Name: Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj technikę dynamicznej polaryzacji jądrowej DNP do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR. Metoda zwiększa czułość spektrometrów 500 MHz bez modyfikowania cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr J. J. van der Klinkowi za pomoc w wyborze i montażu sprzętu, a także dr F. Katebowi i dr G. Bertho za przydatne dyskusje. A.C. było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant PPOOP2_157547). Potwierdzamy finansowanie z Paris Sorbonne Cité (NMR@Com, DIM Analytics, Ville de Paris, Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) oraz Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Nasz zespół bierze udział w programach Equipex Paris-en-Résonance i CACSICE.

UWAGA: Wszystkie analizy danych zostały wykonane przy użyciu komercyjnego oprogramowania.
1. Przygotowanie roztworu polaryzującego
<ol>
	<li>Przygotować 2 ml roztworu 1,12 M znakowanego 13C pirowinianu sodu (Na+[CH3-CO-13COO]-, substrat) z dodatkiem 33 mM rodnika TEMPOL (4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopiperydyny-1-oksylowego, czynnik polaryzujący)4 w mieszaninie D2O/d6-etanol w stosunku 2:1 do obserwacji 13C. OSTROŻNIE: Należy zachować środki ostrożności podczas pracy z d6-etanolem ze względu na jego palność.</li>
	<li>Zweryfikować, czy stężenie rodnika jest optymalne pod kątem osiągniętej polaryzacji.
	<ol>
		<li>Niewielko zmienić stężenie rodnika w roztworze z punktu 1.1 (np. na 30 mM lub 35 mM).</li>
		<li>Iteracyjnie wyznaczyć wzmocnienie w stanie stałym (patrz Krok 3) i znaleźć stężenie rodnika, które prowadzi do maksymalnego wzmocnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Polaryzacja
<ol>
	<li>Obniż temperaturę kriostatu DNP zgodnie z procedurą chłodzenia. Kliknij przycisk „Cooldown” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rycina 2D).</li>
	<li>Wypełnij kriostat DNP ciekłym helem zgodnie z procedurą napełniania. Kliknij przycisk „Filling” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rycina 2D).</li>
	<li>Umieść 300 μl zoptymalizowanego roztworu polaryzującego z kroku 1.1 w pojemniku na próbkę dostarczonym z polaryzatorem DNP. Zamroź pojemnik z próbką, delikatnie zanurzając go w kąpieli z ciekłego azotu.</li>
	<li>Usuń ciekły azot, który mógł pozostać w pojemniku na próbkę po procedurze zamrażania (krok 2.3), wyjmując pojemnik z kąpieli z ciekłego azotu i odwracając go do góry nogami. 
	UWAGA: Krok ten jest kluczowy dla uzyskania całkowitego rozpuszczenia próbki (patrz krok 5).</li>
	<li>Wprowadź próbkę do kriostatu. 
	UWAGA: Ten krok, składający się z poniższego podpunktu, musi zostać wykonany szybko (tzn. w czasie krótszym niż 10-20 s), aby zapobiec stopieniu próbki.
	<ol>
		<li>Włóż pojemnik na próbkę do uchwytu na próbki. Włóż uchwyt na próbki do głównego wkładu kriostatu. Wprowadź falowód mikrofalowy do uchwytu na próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obniż temperaturę kriostatu, rozpoczynając procedurę chłodzenia do 1 K. Kliknij przycisk „1K Cooling” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rycina 2D).</li>
	<li>Włącz źródło mikrofal i naświetlaj próbkę. Kliknij przycisk „MW-ON” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rycina 2D).</li>
</ol>
3. Pomiary NMR w fazie stałej
<ol>
	<li>Odłącz kabel współosiowy kanału detekcji konsoli NMR od cewki spektrometru, obracając złączy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o 90° i wyciągając go. Podłącz kabel współosiowy kanału detekcji do złącza współosiowego cewki NMR kriostatu. Włóż wtyk kabla konsoli NMR do gniazda cewki NMR kriostatu, zwracając uwagę na pin orientacyjny; dociśnij mocno i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90°.</li>
	<li>Zmierz sygnał termiczny NMR w stanie stałym w miejscu kriostatu, używając prostej sekwencji pulse-acquire z niekalibrowanymi impulsami o niskim kącie odchylenia, powtarzanymi w odstępach T = 5 min. Po ustawieniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania „zg” i naciśnij klawisz „Enter” na klawiaturze. Szczegółowe informacje na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru znajdują się w instrukcji obsługi spektrometru NMR.</li>
	<li>Zmierz sygnał NMR wzmocniony przez DNP. Powtórz czynności z kroku 3.2 po zainicjowaniu procesu DNP zgodnie z opisem w Sekcji 2.</li>
	<li>Odłącz kabel współosiowy kanału detekcji konsoli NMR od cewki NMR kriostatu, obracając złącze przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o 90° i wyciągając go. Podłącz kabel współosiowy kanału detekcji do złącza współosiowego cewki spektrometru. Włóż wtyk kabla konsoli NMR do gniazda cewki spektrometru, zwracając uwagę na pin orientacyjny; dociśnij mocno i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90°.</li>
</ol>
4. Optymalizacja jednorodności głównego pola magnetycznego („shimming”)
<ol>
	<li>Umieść w spektrometrze probówkę zawierającą 500 μl mieszaniny przygotowanej w poprzednich etapach (i.e., po kroku 6.2).</li>
	<li>Wykonaj shimming spektrometru NMR poprzez zmianę natężenia prądu w cewkach gradientowych shimingu w celu uzyskania maksymalnego sygnału „lock” deuteru. Wybierz odpowiednią cewkę shimingu, naciskając odpowiadający jej przycisk na konsoli NMR.
	<ol>
		<li>Obracaj pokrętłem na konsoli NMR, aby określić kierunek obrotu zwiększający sygnał lock. Kontynuuj obracanie, aż sygnał osiągnie maksimum. Wybierz kolejną cewkę shimingu i powtarzaj proces maksymalizacji, aż do znalezienia lokalnego maksimum dla wszystkich cewek shimingu. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji obsługi spektrometru NMR. Na koniec wyjmij próbkę używaną do blokowania sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Rozpuszczanie
<ol>
	<li>Wlej 5 ml D2O do grzałki wkładu do rozpuszczania. Poddaj D2O ciśnieniu i podgrzej za pomocą drutu oporowego, aż do osiągnięcia temperatury T ≈ 180-200 °C. Kliknij przycisk „Prepare Heater” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).</li>
	<li>Po zakończeniu procedury polaryzacji próbki (np. po 3 TDNP), zwiększ ciśnienie w kriostacie nieco powyżej ciśnienia pokojowego. Kliknij przycisk „SS Operations” w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D). Wyjmij falowód mikrofalowy z wkładu do rozpuszczania.</li>
	<li>Wsuń wkład do rozpuszczania (Rysunek 3B) w dół do uchwytu na próbki (Rysunek 3A-c). Wkład do rozpuszczania musi dotrzeć do dna uchwytu na próbki i zostać mocno dociśnięty, aby zapewnić szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę i zapobiec wyciekowi D2O do kriostatu.</li>
	<li>Naciśnij wyzwalacz sprzętowy (Rysunek 3C-h), aby rozpocząć sekwencję rozpuszczania, która jest z góry określoną czasowo sekwencją operacji zaworów pneumatycznych.</li>
</ol>
6. Wtryskiwanie
<ol>
	<li>Przed rozpuszczaniem umieść 5 mm probówkę NMR zawierającą 500 μl próbki (np. D2O dla pomiaru <img alt="Symbol dynamicznej polaryzacji jądrowej ε^ls_DNP na schemacie fizycznym; stosowany w badaniach spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation13"> w kroku 7 lub roztwór LDH z kroku 8 dla pomiarów aktywności enzymatycznej w kroku 9) w izocentrum spektrometru NMR 11,74 T (patrz krok 4).</li>
	<li>Bezpośrednio po rozpuszczaniu (krok 5), zmieszaj 500 μl hiperpolaryzowanego roztworu z próbką umieszczoną w spektrometrze NMR w kroku 6.1.
	<ol>
		<li>Wstrzykiwanie ręczne: zbierz hiperpolaryzowany roztwór na końcu 2,5 m transferowej rurki do zlewki szklanej umieszczonej blisko magnesu spektrometru NMR. Ręcznie wstrzyknij 500 μl hiperpolaryzowanego roztworu do probówki z próbką NMR za pomocą specjalnie wykonanego systemu kapilarnego.</li>
		<li>Wstrzykiwanie automatyczne: przed procesem rozpuszczania podłącz rurkę transferową do zautomatyzowanego, specjalnie wykonanego urządzenia wtryskowego, które oddziela hiperpolaryzowany roztwór od gazu helowego używanego do transferu. Urządzenie automatycznie dostarcza 500 μl hiperpolaryzowanego roztworu do probówki z próbką.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Pomiar NMR w stanie ciekłym
<ol>
	<li>Po rozpuszczeniu zmierz sygnał NMR z hiperpolaryzacją próbki w spektrometrze, stosując serię sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia 10°, w odstępach 1,5 s, aby śledzić postęp magnetyzacji substratu (A) i produktu (B). Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania „zg” i naciśnij klawisz „Enter” na klawiaturze. Szczegółowe informacje na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru znajdują się w instrukcji obsługi spektrometru NMR.</li>
	<li>Gdy magnetyzacja zostanie całkowicie zrelaksowana (t.j. po T = 10 T1), zmierz termiczny sygnał NMR za pomocą serii sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia 90°, w odstępach T = 3 T1 ≈ 3 min. Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania „zg” i naciśnij klawisz „Enter” na klawiaturze. Szczegółowe informacje na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru znajdują się w instrukcji obsługi spektrometru NMR.</li>
</ol>
8. Przygotowanie próbek zawierających enzymy (specyficzne dla przemiany pirogronianu w mleczan)
<ol>
	<li>Przygotować bufor reakcyjny według następującego składu: 50 mM zredukowanego nikotynamido-adenyno-dinukleotydu (NADH), 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,1 mM ditiotreitolu (DTT) w 0,1 M buforze fosforanowym, pH = 7,0.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór LDH z mięśni królika o stężeniu 1 U/ml w buforze reakcyjnym z dodatkiem 20 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej, BSA.</li>
	<li>Wymieszać 478 μl buforu reakcyjnego (Krok 8.1), 20 μl D2O w celu stabilizacji pola spektrometru („blokowania”) oraz 2 μl roztworu LDH (Krok 7.2).</li>
	<li>Przenieść przygotowaną w kroku 8.3 objętość 500 μl roztworu do probówki NMR 5 mm i umieścić probówkę w spektrometrze NMR 500 MHz.</li>
</ol>
9. Kompletna procedura pomiaru szybkości reakcji enzymatycznej
<ol>
	<li>Przygotuj próbkę do polaryzacji (Krok 1), a następnie przeprowadź polaryzację (Krok 2).</li>
	<li>Wykonaj shimowanie spektrometru (Krok 4) i przygotuj próbkę enzymatyczną (Krok 8).</li>
	<li>Przeprowadź rozpuszczanie (Krok 5) oraz wstrzyknięcie próbki (Krok 6).</li>
	<li>Zestaw serię sygnałów z hiperpolaryzowanej próbki, stosując impulsy z kątem odchylenia 10° w odstępach 1,5 s (Krok 7). Krok ten umożliwia pomiar zaniku sygnału hiperpolaryzowanego oraz narastania sygnału metabolitów.</li>
</ol>
10. Dopasowanie
<ol>
	<li>Dla każdego widma pozyskanego w kroku 9.4 zidentyfikuj piki odpowiadające odpowiednio substratowi (A) i produktowi (B), a następnie je zintegruj (wyznacz pole powierzchni pików). Całki pików stanowią sygnały zmian namagnesowania w czasie (M(A,B)(t), patrz równanie 2).</li>
	<li>Wykorzystując rozwiązanie równania (2), wyznacz wartość F = (RA + keff ) poprzez prosty dopasowanie wykładnicze do zintegrowanego w kroku 10.1 sygnału substratu.</li>
	<li>Wykorzystując wartość F = (RA + keff ) wyznaczoną w kroku 10.2, wyznacz keff oraz RB poprzez dopasowanie sygnału produktu MB(t) do funkcji otrzymanej z całkowania równania (2). Szczegóły dotyczące modelowania reakcji, dopasowania oraz korekcji rf znajdują się w sekcji Wyniki reprezentatywne (Aktywność enzymatyczna i pomiary metaboliczne).</li>
</ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Punktami krytycznymi eksperymentu rozpuszczania DNP NMR są: (i) poziom polaryzacji osiągnięty dla substratu, który określa najniższe stężenie produktu niezbędne do eksperymentów, a także liczbę akwizycji sygnału, które można wykonać, oraz (ii) czas życia namagnesowania w porównaniu z czasem trwania transferu między polaryzacją a miejscami detekcji oraz do szybkości przemiany substratu. Opisany tutaj system iniekcji układu DNP do rozpuszczania pozwala na przeniesienie próbki w ciągu zaledwie 3-4 sekund. Chociaż transfer n...

<table><tbody><tr><td>Polaryzator DNP</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Szwajcaria)</td><td></td><td>Kriostat i sprzęt elektroniczny do polaryzacji próbek</td></tr><tr><td>Elementy systemu próżniowego</td><td>Próżnia Edwards (Francja)</td><td>Różne</td><td> - konfiguracja pompowania turbomolekularnego - konfiguracja pompowania membranowego - wysokowydajny system pompowania korzeni - armatura i komponenty próżniowe </td></tr><tr><td>DNP 3,35T Magnet</td><td>Bruker (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR 500 MHz</td><td>Bruker (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVANE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, BEZWODNY, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etyleno-diaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzym LDH w&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Francja)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą nmr

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Głównym ograniczeniem badań opartych na NMR jest niska czułość. Powoduje to długie czasy akwizycji, zapobiegając w ten sposób pomiarom przemian metabolicznych NMR w czasie rzeczywistym. Hiperpolaryzacja poprzez rozpuszczanie DNP omija część problemów z czułością dzięki dużemu nierównowagowemu namagnesowaniu jądrowemu wynikającemu z przeniesienia polaryzacji spinu elektronu do jądra. Uzyskany sygnał o wysokim NMR może być wykorzystany do monitorowania reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Wadą hiperspolaryzowanego NMR jest ograniczone okno czasowe dostępne do akwizycji sygnału, które zwykle jest rzędu stałej czasu relaksacji podłużnej spinu jądrowego, T1, lub, w korzystnych przypadkach, rzędu stałej czasu relaksacji związanej ze stanem singletowym sprzężonych jąder, TLLS. Wychwyt komórkowy cząsteczek endogennych i tempo metabolizmu mogą dostarczyć istotnych informacji na temat rozwoju guza i odpowiedzi na leki. Liczne wcześniejsze badania nad hiperpolaryzacją NMR wykazały znaczenie pirogronianu jako substratu metabolicznego do monitorowania aktywności enzymatycznej in vivo. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis konfiguracji doświadczalnej i metod wymaganych do badania reakcji enzymatycznych, w szczególności szybkości konwersji pirogronianu do mleczanu w obecności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), za pomocą hiperspolaryzowanego NMR.

Wzmocnienie sygnału NMR z wykorzystaniem rozpuszczalnego DNP 
Efekt DNP polega na przeniesieniu wysokiej polaryzacji niesparowanych spinów elektronowych, zazwyczaj z cząsteczek stabilnych rodników, na jądra aktywne w NMR, podczas naświetlania próbki mikrofalowym promieniowaniem. Najczęściej stosowanymi wolnymi rodnikami są TAM(OXO63) oraz TEMPOL.4 Procedury polaryzacji z użyciem TEMPOL można zoptymalizować za pomocą „polaryzacji krzyżowej”.25
<p class="jove_co...

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest śledzenie procesów enzymatycznych w czasie rzeczywistym przy użyciu magnetycznego rezonansu jądrowego wzmocnionego dynamiczną polaryzacją jąder. Rezonans magnetyczny w stanie ciekłym wzmocniony dynamiczną polaryzacją jąder, DNP, może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania: jak określić, na przykład, szybkość transformacji enzymatycznej pary cząsteczek w komórce lub in vivo bez konieczności jakiejkolwiek modyfikacji tej pary cząsteczek. Instalacja sprzętu do DNP z rozpuszczaniem w naszym laboratorium oraz przybycie dr. Riccarda Balzana, doktora z laboratorium Arnaud Comment w Lozannie, stanowią wielki krok naprzód w naszych badaniach.DNP znacząco zwiększa czułość eksperymentów, które możemy przeprowadzać na naszych spektrometrach NMR o częstotliwości 500 MHz. Ten sprzęt DNP był pierwszym zainstalowanym we Francji i chciałbym zaznaczyć, że w procesie uruchamiania tego urządzenia zaangażowani byli wszyscy członkowie naszego zespołu NMR, a w szczególności Gildas Bertho, nasz inżynier badawczy, oraz Fatiha Kateb, nasza maitre de conférences. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią, w czasie rzeczywistym, kwantyfikację substratu i jego endogennych pochodnych z rozdzielczością czasową rzędu sekund.W celu przygotowania roztworu polaryzującego, przygotuj dwa mililitry 1,12 molarnego roztworu pirogronianu sodu znakowanego węglem 13, domieszkowanego 33 milimolarnie rodnikiem TEMPO, w objętościach deuterowanej wody do deuterowanego etanolu w stosunku dwa do jednego dla obserwacji węgla 13. Obniż temperaturę kriostatu do dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) za pomocą procedury schładzania, klikając przycisk cooldown w interfejsie oprogramowania kriostatu. Napełnij kriostat DNP ciekłym hellem poprzez procedurę napełniania.Kliknij przycisk napełniania w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie umieść 300 µL zoptymalizowanego roztworu polaryzacyjnego w pojemniku na próbkę dołączonym do polaryzatora DNP. Zamroź pojemnik wraz z zawartością, delikatnie zanurzając go w kąpieli z ciekłym azotem.Usuń ciekły azot, który może znajdować się w pojemniku z próbką po procedurze zamrażania, wyjmując pojemnik z kąpieli w ciekłym azocie i obracając go do góry dnem. Następnie wprowadź próbkę do kriostatu, najpierw umieszczając pojemnik z próbką w uchwycie na próbki. Potem umieść uchwyt na próbki w głównym wkładzie kriostatu, a następnie wprowadź falowód mikrofalowy do uchwytu na próbki.Obniż temperaturę kriostatu, uruchamiając procedurę chłodzenia o jeden kelwin. Kliknij przycisk chłodzenia o jeden kelwin w interfejsie oprogramowania kriostatu. Włącz źródło mikrofal i napromieniuj próbkę, klikając przycisk włączania mikrofal w interfejsie oprogramowania kriostatu.Odłącz kabel koncentryczny kanału detekcji konsoli NMR od cewki spektrometru, obracając złącze o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyciągając je. Podłącz kabel koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego kriocewki NMR. Następnie włóż złącze męskie kabla konsoli NMR do złącza żeńskiego kriocewki NMR, zwracając uwagę na pin pozycjonujący.Mocno dociśnij i obróć złącze o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Zmierz termiczny sygnał NMR w stanie stałym w miejscu kriostatu, stosując prostą sekwencję impuls-akwizycja z niekalibrowanymi impulsami o niskim kącie odchylenia (flip angle), powtarzanymi w odstępach t równych pięciu minutom. Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania i naciśnij enter na klawiaturze.Po rozpoczęciu procedury polaryzacji, zmierz wzmocniony przez DNP sygnał NMR w stanie stałym, stosując tę samą procedurę i warunki, które zostały użyte do pomiaru sygnału termicznego. Odłącz koncentryczny kabel kanału detekcji konsoli NMR od cewki NMR kriostatu, obracając złącze o 90 stopni przeciwnie do ruchu wskazówek zegara i wyciągając je. Następnie podłącz kabel koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki spektrometru.Włóż wtyk męski kabla konsoli NMR do gniazda żeńskiego cewki spektrometru, zwracając uwagę na pin orientacyjny. Dociśnij mocno i obróć złącze o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Przygotuj świeży roztwór LDH z mięśni królika o stężeniu 1 unit/mL w buforze reakcyjnym z dodatkiem 20 µg/mL albuminy surowicy bydlęcej.Następnie zmieszaj 478 µL buforu reakcyjnego, 2 µL roztworu LDH oraz 20 µL wody deuterowanej, aby umożliwić stabilizację (blokowanie) pola spektrometru. Następnie przelej 500 µL roztworu do probówki NMR o średnicy 5 mm. Podłącz probówkę transferową do zautomatyzowanego, wykonanego na zamówienie urządzenia wtryskowego, które oddziela hiperpolaryzowany roztwór od helu używanego do transferu.Urządzenie automatycznie dozuje 500 µL hiperpolaryzowanego roztworu do probówki z próbką. Przed rozpuszczaniem umieść pięciomilimetrową probówkę NMR zawierającą 500 µL próbki w izocentrum spektrometru NMR o indukcji 11,74 tesla. Wlej 5 mL wody deuterowanej do bojlera wkładu do rozpuszczania.Zwiększ ciśnienie i podgrzej wodę deuterowaną za pomocą drutu oporowego, aż temperatura osiągnie około 180 do 200 stopni Celsjusza, klikając przycisk prepare heater w interfejsie oprogramowania kriostatu. Kliknij przycisk SS Operations w interfejsie oprogramowania kriostatu. Następnie wyjmij prowadnicę mikrofalową z wkładu do rozpuszczania.Wsuń wkład do rozpuszczania w dół do uchwytu na próbkę. Wkład do rozpuszczania musi dotrzeć do dna uchwytu i zostać mocno dociśnięty, aby zapewnić szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę, co zapobiegnie wyciekowi wody deuterowanej do kriostatu. Naciśnij wyzwalacz sprzętowy, aby rozpocząć sekwencję rozpuszczania, która jest zaprogramowaną w czasie sekwencją operacji zaworów pneumatycznych.Bezpośrednio po rozpuszczeniu urządzenie wstrzykujące miesza 500 µL roztworu hiperpolaryzowanego z próbką umieszczoną w spektrometrze NMR. Po rozpuszczeniu należy zmierzyć hiperpolaryzowany sygnał NMR z próbki w spektrometrze, stosując serię sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia (flip angle) 10 stopni w odstępach 1,5 s, aby śledzić przebieg magnetyzacji substratu i produktu. Po skonfigurowaniu pomiaru należy wpisać zg w wierszu poleceń oprogramowania i nacisnąć enter.Po całkowitym rozluźnieniu namagnesowania, zmierz termiczny sygnał NMR za pomocą serii sekwencji impuls-akwizycja z kątem odchylenia 90 stopni, rozdzielonych odstępami około trzech minut, co odpowiada około 3T1. Po skonfigurowaniu pomiaru wpisz zg w wierszu poleceń oprogramowania, a następnie naciśnij klawisz enter. Przedstawiony tutaj przebieg czasowy widm uzyskanych z powtarzających się impulsów z kątem odchylenia 10 stopni pokazuje czułość i rozdzielczość czasową tej techniki.Po identyfikacji pików substratu pirogronianowego i produktu mleczanowego, ilościowe oznaczenie przeprowadzono poprzez całkowanie sygnałów metabolitów. Aktywność enzymatyczną określono na podstawie przebiegu sygnału produktu w czasie, dopasowując go do modelu liniowego. W celu walidacji pomiaru, tę samą wartość oceniono na podstawie początkowej szybkości reakcji, wyznaczonej z proporcji sygnałów produktu i substratu.Po opanowaniu tej metody, pełny pomiar aktywności enzymatycznej można przeprowadzić w ciągu około dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo rozumieć, jak przygotować silnie spolaryzowany substrat do NMR, wstrzyknąć go do roztworu zawierającego enzym oraz monitorować aktywność enzymatyczną przy użyciu NMR z wzmocnieniem DNP. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest staranne przygotowanie roztworu enzymatycznego ze świeżym enzymem i kosubstratami oraz unikanie powstawania pęcherzyków powietrza w probówce z próbką.Dzięki rozwojowi rezonansu magnetycznego z wzmocnieniem DNP w stanie ciekłym, badacze mogą teraz badać pobieranie substratu oraz jego transformację enzymatyczną wewnątrz różnych typów komórek poprzez pomiar szybkości powstawania produktu. Należy pamiętać, że praca z urządzeniami kriogenicznymi i wysokimi polami magnetycznymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tych pomiarów zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej przed kriogenami oraz weryfikacja braku przedmiotów magnetycznych.W przeciwieństwie do klasycznego NMR, spektroskopia NMR oparta na DNP z rozpuszczaniem jest ograniczona do okna czasowego eksperymentu wynoszącego maksymalnie kilka minut, w zależności od substratu i aktualnego stanu życia. Stanowi to przeszkodę w wyjściu poza jednowymiarową spektroskopię. NMR z DNP z rozpuszczaniem wymaga dalszego rozwoju, aby osiągnąć poziom wszechstronności charakterystyczny dla klasycznego NMR wielowymiarowego.

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Prezentujemy protokół do pomiaru zależności pola magnetycznego od czasu relaksacji spinowo-sieciowej 13związków wzbogaconych w C, hiperpolaryzowanych za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej, przy użyciu szybkiej relaksometrii z cyklem pola. W szczególności wykazaliśmy to za pomocą pirogronianu [1-13C], ale protokół można rozszerzyć na inne hiperspolaryzowane substraty.

Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj technikę dynamicznej polaryzacji jądrowej DNP do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR. Metoda zwiększa czułość spektrometrów 500 MHz bez modyfikowania cząsteczek.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR (Wideo) | JoVE Journal

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Przeglądaj więcej filmów