Name: CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę CN-GELFrEE do separacji natywnych kompleksów białkowych z zachowaniem interakcji nikowalencyjnych. Technika zapewnia wysoką wydajność i rozdzielczość przy niskim rozcieńczeniu próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundacja W. M. Keck hojnie przekazała fundusze na tę pracę. Niniejszy materiał oparty jest na pracach wspieranych przez grant badawczy FAPERJ 100.039/2014 rządu stanu Rio de Janeiro - Brazylia dla R.D.M., Stypendium Nauki bez Granic 88888.075416/2013-00 od Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadry Szkolnictwa Wyższego, przy rządzie Brazylii, dla H.S.S., National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach stypendium numer 2014171659 dla OSS, oraz w ramach grantu badawczego CNPq 202011/2012-7 od rządu Brazylii dla L.H.F.D.V. P.C.H. jest laureatem nagrody Northwestern University's Chemistry of Life Processes Institute Postdoctoral Fellowship Award.

Uwaga: Niniejszy protokół wideo opiera się na powiązanej publikacji9. Konkretne odczynniki, materiały i sprzęt niezbędne do wykonania wszystkich kroków opisanych w tym protokole są wymienione w sekcji materiały. Przepisy i informacje dotyczące przygotowania wszystkich wymaganych roztworów wyszczególniono w Tabeli 1.
1. Odlewanie żeli w probówkach gradientowych
<ol>
	<li>Montaż systemu do odlewania
	<ol>
		<li>Używając podgrzanej nad płomieniem żyletki lub skalpela, przetnij pipetę serologiczną o pojemności 20 ml wzdłuż przekroju ortogonalnego, 10 cm od góry końcówki dozującej. Upewnij się, że powierzchnia cięcia jest gładka. Zachowaj dolną część (z końcówką), a górną utylizuj. Przymocuj pionowo dolną część pipety (stożkową końcówką skierowaną w dół) do statywu. 
		UWAGA: Nie dotykaj rozgrzanego metalu ostrza; używaj odpowiednich uchwytów lub szczypiec, aby uniknąć oparzeń.</li>
		<li>Odetnij 3 cm elastycznego wężyka i podłącz go do przeciętej pipety, naciągając go na końcówkę dozującą. Na drugim końcu wężyka zamocuj zawór sterujący przepływem.</li>
		<li>Połącz dół zaworu z końcówką dozującą mieszalnika gradientowego za pomocą odcinka wężyka. Pozostaw zawór otwarty.</li>
		<li>Ustaw mieszalnik gradientowy na mieszadle magnetycznym. Włóż mieszadła magnetyczne do komór mieszających.</li>
		<li>Ustaw końcówkę dozującą mieszalnika gradientowego 5-10 cm powyżej górnej części fragmentu pipety, aby umożliwić wlewanie żelu siłą grawitacji.</li>
		<li>Przetestuj system pod kątem nieszczelności, używając wody dejonizowanej. Jeśli nie stwierdzono wycieków, przed kontynuacją osusz system, przedmuchując go powietrzem.</li>
		<li>Zaklej górną część fragmentu pipety dwiema lub większą liczbą warstw taśmy. Przebij otwór przez warstwy taśmy w centrum okrągłego otworu. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby szklana rurka przeszła przez niego ciasno.</li>
		<li>Wsuń szklaną rurkę, w której będzie odlewany żel, przez przebity otwór, naciągając taśmę tak, aby szkło przylegało ściśle. Wsuń szklaną rurkę tak, aby jej dno znajdowało się 2 mm nad dnem pipety.</li>
		<li>Po przygotowaniu systemu sprawdź, czy szklana rurka jest stabilnie utrzymana, wycentrowana i nie dotyka ścianki pipety. System jest teraz gotowy do odlewania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlewanie żelu
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor do żelu, roztwory APS i Coomassie (roztwory 1-3, Tabela 1).</li>
		<li>Przygotuj roztwory żelu rozdzielczego 12% T (roztwór 4, Tabela 1) oraz 1% T (roztwór 5, Tabela 1). Do roztworu żelu rozdzielczego 12% T dodaj 10 µl roztworu Coomassie. APS i TEMED dodaj do obu roztworów bezpośrednio przed wlewaniem do mieszalnika gradientowego. 
		UWAGA: Poliakryloamid jest silnie neurotoksyczny i należy używać rękawiczek.</li>
		<li>Upewnij się, że zawór dozujący mieszalnika gradientowego jest zamknięty. Wlej roztwór żelu rozdzielczego 12% T do komory mieszającej znajdującej się najdalej od końcówki dozującej. Otwórz zawór między obiema komorami i pozwól roztworowi przepłynąć do następnej komory.</li>
		<li>Zamknij zawór i pipetuj przemieszczony roztwór żelu rozdzielczego 12% T z powrotem do poprzedniej komory. Przeznaczeniem tego zabiegu jest uniknięcie pęcherzyków powietrza między komorami.</li>
		<li>Dodaj roztwór żelu rozdzielczego 1% T do komory mieszającej znajdującej się najbliżej końcówki dozującej. Włącz mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Otwórz oba zawory mieszalnika gradientowego jednocześnie, aby umożliwić zmieszanie roztworów żelu rozdzielczego i ich przepływ do pipety i szklanej rurki.</li>
		<li>Po wyczerpaniu roztworów żelu rozdzielczego w mieszalniku gradientowym, odłącz wężyk od mieszalnika i podłącz go do strzykawki 10 ml. Upewnij się, że koniec wężyka pozostaje powyżej poziomu cieczy w pipecie do momentu pewnego zamocowania strzykawki.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki delikatnie wypchnij pozostały roztwór żelu rozdzielczego z wężyka do pipety i szklanej rurki. Zamknij zawór pipety, zanim do wnętrza dostaną się pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Delikatnie dodaj warstwę około 0,25 ml nasyconego wodą butanolu (roztwór 6, Tabela 1) na wierzch roztworu żelu wewnątrz szklanej rurki, aby odizolować reakcję polimeryzacji od tlenu z powietrza i spłaszczyć górny menisk.</li>
		<li>Niezwłocznie oczyść aparat do wlewania wodą dejonizowaną (nie używać detergentów).</li>
		<li>Odczekaj całą noc do całkowitej polimeryzacji żelu w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłączanie rurki z żelem z urządzenia i przechowywanie
	<ol>
		<li>Następnego dnia ostrożnie odklej taśmę z góry urządzenia.</li>
		<li>Odłącz zawór od wężyka pod pipetą. Zwolnij pipetę z zacisku i wykonaj kroki 1.3.3. i 1.3.4. nad zlewem.</li>
		<li>Podłącz strzykawkę 10 ml wypełnioną wodą dejonizowaną do elastycznego wężyka. Wtłocz wodę przez wężyk do pipety, powoli wysuwając spolimeryzowany żel z pipety.</li>
		<li>Trzymaj pipetę poziomo i ostrożnie zabezpiecz żel wysuwający się z otwartego końca.</li>
		<li>Odetnij nadmiar poliakryloamidu pod szklaną rurką i wokół niej, używając żyletki. Upewnij się, że koniec żelu wewnątrz rurki jest gładki i zlicowany z końcówką szklanej rurki.</li>
		<li>Usuń pozostały butanol z górnej strony żelu i umieść rurkę z żelem w niezatykanej probówce wirówkowej 15 ml. Wymieszaj 0,5 ml buforu do żelu (roztwór 1, Tabela 1) z 4,5 ml wody ultrapure i dodaj około 2 ml roztworu zarówno na górną stronę (wewnątrz szklanej rurki), jak i na dolną stronę (w probówce wirówkowej) rurki z żelem.</li>
		<li>Zakryj całą górną część probówki wirówkowej, w tym otwór szklanej rurki, parafilmem, aby zapobiec odparowaniu buforu. Żele można przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Zważyć dwa serca mysie i posiekać je w szalce Petriego za pomocą żyletki.</li>
	<li>Przenieść przetworzoną tkankę do moździerza i dodać wystarczającą ilość ciekłego azotu, aby pokryć próbkę. Rozetrzeć tkankę tłuczkiem, dodając więcej ciekłego azotu w miarę jego odparowywania.</li>
	<li>Po dokładnym rozdrobnieniu tkanki pozwolić azotowi odparować i dodać 1 ml buforu lizującego (roztwór 7, Tabela 1) w temperaturze 4 °C na każde 100 mg tkanki. Przenieść roztwór do probówki do wirowania.</li>
	<li>Wirować przy 2,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać nadsącz do nowej probówki i odrzucić osad. Oznaczyć stężenie białka w nadsączu metodą kwasu bicinchonininowego12 lub inną preferowaną metodą. Uwaga: Można przygotować natywne lizaty komórkowe lub frakcje subkomórkowe zgodnie z preferencjami. System CN-GELFrEE jest kompatybilny z różnymi rodzajami natywnych preparatów próbek.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforu solubilizującego oraz roztwór do nakładania (roztwory 8 i 9, Tabela 1).</li>
	<li>Jeśli próbka jest w formie osadu, resuspender ją w 50-150 µl buforu solubilizującego. Próbkę przechowywać na lodzie przez 15 min.</li>
	<li>Przeprowadzić wymianę buforu resuspenderowanej próbki lub lizatu komórkowego na bufor solubilizujący, używając ultraodśrodkowego filtra o progu odcięcia 30 kDa-MWCO.</li>
	<li>Wirować próbkę białka w temperaturze 4 °C przy 10,000 x g przez 5-10 min lub do momentu, aż objętość frakcji zatrzymanej zmniejszy się do około 20 µl. Odrzucić filtrat.</li>
	<li>Dodać 400 µl buforu solubilizującego do frakcji zatrzymanej i wymieszać za pomocą pipety. Wirować w temperaturze 4 °C przy 10,000 x g przez 5-10 min lub do momentu, aż objętość frakcji zatrzymanej zmniejszy się do około 20 µl. Odrzucić filtrat.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.9 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Rozcieńczyć przefiltrowaną próbkę (około 20 µl) w 100 µl buforu solubilizującego.</li>
	<li>Dodać 20 µl roztworu do nakładania do próbki.</li>
</ol>
3. Urządzenie CN-GELFrEE
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić frakcjonowanie CN-GELFrEE, należy zlecić wykonanie części urządzenia warsztatowi tokarskiemu. Części urządzenia powinny zostać wykonane z Teflonu. Wszystkie informacje niezbędne do wykonania części znajdują się na Rysunku 1, a liczba części potrzebnych do jednego urządzenia jest podana w Tabeli 2. 
	Środki bezpieczeństwa: Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Należy zachować ostrożność w pobliżu zasilaczy wysokiego napięcia; wszystkie połączenia muszą być prawidłowo zamontowane. Nie wolno dotykać urządzenia ani żadnego przylegającego mokrego obszaru podczas włączonego napięcia; należy dbać, aby powierzchnia blatu wokół urządzenia pozostała sucha podczas elektroforezy. Ponadto zasilacz powinien być całkowicie wyłączony podczas manipulowania urządzeniem i/lub zbierania frakcji.</li>
	<li>Przygotować bufor anodowy i bufor katodowy (roztwory 10-11, Tabela 1) i przechowywać je w temperaturze 4 °C lub w lodzie.</li>
	<li>Przez górny koniec rurki żelowej (koniec bez żelu) włożyć dystans, oring i drugi dystans, tworząc strukturę typu „kanapka”.</li>
	<li>Za drugim dystansem dołożyć komorę buforową (katodę), przełożyć śruby całkowicie przez otwory boczne, nałożyć i dokręcić nakrętki z obu stron. Należy upewnić się, że górny koniec rurki szklanej jest utwierdzony przed górnym otworem komory buforowej, a nie bezpośrednio pod nim lub za nim.</li>
	<li>Przez dolny koniec rurki żelowej włożyć dystans, oring, komorę zbieralną i drugi dystans.</li>
	<li>Za drugim dystansem dołożyć komorę buforową (anodę), przełożyć śruby całkowicie przez otwory boczne, nałożyć i dokręcić nakrętki z obu stron. Należy upewnić się, że dolny koniec rurki żelowej jest utwierdzony za górnym otworem komory buforowej, blisko tylnej ścianki, ale bez dotykania jej.</li>
	<li>Ustawić urządzenie CN-GELFrEE pionowo, z komorą buforową katody u góry, używając statywu z zaciskami.</li>
	<li>Dolać bufor anodowy do komory buforowej anody (na dole) i bufor katodowy do komory buforowej katody (na górze). Wszystkie bufory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki szklanej poprzez delikatne opukanie rurki i sprawdzić system pod kątem nieszczelności.</li>
	<li>Upewnić się, że elektrody platynowe mają kontakt z buforami w komorach oraz że oba końce rurki żelowej są zanurzone w buforze w każdej z komór.</li>
	<li>Podłączyć przewody zasilające z zasilacza do odpowiednich wtyków bananowych: ujemny do komory buforowej katody (góra) i dodatni do komory buforowej anody (dół).</li>
	<li>Za pomocą końcówki do nakładania żelu nanieść próbkę na górną powierzchnię żelu wewnątrz rurki żelowej.</li>
	<li>Prowadzić elektroforezę przy stałej mocy 1 W, aby uniknąć przegrzania, aż czoło barwnika czerwonego dotrze do dolnej części rurki żelowej. 
	UWAGA: Przed kontynuacją należy wyłączyć zasilacz.</li>
	<li>Wylać bufory anodowy i katodowy.</li>
	<li>Odkręcić nakrętki przy komorze buforowej anody i zdemontować dolny dystans oraz komorę, pozostawiając dystans i oring. Umieścić dolny koniec rurki żelowej wewnątrz komory zbieralnej, przed górnym otworem, a nie za nim lub bezpośrednio pod nim. Przesunąć dystans i oring blisko komory zbieralnej.</li>
	<li>Wyciąć kawałek celulozowej membrany dializacyjnej i nawodnić go poprzez zanurzenie w buforze anodowym. Przykryć otwór między komorą zbieralną a dolnym dystansem za pomocą membrany dializacyjnej.</li>
	<li>Złożyć komorę buforową anody za drugim dystansem, dodać i dokręcić śruby oraz bolce.</li>
	<li>Położyć urządzenie poziomo nad naczyniem z lodem. Dolać świeże bufory anodowy i katodowy do komór buforowych i sprawdzić system pod kątem nieszczelności.</li>
	<li>Dodać 150 µl buforu anodowego do komory zbieralnej. Ponownie podłączyć przewody zasilające do odpowiednich wtyków bananowych.</li>
	<li>Włączyć zasilacz, ustawiając stały prąd 3 mA. Czoło barwnika powinno wówczas zacząć wypłukiwać się do buforu w komorze zbieralnej.</li>
	<li>Po wypłukaniu całego czoła barwnika wyłączyć zasilacz i zebrać pierwszą frakcję (0 min), przenosząc ją do probówki do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu białek.</li>
	<li>Uzupełnić komorę zbieralną 150 µl buforu anodowego. Wszystkie zebrane frakcje przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Zbierać frakcje w następujących odstępach czasu od zebrania pierwszej frakcji: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min i 60 min. Nie wliczać czasu, w którym zasilacz był wyłączony. Należy pamiętać o wyłączeniu zasilacza przed pobieraniem frakcji oraz o uzupełnieniu komory zbieralnej 150 µl buforu anodowego pomiędzy próbkami. Po pobraniu frakcji ponownie włączyć zasilacz, aby rozpocząć wypłukiwanie kolejnej frakcji.</li>
	<li>Wylać bufory anodowy i katodowy i po 60 min dodać świeże roztwory do komór buforowych. Zebrać frakcje w 90 min i 120 min.</li>
	<li>Wymieniać bufory anodowy i katodowy co godzinę.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę PAGE w warunkach natywnych (clear native) lub nienatywnych (blue native) dla zebranych frakcji i zabarwić zgodnie z preferencjami. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta lub preferowanym protokołem.</li>
	<li>Przeprowadzić redukującą elektroforezę SDS-PAGE i zabarwić zgodnie z preferencjami. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta lub preferowanym protokołem.</li>
	<li>Oczyścić frakcje GELFrEE i poddać je analizom natywną spektrometrią mas, zgodnie z wcześniejszym opisem9.</li>
</ol>
<img alt="Układ mikrofluidycznej komory lab-on-a-chip; obejmuje komory buforowe i zbiorcze oraz schemat dystansora." src="/files/ftp_upload/53597/53597fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Urządzenie CN-GELFrEE. (A) rysunki części urządzenia GELFrEE i (B) fotografia wykonanych części; (C) schemat montażu urządzenia CN-GELFrEE: (1) komora buforowa, (2) dystansor, (3) o-ring, (4) rurka żelowa, (5) komora zbiorcza oraz (6) membrana dializacyjna.
<img alt="Tabela przygotowania żelu do elektroforezy zawierająca szczegółowe informacje o roztworach buforowych, akrylamidzie i barwniku Coomassie." src="/files/ftp_upload/53597/53597table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Tabela roztworów.
<img alt="Tabela listy części do montażu sprzętu laboratoryjnego, obejmująca szklane rurki, komory teflonowe i przewody." src="/files/ftp_upload/53597/53597table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Tabela części urządzenia GELFrEE.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell+as+a+Collection+of+Protein+Machines%3A+Preparing+the+Next+Generation+of+Molecular+Biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).</li>
<li>Gavin, A. C., Bösche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+vanadium+complexes+in+serum%2C+packed+cells+and+tissues+of+Wistar+rats+by+means+of+gel+filtration+and+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22JBIC+J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography.</a> JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+Density+Gradient+Sedimentation+to+Separate+and+Analyze+Multiprotein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+GELFrEE%3A+A+New+Separation+Technique+for+Biomolecular+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies.</a> Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).</li>
<li>Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+electrophoresis+to+study+mitochondrial+and+other+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes.</a> Methods. 26 (4), 327-334 (2002).</li>
<li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-Eluted+Liquid+Fraction+Entrapment+Electrophoresis%3A+An+Electrophoretic+Method+for+Broad+Molecular+Weight+Range+Proteome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation.</a> Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CN-GELFrEE wywodzi się z klarownego natywnego (CN) systemu buforowego PAGE, który wykorzystuje mieszaninę anionowych i neutralnych detergentów jako cząsteczki nośnikowe9 do frakcjonowania białek na podstawie masy cząsteczkowej przez matrycę żelową. Zastosowanie CN-GELFrEE do natywnego ekstraktu białka serca myszy pozwoliło na uzyskanie frakcji o niskiej złożoności z dyskretnymi szerokościami pasm przy jednoczesnym zachowaniu niekowalencyjnych oddziaływań zespołów biomolekularnych. Porównanie frakcji pomiędzy C...

Większość procesów biologicznych zachodzących w komórce jest uważana za przeprowadzaną przez zespoły białek, a nie pojedyncze białka1. W związku z tym, aby wyjaśnić specyficzną rolę biologiczną podjednostki białka w komórce, konieczne jest zrozumienie jej interakcji strukturalnych z innymi białkami lub ligandami w kompleksach2. Jednak badanie białek natywnie, utrzymanie ich niekowalencyjnych interakcji i aktywności, pozostaje wyzwaniem. Jedną z wad badań nad białkami natywnymi jest odpowiednia technika separacji natywnej, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek na dalszych etapach. W związku z tym ostatnio gwałtownie wzrosło zainteresowanie technikami separacji zdolnymi do charakteryzowania niekowalencyjnych zespołów biomolekuł3.
Techniki separacji białek są niezbędne w biochemii, biofizyce i różnych innych badaniach. Obecne natywne techniki separacji mają wewnętrzne wady, które zmniejszają kompatybilność z dalszymi analizami, takie jak niska rozdzielczość, niska przepustowość, straty spowodowane wytrącaniem się i wymóg dużych ilości próbki początkowej. Tandemowe oczyszczanie powinowactwa jest powszechnie stosowane w badaniach interakcji białek, ale musi być przeprowadzane oddzielnie dla każdego docelowego białka, co powoduje, że jest niezgodne z analizą wysokoprzepustową4. Chromatografia wykluczania wielkości5, selektywne wytrącanie za pomocą chromatografii powinowactwa jonowego5 i separacja gradientu gęstości6 zapewniają natywne separacje, ale są z natury technikami o niskiej rozdzielczości i wymagają dużych początkowych ilości próbki.
Alternatywnie, techniki oparte na żelu, takie jak Blue Native (BN) i Clear Native (CN) PAGE (zarówno 1-D, jak i 2-D), wyświetlają separację w wysokiej rozdzielczości. Ponadto, w przeciwieństwie do innych wymienionych technik, obie natywne separacje PAGE zachowują rozpuszczalność i natywną konformację szerokiego zakresu gatunków makrocząsteczek, w tym białek hydrofobowych. Zdolność ta dodatkowo poszerza pokrycie proteomu osiągnięte za pomocą tych metod7,8 i jest osiągana dzięki różnym badaniom chemicznym między CN i BN-PAGE. CN-PAGE powszechnie opiera się na miękko naładowanych detergentach jako cząsteczkach nośnikowych, zastępując barwnik Coomassie Blue w BN-PAGE. BN-PAGE, choć wiąże się z wyższą rozdzielczością, ma zastrzeżenia, takie jak zmniejszona aktywność enzymatyczna w oddzielonych białkach8 i tworzenie adduktów cząsteczek Coomassie, przy czym to ostatnie jest bardzo szkodliwe dla dalszych analiz MS9. Obie te metody są jednak tradycyjnie kojarzone z niską odzyskiem i wąskim pokryciem proteomu ze względu na ograniczenia związane z barwieniem i ekstrakcją żelu7.
Do badania zdenaturowanych białek istnieje kilka technik, które utrzymują rozpuszczalność makromolekuł, przeprowadzając frakcjonowanie w wysokiej rozdzielczości z wysokim odzyskiem białka i które są kompatybilne z różnymi technikami analizy białek po separacji. Elektroforeza z uwięzieniem frakcji ciekłej eluowanej w żelu (GELFrEE) jest jedną z technik frakcjonowania, które spełniają wszystkie te cechy. Metoda ta jest szeroko stosowana w wysokoprzepustowych badaniach proteomicznych typu top-down, co wskazuje, że jest szybka i wszechstronna. W GELFrEE białka są denaturowane i rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej za pomocą rurkowej matrycy żelowej, której porowatość można zmieniać w zależności od wymagań próbki i pożądanych wyników frakcjonowania. Frakcje są eluowane w fazie ciekłej, co zmniejsza ograniczenia odzyskiwania związane z SDS-PAGE przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. Podwielokrotności frakcji mogą być następnie analizowane przez 1-D PAGE w celu wyboru szerokości pasma masy cząsteczkowej11. Istnieje duże zapotrzebowanie na korzyści związane z GELFrEE w natywnych technikach separacji. Opisana tutaj metoda, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), jest natywną adaptacją GELFrEE. Aby być kompatybilnym z szerokim spektrum makrocząsteczek w ich stanie naturalnym, metoda ta opiera się nie tylko na miękkiej chemii CN-PAGE, ale także na separacji gradientu porowatości, która zmniejsza wytrącanie się białek poprzez eliminację ostrych przejść między porowatością występującą w nieciągłych układach żelowych9. Po zastosowaniu do frakcjonowanych kompleksów białkowych ekstrahowanych z serca myszy, eluowane frakcje wykazywały wysoki odzysk i uzyskano separację w wysokiej rozdzielczości w szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Co więcej, otrzymane frakcje są zgodne z większością dalszych analiz biochemicznych i biofizycznych białek.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td>Ten roztwór jest neurotoksyczny.</td></tr><tr><td>Kwas 6-aminoheksanowy (kwas epsilonowy;-aminokapronowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td>Ta substancja chemiczna jest drażniąca.</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td>Ta substancja chemiczna jest łatwopalna, toksyczna i.</td></tr><tr><td>Coomassie blue G250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td>Ta substancja chemiczna działa drażniąco.</td></tr><tr><td>Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)</td><td>FLUKA</td><td>3777</td><td>Ta substancja chemiczna jest toksyczna.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td>Ta substancja chemiczna jest toksyczna.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td>Przechowywać ciekły azot w pojemnikach przeznaczonych do płynów o niskiej temperaturze </td></tr><tr><td>Serce myszy</td><td>Biorekultywacja LLC</td><td>MSE-HEART</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>71-36-3</td><td>Ta substancja chemiczna jest łatwopalna i toksyczna.</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP103</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78430</td><td>Ta substancja chemiczna jest toksyczna.</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Ta substancja chemiczna jest drażniąca.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>JTBaker</td><td>4097</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>Ta substancja chemiczna łatwopalna i drażniąca.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-071</td><td></td></tr><tr><td>Wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik gradientowy</td><td>Hoefer</td><td>SG15</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne&nbsp;</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Pręty magnetyczne&nbsp;</td><td>Każdy dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td>Wystarczająco mały, aby zmieścić się w komorach mieszalnika gradiet.</td></tr><tr><td>Zasilanie</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td>Napięcie do 1 500 V</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>022622552</td><td>Do 15 000 x g</td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka stożkowa</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa-MWCO ultra filtr odśrodkowy</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczny przewód</td><td>Saint-Gobain B000FOV1J0</td><td></td><td>Długość około 1 m</td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Zawór cieczowy/powietrzny, metalowy lub plastikowy. (np. zawór dźwigniowy sterowania przepływem powietrza/wody w akwarium)</td><td>Każdy dostawca&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zawory akwariowe są kompatybilne.</td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Native PAGE 3-12% T żel do płyt</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Rurka białkowa o niskim poziomie wiązania 1,5&nbsp; ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>IDL Tools</td><td>TE05-091C</td><td></td></tr><tr><td>Regenerowane rurki do dializy z celulozy 3,500 MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-9</td><td></td></tr><tr><td>Żel SDS-PAGE do dowolnych</td> pipet serologicznych kDa <td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td></td></tr><tr><td>(25&nbsp; ml)</td>Strzykawka <td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>(10 ml)</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

cn-gelfree - przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Kompleksy białkowe pełnią szereg kluczowych funkcji komórkowych. Wyjaśnienie ich niekowalencyjnych oddziaływań i dynamiki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli kompleksów w systemach biologicznych. Podczas gdy bezpośrednia charakterystyka zespołów biomolekularnych staje się coraz ważniejsza w ostatnich latach, natywne techniki frakcjonowania, które są kompatybilne z dalszymi technikami analizy, w tym spektrometrią mas, są niezbędne do dalszego rozszerzenia tych badań. Niemniej jednak w tej dziedzinie brakuje wysokoprzepustowej, szerokozakresowej i wymagającej wysokiego odzysku metody separacji natywnych zespołów białkowych. W tym miejscu przedstawiamy klarowną natywną elektroforezę uwięzienia frakcji ciekłej eluowanej żelem (CN-GELFrEE), która jest nową metodą separacji niekowalencyjnych zespołów białkowych. Skuteczność separacji CN-GELFrEE wykazano za pomocą kompleksów frakcjonujących wyekstrahowanych z serca myszy. Frakcje zbierano w ciągu 2 godzin i wyświetlano dyskretne pasma w zakresie od ~30 do 500 kDa. Zaobserwowano spójny wzorzec zwiększania szerokości pasm masy cząsteczkowej, z których każde mieściło się w zakresie ~100 kDa. Co więcej, późniejsza ponowna analiza frakcji natywnych za pomocą SDS-PAGE wykazała przesunięcia masy cząsteczkowej zgodne z denaturacją kompleksów białkowych. W związku z tym udowodniono, że CN-GELFrEE oferuje zdolność do przeprowadzania natywnych separacji o wysokiej rozdzielczości i wysokim odzysku na kompleksach białkowych z dużego zakresu masy cząsteczkowej, zapewniając frakcje, które są zgodne z dalszymi analizami białek.

200 µg białek wyekstrahowanych z kriogenicznie mielonych serc mysich poddano frakcjonowaniu w warunkach natywnych na 14 frakcji o objętości 150 µl każda, stosując metodę CN-GELFrEE w probówce z żelem T 1-12%. Alikwot 10 µl każdej frakcji naniesiono na żel płaski CN-PAGE i poddano barwieniu srebrem. Wyraźna ilustracja frakcjonowania i rozdzielczości uzyskanej za pomocą frakcjonowania CN-GELFrEE przedstawiona jest na Rycini 2A. Frakcje zbierano przez dwie godziny, a analiza...

Ten protokół opisuje, jak przygotować i przeprowadzić przezroczystą elektroforezę uwięzienia frakcji płynnej z natywną żelową (CN-GELFrEE), natywną technikę separacji niekowalencyjnych zespołów biomolekularnych i białek z heterogenicznych próbek, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek.

CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Ogólnym celem tej nowej techniki rozdziału jest frakcjonowanie natywnych próbek z wysokim odzyskiem i rozdzielczością, przy jednoczesnym zachowaniu niekowalencyjnych oddziaływań makromolekularnych, takich jak kompleksy białkowe. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad natywnymi kompleksami makromolekularnymi, np. dotyczącymi składu i stechiometrii kompleksu. Główną zaletą tej techniki jest wysoki odzysk i niskie rozcieńczenie próbki, co jest nieosiągalne dla żadnej innej metody rozdziałów natywnych.Rozpocznij od montażu systemu odlewania. Pierwszym krokiem jest odcięcie końcówki pipety serologicznej o pojemności 20 milliliterów za pomocą rozgrzanego ostrza. Cięcie należy wykonać prostopadle, 10 centymetrów od góry końcówki dozującej.Następnie przymocuj odciętą końcówkę pipety do statywu za pomocą zacisku. Potem odetnij odcinek wężyka o długości 3 cm, aby przymocować go do końcówki. Naciągnij jeden koniec wężyka na końcówkę i podłącz zawór regulacyjny przepływu.Połącz zawór z końcówką dozującą mieszalnika gradientowego za pomocą kolejnego odcinka rurki. Na razie pozostaw zawór otwarty. Następnie umieść mieszalnik gradientowy na mieszadle magn

cn-gelfree-clear-native-gel-eluted-liquid-fraction-entrapment

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Nasz protokół demonstruje, jak przygotować wiele żeli białkowych jednocześnie poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda zawiera sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli pochodzących z dostępnych komercyjnie zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco...

Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Dwuwymiarowy materiał modelowy z dyskotycznego fosforanu cyrkonu został opracowany. Nieorganiczny kryształ o strukturze blaszkowej zsyntetyzowano metodami hydrotermalnymi, refluksowymi i mikrofalowymi. Podczas eksfoliacji cząsteczkami organicznymi warstwowe kryształy mogą zostać przekształcone w monowarstwy, a nematyczna faza ciekłokrystaliczna została utworzona przy wystarczającym stężeniu monowarstw.

Synteza i złuszczanie dyskotycznych fosforanów cyrkonu w celu otrzymania koloidalnych ciekłych kryształów

Poznaj metodę CN-GELFrEE do separacji natywnych kompleksów białkowych z zachowaniem interakcji nikowalencyjnych. Technika zapewnia wysoką wydajność i rozdzielczość przy niskim rozcieńczeniu próbki.

CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

Przeglądaj więcej filmów