Name: Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do generowania delecji monoallelicznych w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w celu badania regulacji transkrypcji genów i aktywności wzmacniaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Mitchella za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji oraz Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario (granty operacyjne i infrastrukturalne będące w posiadaniu JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

Autorzy zapoznali się z polityką JoVE dotyczącą konfliktu interesów i nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Technologia edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zapewnia prostą, szybką i niedrogą metodę modyfikacji genomu. Opisana tutaj metoda generowania i analizowania delecji wzmacniacza monoallelicznego w celu charakterystyki wzmacniacza funkcjonalnego wykorzystuje SNP w komórkach myszy F1. Zaletami tego typu podejścia są: 1) delecje wzmacniacza monoallelicznego nie wywołują efektów zakłócających, które występują, gdy krytyczny wzmacniacz jest usuwany z obu alleli, tj. znaczne obniżenie poziomu białka regulowaneg...

Elementy regulacyjne transkrypcji są kluczowe dla czasowo-przestrzennego dostrajania ekspresji genów podczas rozwoju1, a modyfikacje tych elementów mogą prowadzić do chorób w wyniku aberracyjnej ekspresji genów2. Wiele regionów związanych z chorobami, zidentyfikowanych w badaniach genome-wide association studies, znajduje się w obszarach niekodujących i wykazuje cechy enhancerów transkrypcyjnych3-4. Identyfikacja enhancerów i przypisanie ich do regulowanych przez nie genów jest skomplikowane, ponieważ często znajdują się one w odległości kilku kilobaz od genów, które regulują, i mogą być aktywowane w sposób specyficzny dla danej tkanki5-6. Przewidywania dotyczące enhancerów opierają się zazwyczaj na sygnaturach modyfikacji histonów, kompleksach mediator-kohezyna oraz wiązaniu czynników transkrypcyjnych specyficznych dla danego typu komórek7-10. Walidacja przewidywanych enhancerów najczęściej odbywa się za pomocą testu opartego na wektorze, w którym enhancer aktywuje ekspresję genu reporterowego11-12. Dane te dostarczają cennych informacji o potencjale regulacyjnym domniemanych sekwencji enhancerów, ale nie ujawniają ich funkcji w endogennym kontekście genomicznym ani nie identyfikują genów, które one regulują. Edycja genomu służy jako potężne narzędzie do badania funkcji elementów regulacyjnych transkrypcji w ich endogennym kontekście poprzez analizę utraty funkcji (loss-of-function).
Ostatnie postępy w edycji genomu, a w szczególności system edycji genomu CRISPR/Cas9, ułatwiają badanie funkcji genomu. System CRISPR/Cas9 jest łatwy w użyciu i możliwy do adaptacji w wielu systemach biologicznych. Białko Cas9 jest kierowane do specyficznego miejsca w genomie za pomocą przewodzącego RNA (gRNA)13. Kompleks SpCas9/gRNA skanuje genom w poszukiwaniu docelowej sekwencji genomicznej, która musi znajdować się w pozycji 5' względem sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), NGG14-15. Parowanie zasad gRNA z jego celem, 20-nukleotydową (nt) sekwencją komplementarną do gRNA, aktywuje aktywność nukleazy SpCas9, co prowadzi do pęknięcia obu nici (DSB) 3 bp powyżej sekwencji PAM. Specyficzność jest osiągana dzięki pełnemu parowaniu zasad w regionie seed gRNA, obejmującym 6-12 nt sąsiadujących z PAM; przeciwnie, niedopasowania w pozycji 5' względem regionu seed są zazwyczaj tolerowane16-17. Wprowadzone DSB może zostać naprawione albo przez mechanizm niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), albo przez mechanizm naprawy sterowanej homologią (HDR). Naprawa DNA przez NHEJ często prowadzi do powstania insercji lub delecji (indeli) o długości kilku bp w miejscu docelowym, co może zakłócić otwartą ramkę odczytu (ORF) genu. Aby wygenerować większe delecje w genomie, można zastosować dwa gRNA, które flankują interesujący region18-19. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniu enhancerów transkrypcyjnych skupionych w regionach kontroli locus lub super-enhancerów, które są większe od konwencjonalnych enhancerów9,18,20-22.
Delecje monoalleliczne stanowią cenny model do badania regulacji cis-transkrypcji. Obserwowana zmiana poziomu transkryptu po monoallelicznej delecji enhancera koreluje z rolą tego enhancera w regulacji genów, eliminując efekt zakłócający, który może wystąpić, gdy transkrypcja obu alleli zostanie naruszona, co potencjalnie wpływa na kondycję komórki. Ocena obniżonej ekspresji jest jednak trudna bez możliwości odróżnienia allelu z delecją od allelu typu dzikiego. Ponadto genotypowanie delecji w każdym allelu bez możliwości rozróżnienia tych dwóch alleli jest problematyczne, szczególnie w przypadku dużych delecji od &gt;10 kb do 1 Mb23, w których trudno jest przeprowadzić amplifikację całego regionu typu dzikiego metodą PCR. Zastosowanie komórek ES F1, otrzymanych przez krzyżowanie Mus musculus129 z Mus castaneus, umożliwia rozróżnienie dwóch alleli za pomocą allele-specyficznego PCR18,24. Hybrydowy genom w tych komórkach ułatwia allele-specyficzne przesiewanie delecji oraz analizę ekspresji. Średnio co 125 bp między tymi dwoma genomami występuje SNP, co zapewnia elastyczność w projektowaniu starterów do analiz ekspresji i genotypowania. Obecność jednego SNP może wpływać na temperaturę topnienia (Tm) startera oraz specyficzność docelową w amplifikacji za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), co pozwala na rozróżnienie dwóch alleli25. Co więcej, niedopasowanie w obrębie końca 3' startera w znacznym stopniu wpływa na zdolność polimerazy DNA do elongacji od startera, zapobiegając amplifikacji niepożądanego celu allelicznego26. W poniższym protokole opisano wykorzystanie komórek ES F1 do allele-specyficznych delecji enhancerów o wielkości powyżej 1 kb oraz późniejszą analizę ekspresji z wykorzystaniem systemu edycji genomu CRISPR/Cas9 (Rycina 1).
<img alt="Proces edycji genów; Cas9-gRNA, pęknięcie dwuniciowe DNA; schemat i wyniki PCR; metoda CRISPR." src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Delecja enhancera za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zbadania cis-regulacji ekspresji genów. (A) Komórki ES F1 uzyskane w wyniku krzyżówki Mus musculus129 i Mus castaneus są wykorzystywane, aby umożliwić delecję specyficzną dla allelu. (B) Dwie cząsteczki przewodzącego RNA (gRNA) są używane do indukcji rozległej delecji regionu enhancera za pośrednictwem Cas9. (C) Zestawy starterów służą do identyfikacji dużych delecji mono- i bi-allelicznych. Pomarańczowe startery to startery wewnętrzne, fioletowe startery to startery zewnętrzne, a zielone startery to startery flankujące gRNA. (D) Zmiany w ekspresji genów są monitorowane za pomocą allelo-specyficznego qPCR. RFU oznacza względne jednostki fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>polimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana w składaniu gRNA</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>Sekwencja docelowa jest klonowana do tego wektora w celu wytworzenia plazmidu gRNA</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 i EGFP zoptymalizowane pod kątem kodonów plazmid o koekspresji</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 100 &mikro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Technologia transfekcji mikroporatora</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>odczynnik do ekstrakcji genomowego DNA</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Szybki mini zestaw plazmidowy</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Plasmid Kit Bez endotoksyn&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select mix do CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>odczynnik qPCR</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Odczynnik do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna z EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA frakcja V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Maksymalna wydajność Kompetentne ogniwa DH5 i alfa</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>18258012 FBS ESFBS jest poddawany wcześniejszym testom na mysich komórkach ES pod kątem pluripotencji</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Istotne aminokwas</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>bezalkoholowy pojemnik do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inhibitor hodowli komórek F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inhibitor hodowli komórek F1 ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Inhibitor do hodowli komórek F1 ES</td></tr></tbody></table>

generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem crispr/cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Wzmacniacze kontrolują tożsamość komórki, regulując ekspresję genów specyficznych dla tkanek w sposób niezależny od pozycji i orientacji. Te wzmacniacze są często zlokalizowane dystalnie od regulowanego genu w regionach międzygenowych lub nawet w ciele innego genu. Niezależny od pozycji charakter działania wzmacniacza sprawia, że trudno jest dopasować wzmacniacze do genów, które regulują. Delecja regionu wzmacniającego dostarcza bezpośrednich dowodów na aktywność wzmacniacza i jest złotym standardem ujawniającym rolę wzmacniacza w endogennej transkrypcji genów. Konwencjonalne metody delecji oparte na rekombinacji homologicznej zostały prześcignięte przez niedawne postępy w technologii edycji genomu, które umożliwiają szybkie i precyzyjnie zlokalizowane zmiany w genomach wielu organizmów modelowych. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 może być wykorzystywana do manipulowania genomem w wielu typach komórek i organizmach szybko i tanio, ze względu na łatwość, z jaką Cas9 może być kierowany do genomu przez przewodnik RNA z plazmidu ekspresyjnego na zamówienie. Homozygotyczna delecja podstawowych elementów regulatorowych genów może prowadzić do śmiertelności lub zmiany fenotypu komórkowego, podczas gdy monoalleliczna delecja wzmacniaczy transkrypcji pozwala na badanie cis-regulacji ekspresji genów bez tego kłopotliwego problemu. Przedstawiono protokół delecji za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). Delecja monoalleliczna, badanie przesiewowe i analiza ekspresji są ułatwione dzięki polimorfizmom pojedynczego nukleotydu (SNP) między dwoma allelami, które występują średnio co 125 pz w tych komórkach.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje komórki ES F1 do badania regulacji cis ekspresji genów w komórkach z monoalleliczną delecją enhancera, wytworzonych przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9 (Ryc. 1). Kluczowymi czynnikami w tym podejściu są projekt gRNA oraz allelospecyficznych starterów do genotypowania i analizy ekspresji genów. Każdy zestaw starterów allelospecyficznych musi zostać zwalidowany za pomocą qPCR w celu potwierdzenia specyficzności allelicznej. Ide...

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie allelospecyficznej delecji zapośredniczonej przez CRISPR/Cas9 do badania regulacji transkrypcji genów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Główną zaletą tej techniki, która wykorzystuje genom hybrydowy do generowania i analizowania delecji monoallelicznych, jest wyeliminowanie konieczności analizowania wzmocnionych delecji monoallelicznych, które mogą nie być żywotne.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, takie jak: który gen jest regulowany przez konkretny enhancer i w jakim stopniu aktywność tego genu zależy od pojedynczego enhancera. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat pluripotencji komórek macierzystych, można ją zastosować również w innych systemach.Na przykład może nam to pomóc zrozumieć, w jaki sposób komórki macierzyste zmieniają swój los, aby stać się neuronami, komórkami krwi lub mięśniami. Po zaprojektowaniu, skonstruowaniu i potwierdzeniu sekwencji przewodzącego RNA, czyli gRNA, który zostanie użyty, przygotuj się do transfekcji plazmidów wolnych od endotoksyn do komórek ES. Używając wirówki, odwiruj 1×10⁶ embrionalnych komórek macierzystych F1, uzyskanych z krzyżowania Mus musculus 129 z Mus castaneus, w probówce 1,5 ml przy 300 ×g przez pięć minut.Po wirowaniu odlej nadsącz i dodaj 100 µL buforu do resuspensji dostarczonego przez producenta zestawu. W celu delecji docelowego regionu DNA dodaj po 5 µg plazmidów P Cas9 GFP gRNA 5-prime oraz 3-prime. Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj zawartość.Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie, używając końcówki elektronicznej pipety mikroporatora, należy pobrać 100 µL mieszaniny do elektroporacji, dbając o to, aby do końcówki nie dostało się powietrze. Następnie pipetę należy włożyć do urządzenia do transfekcji.Wybierz odpowiedni protokół i naciśnij start. Podczas trwania elektroporacji obserwuj końcówkę. Przy prawidłowej konfiguracji z elektrody w probówce powinny wydostawać się maleńkie pęcherzyki.Iskra wskazuje na obecność pęcherzyka powietrza i zakłóci proces transfekcji. W takim przypadku należy powtórzyć elektroporację z użyciem nowej partii komórek. Po elektroporacji należy przenieść transfekowane komórki do dziesięciocentymetrowej szalki powlekanej żelatyną zawierającej dziesięć mililitrów pożywki dla komórek ES.Inkubować transfektowane komórki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Po 48 godzinach, przy użyciu cytometru przepływowego, posortować i wyizolować GFP-dodatnie komórki ES. Następnie wysiać od 1 do 1,5 × 10⁴ GFP-dodatnich komórek do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm, pokrytego żelatyną i zawierającego 10 ml pożywki dla komórek ES.Wysiewanie przy tak niskiej gęstości ułatwi wyizolowanie pojedynczych kolonii komórek ES. Po czterech do pięciu dniach należy użyć mikroskopu, aby zidentyfikować pojedyncze, kuliste kolonie komórek ES. Za pomocą pipety przenieść każdą kolonię do osobnej studzienki płytki 96-dołkowej, uprzednio potraktowanej żelatyną i zawierającej 30 µL tripsomu.Po pobraniu wszystkich kolonii i ich dysocjacji w pożywce, hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, aż większość dołków osiągnie ponad 70% konfluencji. Zazwyczaj trwa to około dwóch dni. Gdy komórki będą gotowe do pasażowania, usunąć pożywkę i dodać 30 µL trypsyny.Inkubować komórki przez pięć minut. Następnie do każdej studniki dodać 180 µL pożywki dla komórek ES, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Z każdej studzienki przenieś 70 µL do każdej z trzech powlekanych żelatyną płytek 96-dołkowych zawierających 130 µL pożywki dla komórek ES w każdej studzience. Inkubuj w temperaturze 37 °C. Gdy płytki osiągną 70 do 85% konfluencji, wykorzystaj je do przeprowadzenia genotypowania i analizy ekspresji każdego klonu, zgodnie z opisem w następnych sekcjach.Zamrozić zapasy komórek zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Następnie zostaną zaprojektowane cztery zestawy starterów w celu przesiewania klonów pod kątem pożądanej delecji. Obejmują one: startery wewnętrzne, startery zewnętrzne oraz startery flankujące gRNA dla miejsc docelowych gRNA na końcach 5' oraz 3'.Zacznij od odwiedzenia pokazanej tutaj strony internetowej, aby uzyskać ścieżkę polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) odpowiadającą genotypom 129 i Cas. Prowadzi ona do strony internetowej Mitchell Lab CRISPR. Tam kliknij podany link.Strona przekieruje do przeglądarki genomu UCSC zawierającej ścieżkę wyświetlającą polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) pomiędzy genomami 129 i Cas w asemblacji genomu myszy MM-9. Następnie wprowadź współrzędne regionu do usunięcia i kliknij „go”. Powiększ region o wielkości około 500 par zasad w środku pożądanego miejsca delecji, zawierający więcej niż trzy SNP.Projektowanie starterów specyficznych dla allelu może być skomplikowane, jeśli polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) są nieliczne. Jeśli nie jest możliwe zaprojektowanie absolutnie specyficznych starterów allelicznych, można zastosować umiarkowanie specyficzne startery alleliczne. Należy jednak pamiętać o porównaniu wartości CT między klonami z delecją a klonami bez delecji podczas analizy wyników qPCR.Teraz kliknij „View” w górnym panelu. Z menu rozwijanego wybierz „DNA”. Pojawi się strona „Get DNA in Window”.W opcjach formatowania sekwencji wybierz wszystkie wielkie litery, a następnie kliknij „Get DNA”, aby wyświetlić sekwencję docelową w formacie wielkich liter. Skopiuj tę sekwencję i wklej ją do pliku dokumentu Word. Następnie porównaj sekwencję ze ścieżką snipów 129 cast, zaznacz pozycje snipów i oznacz snipy 129 małymi literami.Po zakończeniu pracy z sekwencją 129, skopiuj ją, aby utworzyć dwie sekwencje sformatowane w standardzie fast day. Jedną dla 129 i jedną dla Cas. W sekwencji Cas zastąp każdą zasadę w pozycji snip odpowiednią zasadą, zaznaczając snip małą literą.Następnie oznacz sekwencję odpowiednim genomem, 129 lub Cas. Potem w przeglądarce wpisz adres strony Primer3Plus. W odpowiednim polu wklej sekwencję 129 z podstawionym fragmentem.Użyj ustawień domyślnych do zaprojektowania starterów. Aby zaprojektować wewnętrzne startery specyficzne dla alleli, kliknij menu rozwijane po prawej stronie Task i wybierz Primer List, a następnie kliknij Pick Primers. Otworzy się nowa strona wyświetlająca listę starterów forward i reverse.Zaznacz pole wyboru, aby wybrać starter bezpośredni lub odwrotny, który posiada SNP oznaczony małą literą na końcu 3' lub w obrębie czterech zasad od końca 3'. Należy zauważyć, że startery z SNP na końcu 3' wykazują zwiększoną specyficzność allelową podczas qPCR. Kliknij „Send to Primer3 Manager” na dole ekranu.Otworzy się nowa strona wyświetlająca wybrany starter. Aby wybrać drugi starter, należy wrócić do strony z listą starterów, a następnie kliknąć przycisk wstecz, aby powrócić do strony głównej. Z rozwijanego menu zadań należy wybrać Detekcję.Strona główna zostanie odświeżona, a na dole pojawią się pola na sekwencje prawego i lewego primera. Wklej sekwencję pierwszego primera w odpowiednim polu. Następnie przejdź do karty General Settings, znajdującej się obok karty Main, i zmień ustawienie zakresu wielkości produktu na od 80 do 200 par zasad.Kliknij „Pick Primers”. Otworzy się strona wyświetlająca pięć możliwych par starterów dla pierwszej sekwencji startera. Wybierz zestaw starterów z listy par starterów, zaznaczając pola po lewej stronie starterów, a następnie kliknij „Send to Primer3 Manager” na dole ekranu. Będą to wewnętrzne startery specyficzne dla allelu 129.Powtórz te kroki, aby zaprojektować startery dla allelu cast. Następnie zastosuj tę technikę do projektowania zewnętrznych starterów specyficznych dla allelu oraz starterów niespecyficznych dla allelu. Na koniec sprawdź specyficzność alleliczną starterów za pomocą qPCR zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.Wyizoluj genomowe DNA z wcześniej przygotowanej płytki 96-dołkowej. Krótko odwiruj płytkę, aby skroploną wodę osadzić na dnie dołków. DNA to będzie służyć jako matryca do screeningu delecji.Następnie, na płytce 384-dołkowej, przeprowadź qPCR w duplikacie dla każdego klonu. Zastosuj dwuetapową PCR, a następnie analizę krzywej topnienia z detekcją. Po zakończeniu przebiegu sprawdź w pierwszej kolejności amplifikację każdego allelu przy użyciu wewnętrznych starterów specyficznych dla allelu.Brak amplifikacji jednego allelu lub różnica w wartościach CT wynosząca więcej niż pięć cykli między allelami sugeruje, że klony te posiadają delecję heterozygotyczną. Brak amplifikacji obu alleli sugeruje, że posiadają one delecję homozygotyczną. Następnie należy sprawdzić amplifikację każdego allelu przy użyciu zewnętrznych starterów specyficznych dla allelu.Jeśli docelowa delecja jest większa niż 1 KB, amplifikacja za pomocą zewnętrznych starterów zajdzie tylko w przypadku obecności delecji. Wartość CT od 22 do 28 potwierdza delecję. W przypadku docelowych delekcji mniejszych niż 1 KB należy potwierdzić rozmiar amplikonu za pomocą elektroforezy.Płytka 96-dołkowa z klonami delecyjnymi została przesiewana metodą qPCR przy użyciu allelospecyficznych starterów wewnętrznych. Szare słupki reprezentują amplifikację ze starterów specyficznych dla Cas, a czarne słupki reprezentują amplifikację ze starterów specyficznych dla 129. Niska wartość CT lub brak amplifikacji przy użyciu starterów wewnętrznych wskazuje na delecję docelową.Klony z delecją w jednym lub obu allelach są następnie przesiewane za pomocą starterów zewnętrznych. W przypadku starterów zewnętrznych amplifikacja potwierdza obecność delecji. Klony z delecją monoalleliczną są przesiewane przy użyciu starterów flankujących regiony docelowe gRNA, aby potwierdzić brak insercji lub delecji, zwanych indels, w allelu niedelecyjnym.W późniejszej analizie ekspresji wykorzystano wyłącznie klony monoalleliczne, w których nie wystąpiły duże indle w miejscach docelowych na nieusuniętym allelu. Przedstawione tutaj są reprezentatywne wyniki z klonów z delecją 129 lub Cas SCR. SCR to niedawno opisany specyficzny dla Sox2 wzmacniacz w komórkach ES.Czerwone słupki reprezentują ekspresję allelu Sox2 Cas, a niebieskie słupki reprezentują amplifikację allelu Sox2 129. Jak widać na tej rycinie, delecja SCR w allelu 129 lub Cas zmniejszyła ekspresję Sox2 w CIS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wygenerować dużą delecję przy użyciu technologii CRISPR oraz jak wykorzystać startery specyficzne dla alleli do genotypowania usuniętych klonów.

generating-crisprcas9-mediated-monoallelic-deletions-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do generowania delecji monoallelicznych w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w celu badania regulacji transkrypcji genów i aktywności wzmacniaczy.

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów