Name: Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Odkryj metodę hodowli organotypowej glejaka do analizy migracji komórek nowotworowych. Technika zachowuje architekturę tkanki in vivo i pozwala badać odpowiedzi na leczenie u konkretnych pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Dr. Lee Niswanderowi i Dr. Radzie Massarwa za ich wiedzę techniczną i wkład w opisany tutaj protokół obrazowania konfokalnego z hodowlą warstw. Podziękowania należą się również dr Kalenowi Dionne, który dostarczył wiedzy specjalistycznej dotyczącej optymalizacji parametrów cięcia tkanki guza mózgu i hodowli.

<ol><li>Beadle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myosin+II+in+glioma+invasion+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The role of myosin II in glioma invasion of the brain.</a> Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).</li>
<li>Farin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+glioma+cells+migrate+and+proliferate+on+host+brain+vasculature%3A+a+dynamic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis.</a> Glia. 53, 799-808 (2006).</li>
<li>Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+motility+occurs+in+the+absence+of+actin+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer.</a> Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).</li>
<li>Ivkovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+myosin+II+effectively+blocks+glioma+invasion+in+the+presence+of+multiple+motogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens.</a> Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).</li>
<li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li>
<li>Chaichana, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+glial+cytoarchitecture+from+ex+vivo+human+tumor+and+non-tumor+cerebral+cortical+explants%3A+A+human+model+to+study+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases.</a> J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).</li>
<li>Grube, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+fatty+acid+synthase+in+human+gliomas+correlates+with+the+WHO+tumor+grade+and+inhibition+with+Orlistat+reduces+cell+viability+and+triggers+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis.</a> J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).</li>
<li>Hovinga, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate.</a> Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neurooncol. 15, 670-681 (2013).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vorinostat+modulates+cell+cycle+regulatory+proteins+in+glioma+cells+and+human+glioma+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures.</a> J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).</li>
<li>Verhaak, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analysis+identifies+clinically+relevant+subtypes+of+glioblastoma+characterized+by+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22in+PDGFRA%2C+IDH1%2C+EGFR%2C+and+NF1.+Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities.</a> in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).</li>
<li>Gill, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-localized+biopsies+reveal+subtype-specific+differences+in+molecular+and+cellular+composition+at+the+margins+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).</li>
<li>Snuderl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+amplification+of+multiple+receptor+tyrosine+kinase+genes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma.</a> Cancer cell. 20, 810-817 (2011).</li>
<li>Kakita, A., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+dynamics+of+SVZ+cell+migration+in+the+postnatal+forebrain%3A+monitoring+living+progenitors+in+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations.</a> Neuron. 23, 461-472 (1999).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking in cell and developmental biology.</a> Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).</li>
<li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gefitinib+selectively+inhibits+tumor+cell+migration+in+EGFR-amplified+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma.</a> Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).</li>
<li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudopalisades+in+glioblastoma+are+hypoxic%2C+express+extracellular+matrix+proteases%2C+and+are+formed+by+an+actively+migrating+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population.</a> Cancer Res. 64, 920-927 (2004).</li>
<li>Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+induced+by+hypoxia+may+mediate+hypoxia-initiated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis.</a> Nature. 359, 843-845 (1992).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21446047">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60, 502-514 (2012).</li>
<li>Di Cristofori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar+H%2B+ATPase+is+a+novel+therapeutic+target+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma.</a> Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).</li>
<li>Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+comprehensive+characterization+of+a+faithful+tissue+culture+model+of+the+benign+and+malignant+human+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate.</a> Lab Invest. 94, 208-221 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Organotypowe kultury warstwowe z ludzkiej tkanki nowotworowej stanowią atrakcyjną i niedostatecznie wykorzystywaną platformę do przedklinicznych eksperymentów translacyjnych. Brakuje zrozumienia zachowań komórek nowotworowych na poziomie populacji w odniesieniu do migracji, proliferacji i śmierci komórek w natywnym mikrośrodowisku guza. Co najważniejsze, badanie odpowiedzi guza na terapię w sposób dynamiczny, rozdzielczy w czasie na poziomie zachowania komórek może rzucić światło na nowe mechanizmy oporności na leczenie....

Badanie laboratoryjne glejaka (GBM) jest utrudnione przez brak modeli, które wiernie odwzorowują wymagane cechy patologiczne ludzkiej choroby, a mianowicie migrację i inwazję komórek nowotworowych. Badania porównawcze testów inwazji 2D i 3D in vitro, a także modele hodowli 3D plastrów gryzoni ujawniły mechanistycznie rozbieżne programy migracji komórkowej w tych dwóch kontekstach, potencjalnie ograniczając przekładalność wyników z systemów 2D na chorobę ludzką1,2,3. Opisany tutaj organotypowy paradygmat hodowli i obrazowania plastrów guza pozwala na badanie migracji komórek nowotworowych w obrębie wycinków ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo uzyskanej z resekcji chirurgicznej. W ten sposób hodowle warstwowe chirurgicznie wyciętej tkanki nowotworowej w połączeniu z poklatkową mikroskopią konfokalną stanowią platformę do badania migracji komórek nowotworowych w natywnym mikrośrodowisku bez rozpuszczania tkanek lub pasażowania hodowli.
Istnieje obszerna literatura wykorzystująca modele hodowli GBM z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworów, nowotworów wywołanych retrowirusem oraz nakładki komórkowe do badania inwazji nowotworów1,2,3,4,5. Ostatnio kilka grup opisało generowanie organotypowych kultur warstwowych bezpośrednio z ludzkiej tkanki GBM6,7,8,9,10. Istnieje jednak wyraźna różnica między opublikowanymi protokołami w odniesieniu do techniki krojenia i pożywek hodowlanych. Co więcej, zastosowanie organotypowych kultur warstwowych skupiło się na statycznych eksperymentalnych punktach końcowych, które obejmowały zmiany w sygnalizacji komórkowej, proliferacji i śmierci. Opisany tutaj protokół rozszerza wcześniejsze paradygmaty hodowli warstwowej, włączając czasowo-rozdzielczą obserwację dynamicznych zachowań komórek nowotworowych za pomocą poklatkowej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Niedawne odkrycie zmienności genetycznej inter11 i intratumoral12,13 genetycznej zmienności w ludzkim GBM podkreśla znaczenie powiązania tej heterogeniczności z zachowaniem komórek nowotworowych i jej implikacjami dla odpowiedzi guza na terapię. W tym miejscu przedstawiamy uproszczony i powtarzalny protokół wykorzystania bezpośrednich kultur warstwowych z ludzkiej tkanki nowotworowej do wizualizacji migracji komórek nowotworowych w czasie zbliżonym do rzeczywistego.

<table><tbody><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy&nbsp;</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>12349-015</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez surowicy</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Zawiesina nystatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638-20ML</td><td>10 000 jednostek/ml w DPBS, przetwarzany aseptycznie, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>16520-050</td><td>Topi się w 65,5 i #176; C, Pozostaje płynny w 37 i #176; C i szybko spada poniżej 25 &#176;C.</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4 z Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher (sondy molekularne)</td><td>I32450</td><td>Stosowany w pożywkach do oznaczania mikrogleju/makrofagów</td></tr><tr><td>pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector</td><td>Clonetech</td><td>632520</td><td></td></tr><tr><td>Retro-X Concentrator&nbsp;</td><td>Clonetech</td><td>31455</td><td>Żywica wiążąca do koncentracji supernatantów wirusowych bez ultrawirowania</td></tr><tr><td>pVSG-G Wektor</td><td>Clonetech</td><td>631530</td><td>część Retro-X Universal Retroviral Expression System</td></tr><tr><td>GP2-293 Wirusowe komórki pakujące</td><td>Clonetech</td><td>631530</td><td>część Retro-X Universal Retroviral Expression System</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy (Super Glue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z105899</td><td>Średni</td></tr> <tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania Peel-A-Way (kwadratowy - S22)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A-1</td><td>Formy do osadzania próbek nowotworowych</td></tr><tr><td>Mikroszpatułki ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50823</td><td>Przyrząd do zginania 45 stopni na szyjce ostrza łyżki</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze preparacyjne Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka z pojedynczą krawędzią (amerykańskie maszynki do golenia)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-989-001</td><td>Krawędź ostrza ma grubość 0,009 cala. Zaciśnięta osłona z krawędzią jest zdejmowana przed załadowaniem na wibratome.</td></tr><tr><td>Leica VT1000 S Wibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowa wkładka do hodowli komórkowych z PTFE&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 &mikro; m Wielkość porów</td></tr><tr><td>35 mm Naczynia ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C Tuleja</td><td>szklana o średnicy 20 mm. Grubość szkła nakrywkowego 1,5 mm</td></tr><tr><td>Mikoskop konfokalny LSM 510</td> Obiektyw powietrzny <td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>10x (c-Apochromat NA 0,45)</td></tr><tr><td>Inkubator PECON Stagetop</td><td>PeCON Niemcy</td><td>(Wycofany)</td><td>Inkubator PM 2000 RBT to kompaktowy produkt przeznaczony do użytku z mikroskopami Zeiss.</td></tr></tbody></table>

organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glejak wielopostaciowy (GBM) nadal ma bardzo złe rokowania kliniczne, pomimo chirurgii, chemioterapii i radioterapii. Postępująca inwazja guza na otaczający miąższ mózgu stanowi trwałe wyzwanie terapeutyczne. Aby opracować terapie antymigracyjne dla GBM, niezbędne są systemy modelowe, które zapewniają fizjologicznie istotne tło dla kontrolowanych eksperymentów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół generowania kultur warstwowych z ludzkiej tkanki GBM uzyskanej podczas resekcji chirurgicznej. Hodowle te pozwalają na eksperymenty ex vivo bez przechodzenia przez ksenoprzeszczepy zwierzęce lub hodowle jednokomórkowe. Ponadto opisujemy zastosowanie poklatkowej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej w połączeniu ze śledzeniem komórek w celu ilościowego zbadania zachowania migracyjnego komórek nowotworowych i związanej z tym odpowiedzi na terapie. Plastry są generowane w sposób powtarzalny w ciągu 90 minut od pobrania tkanki chirurgicznej. Znakowanie komórek fluorescencyjnych za pośrednictwem retrowirusa, obrazowanie konfokalne i analizy migracji komórek nowotworowych są następnie wykonywane w ciągu dwóch tygodni od hodowli. Udało nam się wykorzystać te kultury warstwowe do odkrycia czynników genetycznych związanych ze zwiększonymi zachowaniami migracyjnymi u ludzi. Ponadto zweryfikowaliśmy zdolność modelu do wykrywania specyficznych dla pacjenta zmian w odpowiedzi na terapie antymigracyjne. Idąc dalej, ludzkie kultury warstwowe GBM są atrakcyjną platformą do szybkiej oceny ex vivo wrażliwości guza na środki terapeutyczne w celu rozwoju spersonalizowanej terapii neuroonkologicznej.

Nasz zespół z sukcesem przygotował hodowle plastrów z tkanek pochodzących od ponad 50 pacjentów poddawanych pierwotnej resekcji GBM. Protokół ten, obejmujący przygotowanie plastrów, ich hodowlę, znakowanie retrowirusowe, obrazowanie oraz analizę migracji, został zoptymalizowany do postaci powtarzalnego schematu postępowania (Rysunek 1). Co kluczowe, te organotypowe plastry GBM wykazują zgodność z wyjściową tkanką nowotworową przez cały okres hodowli, w tym zachowują cechy...

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja i analiza inwazyjnych zachowań migracyjnych w pierwotnych ludzkich komórkach glejaka wielopostaciowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuroonkologii, takie jak: jakie właściwości fenotypowe i molekularne leżą u podstaw różnic w progresji choroby i odpowiedziach na leczenie u poszczególnych pacjentów? Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej manipulacji pierwotnymi komórkami przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej in vivo oraz heterogeniczności komórkowej glejaka wielopostaciowego.Zacznij od użycia sterylnej pęsety do umieszczenia pustych wkładów hodowlanych z PTFE w każdej studience płytki sześciodołkowej zawierającej jeden mililitr pożywki do utrzymania hodowli przekrojów na studienkę. Po umieszczeniu wszystkich wkładów, wprowadź płytkę do nawilżonego inkubatora z płaszczem wodnym do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie umieść fragmenty tkanki guza w szalce Petriego zawierającej lodowatą pożywkę do procesowania i za pomocą pipety delikatnie przemyj tkankę trzy razy świeżą pożywką, aby usunąć przylegające erytrocyty.Po trzecim płukaniu użyj skalpela, aby poc

a-human-glioblastoma-organotypic-slice-culture-model-for-study-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Embriony piskląt są używane do badania ludzkich guzów mózgu z glejakiem (GBM) in ovo i w kokulturach ex vivo. Zachowanie komórek GBM można rejestrować za pomocą mikroskopii poklatkowej w kokulturach ex vivo, a oba preparaty można analizować w eksperymentalnym punkcie końcowym za pomocą szczegółowej analizy konfokalnej 3D.

Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Odkryj metodę hodowli organotypowej glejaka do analizy migracji komórek nowotworowych. Technika zachowuje architekturę tkanki in vivo i pozwala badać odpowiedzi na leczenie u konkretnych pacjentów.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Przeglądaj więcej filmów