Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie allelospecyficznej delecji zapośredniczonej przez CRISPR/Cas9 do badania regulacji transkrypcji genów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Główną zaletą tej techniki, która wykorzystuje genom hybrydowy do generowania i analizowania delecji monoallelicznych, jest wyeliminowanie konieczności analizowania wzmocnionych delecji monoallelicznych, które mogą nie być żywotne.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, takie jak: który gen jest regulowany przez konkretny enhancer i w jakim stopniu aktywność tego genu zależy od pojedynczego enhancera. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat pluripotencji komórek macierzystych, można ją zastosować również w innych systemach.

Na przykład może nam to pomóc zrozumieć, w jaki sposób komórki macierzyste zmieniają swój los, aby stać się neuronami, komórkami krwi lub mięśniami. Po zaprojektowaniu, skonstruowaniu i potwierdzeniu sekwencji przewodzącego RNA, czyli gRNA, który zostanie użyty, przygotuj się do transfekcji plazmidów wolnych od endotoksyn do komórek ES. Używając wirówki, odwiruj 1×10⁶ embrionalnych komórek macierzystych F1, uzyskanych z krzyżowania Mus musculus 129 z Mus castaneus, w probówce 1,5 ml przy 300 ×g przez pięć minut.

Po wirowaniu odlej nadsącz i dodaj 100 µL buforu do resuspensji dostarczonego przez producenta zestawu. W celu delecji docelowego regionu DNA dodaj po 5 µg plazmidów P Cas9 GFP gRNA 5-prime oraz 3-prime. Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj zawartość.

Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie, używając końcówki elektronicznej pipety mikroporatora, należy pobrać 100 µL mieszaniny do elektroporacji, dbając o to, aby do końcówki nie dostało się powietrze. Następnie pipetę należy włożyć do urządzenia do transfekcji.

Wybierz odpowiedni protokół i naciśnij start. Podczas trwania elektroporacji obserwuj końcówkę. Przy prawidłowej konfiguracji z elektrody w probówce powinny wydostawać się maleńkie pęcherzyki.

Iskra wskazuje na obecność pęcherzyka powietrza i zakłóci proces transfekcji. W takim przypadku należy powtórzyć elektroporację z użyciem nowej partii komórek. Po elektroporacji należy przenieść transfekowane komórki do dziesięciocentymetrowej szalki powlekanej żelatyną zawierającej dziesięć mililitrów pożywki dla komórek ES.

Inkubować transfektowane komórki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Po 48 godzinach, przy użyciu cytometru przepływowego, posortować i wyizolować GFP-dodatnie komórki ES. Następnie wysiać od 1 do 1,5 × 10⁴ GFP-dodatnich komórek do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm, pokrytego żelatyną i zawierającego 10 ml pożywki dla komórek ES.

Wysiewanie przy tak niskiej gęstości ułatwi wyizolowanie pojedynczych kolonii komórek ES. Po czterech do pięciu dniach należy użyć mikroskopu, aby zidentyfikować pojedyncze, kuliste kolonie komórek ES. Za pomocą pipety przenieść każdą kolonię do osobnej studzienki płytki 96-dołkowej, uprzednio potraktowanej żelatyną i zawierającej 30 µL tripsomu.

Po pobraniu wszystkich kolonii i ich dysocjacji w pożywce, hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, aż większość dołków osiągnie ponad 70% konfluencji. Zazwyczaj trwa to około dwóch dni. Gdy komórki będą gotowe do pasażowania, usunąć pożywkę i dodać 30 µL trypsyny.

Inkubować komórki przez pięć minut. Następnie do każdej studniki dodać 180 µL pożywki dla komórek ES, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Z każdej studzienki przenieś 70 µL do każdej z trzech powlekanych żelatyną płytek 96-dołkowych zawierających 130 µL pożywki dla komórek ES w każdej studzience. Inkubuj w temperaturze 37 °C. Gdy płytki osiągną 70 do 85% konfluencji, wykorzystaj je do przeprowadzenia genotypowania i analizy ekspresji każdego klonu, zgodnie z opisem w następnych sekcjach.

Zamrozić zapasy komórek zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Następnie zostaną zaprojektowane cztery zestawy starterów w celu przesiewania klonów pod kątem pożądanej delecji. Obejmują one: startery wewnętrzne, startery zewnętrzne oraz startery flankujące gRNA dla miejsc docelowych gRNA na końcach 5' oraz 3'.

Zacznij od odwiedzenia pokazanej tutaj strony internetowej, aby uzyskać ścieżkę polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) odpowiadającą genotypom 129 i Cas. Prowadzi ona do strony internetowej Mitchell Lab CRISPR. Tam kliknij podany link.

Strona przekieruje do przeglądarki genomu UCSC zawierającej ścieżkę wyświetlającą polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) pomiędzy genomami 129 i Cas w asemblacji genomu myszy MM-9. Następnie wprowadź współrzędne regionu do usunięcia i kliknij „go”. Powiększ region o wielkości około 500 par zasad w środku pożądanego miejsca delecji, zawierający więcej niż trzy SNP.

Projektowanie starterów specyficznych dla allelu może być skomplikowane, jeśli polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) są nieliczne. Jeśli nie jest możliwe zaprojektowanie absolutnie specyficznych starterów allelicznych, można zastosować umiarkowanie specyficzne startery alleliczne. Należy jednak pamiętać o porównaniu wartości CT między klonami z delecją a klonami bez delecji podczas analizy wyników qPCR.

Teraz kliknij „View” w górnym panelu. Z menu rozwijanego wybierz „DNA”. Pojawi się strona „Get DNA in Window”.

W opcjach formatowania sekwencji wybierz wszystkie wielkie litery, a następnie kliknij „Get DNA”, aby wyświetlić sekwencję docelową w formacie wielkich liter. Skopiuj tę sekwencję i wklej ją do pliku dokumentu Word. Następnie porównaj sekwencję ze ścieżką snipów 129 cast, zaznacz pozycje snipów i oznacz snipy 129 małymi literami.

Po zakończeniu pracy z sekwencją 129, skopiuj ją, aby utworzyć dwie sekwencje sformatowane w standardzie fast day. Jedną dla 129 i jedną dla Cas. W sekwencji Cas zastąp każdą zasadę w pozycji snip odpowiednią zasadą, zaznaczając snip małą literą.

Następnie oznacz sekwencję odpowiednim genomem, 129 lub Cas. Potem w przeglądarce wpisz adres strony Primer3Plus. W odpowiednim polu wklej sekwencję 129 z podstawionym fragmentem.

Użyj ustawień domyślnych do zaprojektowania starterów. Aby zaprojektować wewnętrzne startery specyficzne dla alleli, kliknij menu rozwijane po prawej stronie Task i wybierz Primer List, a następnie kliknij Pick Primers. Otworzy się nowa strona wyświetlająca listę starterów forward i reverse.

Zaznacz pole wyboru, aby wybrać starter bezpośredni lub odwrotny, który posiada SNP oznaczony małą literą na końcu 3' lub w obrębie czterech zasad od końca 3'. Należy zauważyć, że startery z SNP na końcu 3' wykazują zwiększoną specyficzność allelową podczas qPCR. Kliknij „Send to Primer3 Manager” na dole ekranu.

Otworzy się nowa strona wyświetlająca wybrany starter. Aby wybrać drugi starter, należy wrócić do strony z listą starterów, a następnie kliknąć przycisk wstecz, aby powrócić do strony głównej. Z rozwijanego menu zadań należy wybrać Detekcję.

Strona główna zostanie odświeżona, a na dole pojawią się pola na sekwencje prawego i lewego primera. Wklej sekwencję pierwszego primera w odpowiednim polu. Następnie przejdź do karty General Settings, znajdującej się obok karty Main, i zmień ustawienie zakresu wielkości produktu na od 80 do 200 par zasad.

Kliknij „Pick Primers”. Otworzy się strona wyświetlająca pięć możliwych par starterów dla pierwszej sekwencji startera. Wybierz zestaw starterów z listy par starterów, zaznaczając pola po lewej stronie starterów, a następnie kliknij „Send to Primer3 Manager” na dole ekranu. Będą to wewnętrzne startery specyficzne dla allelu 129.

Powtórz te kroki, aby zaprojektować startery dla allelu cast. Następnie zastosuj tę technikę do projektowania zewnętrznych starterów specyficznych dla allelu oraz starterów niespecyficznych dla allelu. Na koniec sprawdź specyficzność alleliczną starterów za pomocą qPCR zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.

Wyizoluj genomowe DNA z wcześniej przygotowanej płytki 96-dołkowej. Krótko odwiruj płytkę, aby skroploną wodę osadzić na dnie dołków. DNA to będzie służyć jako matryca do screeningu delecji.

Następnie, na płytce 384-dołkowej, przeprowadź qPCR w duplikacie dla każdego klonu. Zastosuj dwuetapową PCR, a następnie analizę krzywej topnienia z detekcją. Po zakończeniu przebiegu sprawdź w pierwszej kolejności amplifikację każdego allelu przy użyciu wewnętrznych starterów specyficznych dla allelu.

Brak amplifikacji jednego allelu lub różnica w wartościach CT wynosząca więcej niż pięć cykli między allelami sugeruje, że klony te posiadają delecję heterozygotyczną. Brak amplifikacji obu alleli sugeruje, że posiadają one delecję homozygotyczną. Następnie należy sprawdzić amplifikację każdego allelu przy użyciu zewnętrznych starterów specyficznych dla allelu.

Jeśli docelowa delecja jest większa niż 1 KB, amplifikacja za pomocą zewnętrznych starterów zajdzie tylko w przypadku obecności delecji. Wartość CT od 22 do 28 potwierdza delecję. W przypadku docelowych delekcji mniejszych niż 1 KB należy potwierdzić rozmiar amplikonu za pomocą elektroforezy.

Płytka 96-dołkowa z klonami delecyjnymi została przesiewana metodą qPCR przy użyciu allelospecyficznych starterów wewnętrznych. Szare słupki reprezentują amplifikację ze starterów specyficznych dla Cas, a czarne słupki reprezentują amplifikację ze starterów specyficznych dla 129. Niska wartość CT lub brak amplifikacji przy użyciu starterów wewnętrznych wskazuje na delecję docelową.

Klony z delecją w jednym lub obu allelach są następnie przesiewane za pomocą starterów zewnętrznych. W przypadku starterów zewnętrznych amplifikacja potwierdza obecność delecji. Klony z delecją monoalleliczną są przesiewane przy użyciu starterów flankujących regiony docelowe gRNA, aby potwierdzić brak insercji lub delecji, zwanych indels, w allelu niedelecyjnym.

W późniejszej analizie ekspresji wykorzystano wyłącznie klony monoalleliczne, w których nie wystąpiły duże indle w miejscach docelowych na nieusuniętym allelu. Przedstawione tutaj są reprezentatywne wyniki z klonów z delecją 129 lub Cas SCR. SCR to niedawno opisany specyficzny dla Sox2 wzmacniacz w komórkach ES.

Czerwone słupki reprezentują ekspresję allelu Sox2 Cas, a niebieskie słupki reprezentują amplifikację allelu Sox2 129. Jak widać na tej rycinie, delecja SCR w allelu 129 lub Cas zmniejszyła ekspresję Sox2 w CIS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wygenerować dużą delecję przy użyciu technologii CRISPR oraz jak wykorzystać startery specyficzne dla alleli do genotypowania usuniętych klonów.