Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu
1 grudnia 2017
Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych genów kandydujących na zaburzenia wad rozwojowych mózgu i bezpośrednie potwierdzenie ich przyczynowej roli in vivo. Strategia ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii poprzez odkrycie szlaków molekularnych związanych z rozwojem mózgu i skorelowanymi patologiami. Główną zaletą tej strategii jest to, że pomoże ona w odkryciu nowych genów związanych z zaburzeniami mózgu oraz w opracowaniu nowych narzędzi diagnostycznych.
Korzystając z tego podejścia, możemy ujawnić kluczowy wkład genu C6orf70 w patogenezę okołokomorowej heterotopii guzkowej, wady rozwojowej mózgu spowodowanej nieprawidłową migracją neuronów. Procedurę zademonstruje Fabienne Schaller, inżynier z naszego laboratorium. Przygotuj ciężarną szczurkę E15 do zabiegu zgodnie z pisemnym protokołem oraz zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.
Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, że maść okulistyczna jest nałożona na oczy oraz że brzuch jest odpowiednio ogolony i zdezynfekowany. Po użyciu ostrych nożyczek do wykonania dwucentymetrowego pionowego nacięcia w skórze i mięśniu ogonowym linii środkowej brzucha, ostrożnie odsłoń jeden róg macicy od jamy brzusznej. Nałóż kroplami wstępnie podgrzany roztwór soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby nawilżyć zarodki.
Utrzymuj macicę wilgotną przez cały czas trwania zabiegu. Aby wstrzyknąć DNA, delikatnie trzymaj zarodek w jednej ręce z łatwo dostępną głową. Następnie, używając drugiej ręki, ostrożnie włóż szklaną kapilarnę połączoną z mikrowstrzykiwaczem do lewej bocznej komory, która znajduje się jeden milimetr od linii środkowej i na głębokości dwóch do trzech milimetrów.
Użyj mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć około jednego mikrolitra DNA z szybkim zielonym kolorem, aby umożliwić wizualne monitorowanie wstrzyknięcia. Aby naelektryzować DNA do komórek, najpierw upuść zwykły roztwór soli fizjologicznej na powierzchnię elektrody o wymiarach trzy na siedem milimetrów. Następnie umieścić elektrodę dodatnią po stronie wstrzyknięcia, a elektrodę ujemną po stronie niewstrzykniętej prawej komory.
Użyj pedału sterowanego nożnie, aby dostarczyć pięć impulsów elektrycznych w odstępach 950 milisekund. Po elektroporacji należy przywrócić róg macicy do jamy brzusznej i dodać sterylną sól fizjologiczną, aby umożliwić zarodkom bardziej naturalne ułożenie i uwzględnić śródoperacyjną utratę płynów. Zamknij ścianę mięśniową wchłanialnymi szwami chirurgicznymi, a następnie skórę za pomocą prostego przerwanego szwu.
Zapewnij znieczulenie pooperacyjne przez okres do 48 godzin lub zgodnie ze wskazaniami wytycznych instytucjonalnych. Wróć szczura do czystej klatki domowej i monitoruj go, aż wyjdzie ze znieczulenia. Po utrwaleniu mózgów w 4% paraformaldehydzie, jak opisano w pisemnej części protokołu, myj w PBS przez 10 minut.
Podczas mycia przygotuj 50 mililitrów 4% agaru w PBS dbając o to, aby temperatura rozpuszczonej agarozy nie przekraczała 50 stopni Celsjusza. Wlej agarozę do plastikowych foremek do zatapiania, a następnie umieść mózgi w agarozie. Umieść osadzone mózgi w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pozwól agarozie polimeryzować przez co najmniej godzinę.
Po spolimeryzowaniu agarozy przytnij nadmiar agarozy z okolic mózgu, a następnie przyklej mózg do płytki podstawy wibratomu z przednim tylnym dostępem mózgu prostopadłym do ostrza. Po odczekaniu kilku minut, aż klej wyschnie, umieść płytkę z przyklejonym mózgiem w komorze wibratomowej. Napełnij wibratomem PBS i zacznij kroić odcinki o grubości 100 mikronów.
Po pocięciu na sekcje przenieś skrawki na szkiełka mikroskopowe i usuń nadmiar płynu. Następnie dodaj kilka kropli podłoża montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu sekcji. Pozostawić do wyschnięcia na noc.
Zobrazuj przekroje przy użyciu 10-krotnego powiększenia na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Aby przeanalizować obrazy, najpierw przekonwertuj obraz na 8-bitowy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do ilościowej analizy obrazu. Następnie wybierz jedną reprezentatywną dodatnią komórkę fluorescencyjną GFP i ręcznie zdefiniuj jej kształt, klikając oszacowanie i używając narzędzia wyboru z wolnej ręki, aby narysować granicę komórki.
Oprogramowanie automatycznie zachowuje próg średnicy i intensywności ogniwa. Kliknij znajdź komórki, aby umożliwić oprogramowaniu zlokalizowanie transfekowanych komórek w całej korze mózgowej. Następnie, w razie potrzeby, ręcznie usuń wyniki fałszywie dodatnie.
Podziel całą grubość kory na osiem obszarów zainteresowania, znormalizowanych w poszczególnych sekcjach, klikając narzędzie regionu, wybierając osiem pasków regionu, gdzie paski jeden i osiem odpowiadają odpowiednio strefie komorowej i górnej części płytki korowej. Następnie kliknij Zastosuj, aby umożliwić oprogramowaniu policzenie względnej pozycji komórek transfekowanych GFP w całej korze mózgowej. Na koniec kliknij Zapisz kwantyfikację, aby wyeksportować dane do pliku Excel do analizy.
Sekwencjonowanie macierzy CGH i całego egzomu zidentyfikowało C6orf70 jako gen kandydujący do nieprawidłowości genowych w rozwoju. Ilościowy PCR ustalił, że gen ten, wraz z PHF10 i DLL1, ulega ekspresji w korze mózgowej szczura. Poniższe obrazy pokazują reprezentatywne odcinki koronalne kory nowej mózgu szczura E20 5 dni po elektroporacji z samym konstruktem białka zielonej fluorescencji lub w połączeniu z shRNA ukierunkowanym na sekwencję kodującą C6orf70 lub ze względnie nieefektywnym konstruktem niedopasowania.
Knock down filamentu A został wykorzystany do kontroli upośledzonej migracji neuronów. Elektroporacja in utero z shRNA ukierunkowanym na C6orf70 lub włókno A indukowała zatrzymanie komórek GFP dodatnich w strefie komorowej, jak wskazano białymi strzałkami, podczas gdy komórki wyrażające GFP samodzielnie lub w połączeniu z konstruktem niedopasowania nie zmieniały migracji neuronów. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, który stan genezy kory mózgowej chcesz przeanalizować: proliferację neuronów, migrację lub dojrzewanie.
Nie zapominaj, że nauka wykonywania elektroporacji w macicy w mózgu embrionalnym gryzoni wymaga długiego okresu treningu, umiejętności i regularnej praktyki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na identyfikacji nowych genów kandydackich związanych z okołokomorową heterotopią guzkową (PNH), częstą wadą rozwojową kory mózgowej. Celem badań jest potwierdzenie sprawczej roli tych genów in vivo, co pozwoli na pogłębienie naszej wiedzy na temat wad rozwojowych mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Genetyka
- Rozwój mózgu
Wstęp
- Periventrykularna heterotopia guzkowa jest rozpowszechnioną postacią wad rozwojowych kory mózgu u osób dorosłych.
- Podłoże genetyczne większości przypadków sporadycznych pozostaje w dużej mierze nieznane.
- Identyfikacja genów kandydackich może doprowadzić do opracowania lepszych narzędzi diagnostycznych.
- Zrozumienie szlaków molekularnych jest kluczowe dla rozwiązywania problemów związanych z zaburzeniami rozwoju mózgu.
Cel badania
- Zidentyfikowanie nowych genów kandydackich dla zaburzeń rozwojowych mózgu.
- Potwierdzenie sprawczej roli tych genów in vivo.
- Pogłębienie zrozumienia szlaków molekularnych związanych z rozwojem mózgu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ciężarnych szczurów w 15. dniu ciąży (E15) do procedur eksperymentalnych.
- Zastosowanie nowej strategii w celu identyfikacji genów kandydackich.
- Potwierdzenie funkcji genów in vivo.
- Przestrzeganie instytucjonalnych i krajowych wytycznych podczas przeprowadzania procedury.
Główne wyniki
- Identyfikacja roli genu C6orf70 w patogenezie PNH.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez inżynierkę laboratoryjną Fabienne Schaller.
- Potencjał opracowania nowych narzędzi diagnostycznych w oparciu o uzyskane wyniki.
- Wnioski dotyczące nieprawidłowej migracji neuronów związanej z PNH.
Wnioski
- Badanie pomyślnie identyfikuje kluczowe geny powiązane z malformacjami mózgu.
- Potwierdzenie roli genów in vivo jest niezbędne dla zrozumienia PNH.
- Wyniki mogą doprowadzić do postępów w metodologiach diagnostycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja array-CGH, sekwencjonowania całego eksomu oraz elektroporacji in utero umożliwia systematyczną identyfikację i walidację funkcjonalną genów sprawczych w malformacjach mózgu. Ten schemat postępowania wypełnia krytyczną lukę w powiązywaniu wyników genomicznych z biologicznymi mechanizmami in vivo, zwiększając pewność prognostyczną w wyborze celów dla zaburzeń neurorozwojowych. Podejście to usprawnia proces podejmowania decyzji w zakresie rozwoju portfolio poprzez dostarczenie bezpośrednich dowodów na funkcję genu w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji kandydującego genu in vivo w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie zmian genomicznych z efektami fenotypowymi.
- Ułatwia priorytetyzację celów genetycznych do dalszych badań terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane modele gryzoni do późniejszego przesiewu interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Zapewnia ilościowe i powtarzalne odczyty migracji neuronalnej oraz rozwoju kory mózgowej.
- Umożliwia standaryzację testów fenotypowych w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia modele przedkliniczne z fenotypami chorób ludzkich w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do funkcjonalnej walidacji in vivo.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez potwierdzenie przyczynowości w systemach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta zintegrowana strategia łączy odkrycia genomowe z walidacją in vivo, sytuując ją na styku wczesnych etapów odkrywania i badań przedklinicznych nad zaburzeniami neurorozwojowymi.
- Biologia odkrywcza: Łączy identyfikację genów kandydackich z analizą funkcjonalnych szlaków w modelach gryzoni.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, specyficznych dla regionu pomiarów migracji neuronalnej w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne i kwantyfikację pozycyjną do porównywania zaburzeń genetycznych.
- Badania translacyjne: Koreluje fenotypy modeli zwierzęcych z wynikami obrazowania klinicznego w celu określenia istotności biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modularny przepływ pracy, który można dostosować do różnych genów docelowych i fenotypów malformacji mózgu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje funkcjonalne testy in vivo i wspiera powtarzalność wyników między zespołami.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie bezpośrednich dowodów na przyczynowo-skutkowy związek między genem a chorobą.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genetycznych dla wskazań neurorozwojowych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektroporacji in utero u gryzoni oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do infrastruktury sekwencjonowania genomicznego, mikroiniekcji oraz obrazowania konfokalnego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja oceny fenotypowej i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych etapów rozwoju lub obszarów mózgu może wymagać optymalizacji protokołu.
- Długie okresy szkolenia oraz biegłość techniczna są niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników in vivo.
