektrometrach NMR. Ten sprzęt DNP był pierwszym, który został zainstalowany we Francji i chciałbym wspomnieć, że w zapewnienie funkcjonalności tego sprzętu zaangażowani byli wszyscy członkowie naszego zespołu NMR, a w szczególności chciałbym wspomnieć o Gildasie Bertho, naszym inżynierze badawczym, i Fatiha Kateb, naszej maitre de conferences. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednią kwantyfikację w czasie rzeczywistym substratu i jego endogennych pochodnych z rozdzielczością czasową wynoszącą sekundy.
Do roztworu polaryzującego przygotuj dwa mililitry 1,12-molowego, znakowanego węglem 13 roztworu pirogronianu sodu domieszkowanego 33 milimolowym rodnikiem TEMPO w objętości dwa do jednego deuterowanej wody do deuterowanego etanolu do obserwacji węgla 13. Obniż temperaturę kriostatu dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) za pomocą procedury schładzania, klikając przycisk schładzania w interfejsie oprogramowania kriostatu. Zebrać ciekły hel w kriostacie DNP podczas procedury napełniania.
Kliknij przycisk napełniania w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie umieść 300 mikrolitrów zoptymalizowanego roztworu polaryzacyjnego w pojemniku na próbkę dostarczonym z polaryzatorem DNP. Zamrozić pojemnik na próbkę z próbką w środku, delikatnie zanurzając go w kąpieli ciekłego azotu.
Usunąć ciekły azot, który może znajdować się w pojemniku na próbkę po procedurze zamrażania, ekstrahując pojemnik na próbkę z kąpieli ciekłego azotu i obracając go do góry nogami. Następnie włóż próbkę do kriostatu, wkładając najpierw pojemnik na próbkę do uchwytu na próbkę. Następnie umieść uchwyt próbki w głównej wkładce kriostatu przed włożeniem falowodu kuchenki mikrofalowej do uchwytu na próbkę.
Obniż temperaturę kriostatu, rozpoczynając procedurę chłodzenia o wartości jednego kelvina. Kliknij jeden przycisk chłodzenia w stopniach Kelvina w interfejsie oprogramowania kriostatu. Włącz źródło mikrofal i naświetlaj próbkę, klikając przycisk włączania mikrofal w interfejsie oprogramowania kriostatu.
Odłącz koncentryczny kanału detekcji konsoli NMR od cewki spektrometru, obracając złącze w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90 stopni i pociągając je. Podłącz koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki kriostatu NMR. Następnie włóż męskie złącze konsoli NMR do żeńskiego złącza cewki kriostatu NMR, zwracając uwagę na pin orientacyjny.
Mocno dociśnij i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90 stopni. Zmierz sygnał termiczny NMR w stanie stałym w miejscu kriostatu za pomocą prostej sekwencji akwizycji impulsów z nieskalibrowanymi impulsami o niskim kącie obrotu powtarzanymi w odstępie t równym pięciu minutom. Po ustawieniu pomiaru należy wpisać zg w wierszu poleceń oprogramowania i nacisnąć enter na klawiaturze.
Po zainicjowaniu procedury polaryzacji zmierz wzmocniony DNP sygnał NMR w stanie stałym przy użyciu tej samej procedury i warunków, które są używane do pomiaru sygnału termicznego. Odłącz koncentryczny kanału wykrywania konsoli NMR od cewki kriostatu NMR, obracając złącze w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90 stopni i pociągając je. Następnie podłącz koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki spektrometru.
Włóż męskie złącze konsoli NMR do żeńskiego złącza cewki spektrometru, zwracając uwagę na pin orientacyjny. Mocno dociśnij i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90 stopni. Świeżo przygotować roztwór LDH z mięśni królika w ilości jednej jednostki na mililitr w buforze reakcyjnym z 20 mikrogramami na mililitr albuminy surowicy bydlęcej.
Następnie wymieszaj 478 mikrolitrów buforu reakcyjnego, 2 mikrolitry roztworu LDH i 20 mikrolitrów deuterowanej wody, aby umożliwić stabilizację pola spektrometru lub zablokowanie. Następnie umieść objętość roztworu o objętości 500 mikrolitrów w 5-milimetrowej probówce NMR. Podłączyć rurkę przesyłową do zautomatyzowanego, wykonanego na zamówienie urządzenia do wstrzykiwań, które oddziela hiperspolaryzowany roztwór od helu gazowego używanego do transferu.
Urządzenie automatycznie dostarcza 500 mikrolitrów hiperspolaryzowanego roztworu do probówki z próbką. Przed rozpuszczeniem umieścić pięciomilimetrową probówkę NMR zawierającą 500 mikrolitrów próbki w izocentrum spektrometru NMR o natężeniu 11,74 tesli. Wlej 5 mililitrów deuterowanej wody do bojlera z wkładem rozpuszczającym.
Zwiększ ciśnienie i podgrzej oddeuterowaną wodę za pomocą drutu rezystancyjnego, aż do osiągnięcia temperatury około 180 do 200 stopni Celsjusza, klikając przycisk przygotowania grzałki w interfejsie oprogramowania kriostatu. Kliknij przycisk SS Operations w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie wyjmij prowadnicę kuchenki mikrofalowej z wkładki do rozpuszczania.
Wsuń wkładkę do rozpuszczania w dół do uchwytu na próbki. Wkładka do rozpuszczania musi sięgać do dna uchwytu próbki i musi być mocno dociśnięta, aby zapewnić szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę, aby uniknąć przedostania się deuterowanej wody do kriostatu. Naciśnij spust sprzętowy, aby rozpocząć sekwencję rozpuszczania, z góry określoną sekwencję czasową operacji zaworów pneumatycznych.
Tuż po rozpuszczeniu urządzenie iniekcyjne miesza 500 mikrolitrów hiperspolaryzowanego roztworu z próbką umieszczoną w spektrometrze NMR. Po rozpuszczeniu zmierz hiperspolaryzowany sygnał NMR z próbki w spektrometrze za pomocą serii sekwencji impulsów o kącie odwrócenia o 10 stopni, w odstępach co 1,5 sekundy, aby śledzić postęp namagnesowania podłoża i produktu. Po ustawieniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania i naciśnij enter.
Gdy namagnesowanie zostanie w pełni zrelaksowane, zmierz sygnał termiczny NMR za pomocą serii sekwencji impulsów o kącie odwrócenia 90 stopni w odstępach około trzech minut, co odpowiada około 3T1. Po ustawieniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania i naciśnij Enter. Tutaj przebieg czasowy widm uzyskany z powtarzających się impulsów kąta odwrócenia o 10 stopni pokazuje czułość i rozdzielczość czasową techniki.
Po zidentyfikowaniu piku substratu pirogronianowego i produktu mleczanowego przeprowadza się kwantyfikację poprzez integrację sygnału metabolitów. Aktywność enzymatyczna jest określana na podstawie przebiegu czasowego sygnału produktu poprzez dopasowanie do modelu liniowego. Aby potwierdzić poprawność pomiaru, ta sama ilość jest oceniana za pomocą początkowej szybkości reakcji, na podstawie stosunku sygnałów produktu i substratu.
Po opanowaniu, pełny pomiar aktywności enzymatycznej można wykonać w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak wytworzyć wysoce spolaryzowany substrat do NMR, wstrzyknąć go do roztworu zawierającego enzym i śledzić aktywność enzymatyczną za pomocą NMR wzmocnionego DNP. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby starannie przygotować roztwór enzymatyczny ze świeżym enzymem i kosubstratami oraz unikać pęcherzyków powietrza w probówce z próbką.
Dzięki opracowaniu rezonansu magnetycznego wzmocnionego DNP w stanie ciekłym, naukowcy mogą teraz badać wychwyt substratu i jego enzymatyczną transformację wewnątrz różnych typów komórek, mierząc szybkość powstawania produktu. Nie zapominaj, że praca ze sprzętem kriogenicznym i silnymi polami magnetycznymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tych pomiarów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej przed kriogenami i sprawdzanie braku obiektów magnetycznych.
W przeciwieństwie do klasycznego NMR, NMR oparty na rozpuszczaniu DNP jest ograniczony do eksperymentalnego okna czasowego wynoszącego co najwyżej kilka minut, w zależności od substratu i aktualnego stanu życia. Stoi to na przeszkodzie w wyjściu poza spektroskopię z jedną literą D. Rozpuszczanie DNP NMR wymaga opracowania, aby doprowadzić go do poziomu wszechstronności klasycznego wielowymiarowego NMR.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie omawia implementację dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) do poprawy czułości w rezonansie magnetycznym jąder (NMR) i obrazowaniu rezonansiu magnetycznym (MRI). Celem jest monitorowanie w czasie rzeczywistym procesów enzymatycznych bez modyfikacji zaangażowanych cząsteczek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Rezonans magnetyczny jąder
Tło
- Dissolution DNP znacznie zwiększa czułość eksperymentów NMR.
- Technika ta pozwala na ilościową analizę substratów i ich pochodnych w czasie rzeczywistym.
- Instalacja sprzętu DNP stanowi znaczny postęp w możliwościach badawczych.
- Współpraca członków zespołu była kluczowa dla ustawienia sprzętu DNP.
Cel badania
- Monitorowanie procesów enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR ulepszonego DNP.
- Określenie szybkości transformacji enzymatycznych bez modyfikacji cząsteczek.
- Poprawa czułości eksperymentalnej na spektrometrach NMR 500 MHz.
Stosowane metody
- Instalacja sprzętu DNP w laboratorium.
- Współpraca z badaczami doświadczonymi w technikach DNP.
- Monitorowanie reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym.
- Wykorzystanie spektrometrów NMR 500 MHz dla zwiększonej czułości.
Główne wyniki
- DNP pozwala na bezpośrednią ilościową analizę substratów z rozdzielczością sekundową.
- Zwiększona czułość ułatwia badania reakcji enzymatycznych.
- Udana instalacja pierwszego sprzętu DNP we Francji.
- Współpraca członków zespołu była niezbędna do osiągnięcia sukcesu operacyjnego.
Wnioski
- Dissolution DNP jest potężnym narzędziem do badania procesów enzymatycznych.
- Technika ta zapewnia informacje w czasie rzeczywistym bez modyfikacji struktur molekularnych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technologię do różnych badań biochemicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dissolution DNP-enhanced NMR enables real-time quantification of enzymatic reaction rates without molecular modification, addressing a critical sensitivity bottleneck in metabolic studies. This capability supports target validation by providing direct, quantitative readouts of substrate-to-product conversion in physiologically relevant systems. The method improves predictive confidence in early discovery by allowing kinetic assessment of enzyme activity under near-native conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of pyruvate-to-lactate conversion rates mediated by lactate dehydrogenase.
- Operational Value: Provides time-resolved enzymatic activity data with second-scale resolution, supporting rapid iteration in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying flux through key metabolic pathways without perturbing native substrate or product identities.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time NMR readouts of metabolite formation, enabling assay standardization for enzymatic activity screening.
- Operational Value: Delivers reproducible signal integration and linear modeling outputs for consistent product signal time course analysis across experiments.
- Scalability Value: Supports platform reuse through automated injection and dissolution sequences that minimize manual handling and improve throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses pyruvate—a clinically relevant metabolic substrate—to model in vivo-like enzymatic transformations, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Mechanistic Value: Enables monitoring of LDH-mediated flux, a known biomarker in tumor metabolism and drug response, aiding in pathophysiological relevance assessment.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides kinetic data that inform go/no-go decisions by quantifying enzymatic efficiency under controlled, reproducible conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling real-time enzymatic rate measurement after target identification and before lead optimization, supporting data-driven progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying flux through the pyruvate-lactate node, a central metabolic node in cancer and ischemia models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of hyperpolarized pyruvate and consistent detection of lactate product via 10-degree flip angle pulse-acquire sequences.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements via signal integration and linear fitting of product signal time courses, enabling objective comparison of enzymatic conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of endogenous metabolites (pyruvate, lactate) that reflect in vivo metabolic pathways.
- Enterprise Reuse: Represents a modular capability for real-time metabolic flux analysis, adaptable to other enzyme-substrate pairs beyond LDH-pyruvate.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, real-time quantification of enzymatic conversion.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissolution, injection, and acquisition protocols, minimizing variability in enzymatic rate measurements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid assessment of enzyme activity, reducing reliance on indirect or endpoint assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering kinetic parameters that inform target druggability and pathway selectivity early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNP physics, cryogenics, and NMR operation to manage polarization, dissolution, and signal detection steps.
- Depends on specialized instrumentation including a DNP polarizer, cryostat, high-field NMR spectrometer (11.74 T), and automated injection device for hyperpolarized sample transfer.
- Necessitates cross-team standardization of enzymatic solution preparation (e.g., fresh LDH in buffer with BSA) and sample handling to prevent artifacts from air bubbles or delayed mixing.
- Involves adaptation considerations for non-pyruvate substrates, requiring re-optimization of polarizing agents, concentrations, and dissolution conditions for each target metabolite.
- Limited by the short hyperpolarized signal window (T1 or TLLS), necessitating rapid acquisition and constraining longitudinal studies beyond minutes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Polarization
3:29
Solid-state NMR Measurements
5:15
Sample Preparation and Positioning
6:19
Dissolution and Injection
7:32
Liquid-state NMR Measurement
8:25
Results: Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurement for LDH Activity
9:08
Conclusion
![Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-07-04T06%253A45%253A50.000Z&w=384&q=75)
