Name: Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemicznego wykrywania białka c-FOS do oceny aktywności neuronowej w tkankach mózgu. Technika ta umożliwia mapowanie mózgu i identyfikację regionów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uniwersytet Paris 13 wsparł tę pracę. ASPT było wspierane przez stypendium Uniwersytetu Paris 13 oraz "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ był wspierany przez stypendium Laboratory of Excellence GR-Ex. GR-Ex (nr ref. ANR-11-LABX-0051) jest finansowany przez program "Investissement d'avenir" francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (nr ref. ANR-11-IDEX-0005-02).

Uwaga: wykrywanie c-FOS to standardowa procedura składająca się z kilku etapów (Rysunek 1). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na szczurach lub myszach. Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki w Eksperymencie na Zwierzętach Charlesa Darwina (Ce5/2011/05), przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 22 września 2010 r. (2010/63/UE) w sprawie opieki nad zwierzętami i przeprowadzone zgodnie z francuskimi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 0,2 M bufor fosforanu sodu: mieszając dodać 6,24 g NaH2PO4*2H2O i 22,56 g Na2HPO4*H2O. do 1 l wody destylowanej.</li>
	<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA): dodaj 20 g PFA do 150 ml wody destylowanej. Podgrzać roztwór do temperatury 80 °C, mieszając. Aby oczyścić roztwór, zmniejsz ogień i dodaj 1 lub 2 krople 1 N NaOH, aby pomóc w rozpuszczeniu paraformaldehydu. Uzupełnić do 250 ml wodą destylowaną i dodać 250 ml 0,2 M buforu fosforanowego (pH 7,4). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Zachowaj odpowiednią ostrożność podczas korzystania z tych odczynników. Uchwyt w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym i okularach ochronnych pod kapturem chemicznym. 
	Uwaga: Przygotuj 4% PFA w dniu poprzedzającym perfuzję. Określ objętość 4% PFA w funkcji wieku, liczby i gatunku zwierząt.</li>
	<li>Przygotować roztwór krioprotekcyjny: W 250 ml 0,2 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem wymieszać 5 g poliwinylopirolidonu, 150 g sacharozy i 2,5 g chlorku sodu. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 150 ml glikolu etylenowego i dostosować do 500 ml wodą destylowaną. Przechowywać roztwór krioprotekcyjny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): dodać 18 g NaCl do 1 l wody destylowanej, mieszając. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 1 l 0,2 M buforu fosforanu sodu.</li>
	<li>Przygotuj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami uzupełnioną 0,3% Triton X100 (PBST): Dodać 3 ml Triton X100 do 997 ml PBS.</li>
	<li>Przygotować 0,05 M Tris-Buffer (pH 7,6): dodać 3,03 g Tris-Chlorowodorku i 0,70 g Tris-Base do 500 ml wody destylowanej, mieszając.</li>
	<li>Przygotuj 2% surowicę kozią w PBST: na jedną płytkę przygotuj 30 ml roztworu. Dodaj 600 μl koziej surowicy do 30 ml PBST i dobrze wymieszaj. Dodać 2,5 ml na dołek. 
	Uwaga: Użyta surowica musi pochodzić od gatunków wykorzystywanych do wytwarzania przeciwciał wtórnych</li>
	<li>Przygotować królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko białku c-FOS (1:4000, sc-52) w PBST z albuminą surowicy bydlęcej (0,25%). Na jedną płytkę przygotuj 30 ml roztworu. Dodać 75 mg albuminy surowicy bydlęcej do 30 ml PBST i dobrze wymieszać. Następnie dodać 7,5 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko białku c-FOS.</li>
	<li>Przygotować biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze (1:500) w PBST z albuminą bydlęcą surowicy (0,25%). Na jedną płytkę przygotuj 30 ml roztworu. Dodać 75 mg albuminy surowicy bydlęcej do 30 ml PBST i dobrze wymieszać. Następnie dodaj 60 μl biotynylowanego koziego przeciwciała anty-króliczego.</li>
	<li>Przygotować kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (1:250) w PBST (roztwór ABC). Na jedną płytkę przygotuj 30 ml roztworu. Dodać 120 μl odczynnika A i 120 μl odczynnika B do 30 ml PBST i dobrze wymieszać. 
	Uwaga: Roztwór ABC należy przygotować co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować roztwór substratu. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór w następujący sposób (na jedną płytkę): dodać 20 mg siarczanu niklu i 10 mg czterochlorowodorku 3,3-diaminobenzydyny do 50 ml Tris-Buffer. Filtruj i chroń przed światłem. Dodać 2,0 ml na studzienkę. Do pozostałego roztworu (25 ml) dodać 17 μlH2O2(H2O2roztwór 30% wH2O). Dodać 2,0 ml na studzienkę. 
	Uwaga: Należy zachować odpowiednią ostrożność podczas korzystania z tych odczynników. Uchwyt w rękawiczkach i fartuchach laboratoryjnych.</li>
</ol>
2. Indukcja c-fos i przetwarzanie tkanek in vivo
Uwaga: Eksperymenty przeprowadzono na szczurach (Sprague Dawley) lub myszach (C57BL/6).
<ol>
	<li>Umieścić zwierzęta w hermetycznym pudełku wentylowanym mieszaniną gazów hipoksycznych (Ø2 8% zrównoważonych N2) lub hiperkapnów (CO2 4%, O2 21% zrównoważonych N2) na 2 godziny (rysunek 2A).</li>
	<li>Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu (100 mg/kg). Zwierzę należy wykonać transsercyjnie z 4% PFA20. Obchodź się ostrożnie i używaj rękawic pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Po perfuzji należy przeprowadzić sekcję mózgu20 i zanurzyć go w 7 ml 4% PFA w probówce o pojemności 15 ml na 48 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie usunąć mózg z PFA i zanurzyć go całkowicie w roztworze krioprotrotanckim. Przechowywać w temperaturze -18 °C (Rysunek 3). Resztę ciała zwierzęcia należy zutylizować w odpowiedni sposób w celu przetworzenia odpadów. 
	Uwaga: Krioprotekcja to krok pomiędzy utrwalaniem PFA a zamrażaniem. Ogranicza tworzenie się kryształków lodu w komórkach z roztworem, którego zamrożenie będzie w postaci amorficznej. Utrwalone próbki muszą być impregnowane roztworem krioprotekcyjnym (przygotowanym w kroku 1.3) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Obchodzić się z nimi ostrożnie i w rękawicach pod kapturem chemicznym.</li>
</ol>
3. Indukcja c-fos i przetwarzanie tkanek ex vivo
Uwaga: Eksperymenty przeprowadzono tylko na nowonarodzonych szczurach lub myszach.
<ol>
	<li>Wyizoluj OUN zgodnie z opisem Suzue19. Umieścić go w komorze rejestracyjnej i w sposób ciągły przelać sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym z szybkością 7,5 ml/min w temperaturze 26 °C 21 (aCSF: w mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glukozy; nasyconyO2 i dostosowany do pH 7,4 przez gazowanie 95%O2 i 5% CO2) (Rysunek 2B).</li>
	<li>Zastąp aCSF odtlenionym aCSF (ten sam skład z pęcherzykami 95% N2 i 5 % CO2 , pH 7,4) w przypadku hipoksji lub zakwaszonym aCSF (standardowy aCSF z NaHCO3 zredukowanym do 10,0 mM, pęcherzykowym z 95% O2 i 5% CO2 ) w przypadku hiperkapnii. Stosuj stymulację przez 30 minut (Rysunek 2B).</li>
	<li>Ex vivo, po okresie indukcji, przenieść OUN nowonarodzonych myszy lub szczurów w 2,5 ml 4% PFA w probówce o pojemności 2,5 ml przez 48 godzin i przechowywać w temperaturze -18 °C w roztworze krioprotekcyjnym do późniejszego użycia (ryc. 3). 
	Uwaga: Ex vivo nie jest konieczne perfuzja zwierząt. Poprzednie badania sugerują, że małe próbki o średnicy mniejszej niż 10 mm można utrwalić za pomocą prostej dyfuzji22. Podana szybkość penetracji (odległość w mm dla dyfuzji utrwalającej do tkanki) dla aldehydu wynosi 2 lub 3 mm/h.</li>
</ol>
4. Sekcja pnia mózgu
Uwaga: Od tego kroku do końca, protokół jest dokładnie taki sam dla indukcji in vivo i ex vivo.
<ol>
	<li>Przed pokrojeniem należy umieścić jedną pojedynczą wkładkę studzienkową w 12-dołkowej płytce i dodać 2,5 ml PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Wykonaj seryjne wycinki koronalne (40 μm) pnia mózgu za pomocą kriostatu i zbierz je na płytce 12-dołkowej. Na cały dorosły pień mózgu wykonaj około 70 plasterków (ryc. 3). 
	Uwaga: Możliwe jest cięcie tkanek pochodzących od kilku zwierząt równolegle na jednej płytce.</li>
</ol>
5. Procedury immunohistologiczne (Tabela 1)
Uwaga: Przez cały czas trwania procedury sekcje pozostają we wkładkach studzienek.
<ol>
	<li>Dzień 1 - Zniszczenie aktywności endogennej peroksydazy, niespecyficzna blokada miejsca wiązania i inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (ryc. 4)
	<ol>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Stłumić endogenną aktywność peroksydazy przez inkubację odcinków koronalnych przez 30 minut w temperaturze pokojowej z nadtlenkiem wodoru H2O2,3% w 0,1 M PBS (2,5 ml na studzienkę).</li>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Zablokuj niespecyficzne miejsce wiązania, inkubując odcinki koronalne przez 1 godzinę w RT z kozią surowicą (2%) w PBST.</li>
		<li>Inkubować skrawki koronalne przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko białku c-FOS (1:4000, sc-52,) w PBST z albuminą surowicy bydlęcej (0,25%) (2,5 ml na basenik).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3 - Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym i rozwój reakcji barwnej (ryc. 4)
	<ol>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut PBS 0,1 M w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Inkubować skrawki koronalne przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z biotynylowanym kozim przeciwciałem anty-króliczym (1:500) w PBST z albuminą surowicy bydlęcej (0,25%) (2,5 ml na studzienkę). 
		Uwaga: Na tym etapie badacz może również użyć przeciwciała wtórnego sprzężonego z sondą fluorescencyjną. W takim przypadku należy na tym etapie przerwać protokół i zbadać bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut PBST w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Inkubować skrawki koronalne przez 1 godzinę z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (1:250) w PBST (2,5 ml na studzienkę).</li>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut PBST w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 2 razy.</li>
		<li>Myć skrawki przez 10 minut 0,05 M Tris-Buffer w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 2 razy.</li>
		<li>Inkubować skrawki koronalne z 0,02% czterochlorowodorkiem 3,3-diaminobenzydyny, 0,04% siarczanem niklu amonu i 0,01% nadtlenkiem wodoru w 0,05 M buforze trisowym (pH 7,6) w temperaturze pokojowej (2,0 ml na studzienkę). Do pozostałego roztworu (25 ml) dodać 17 μl H2O2 (roztwór H2O2 2 30% w H2O) (2,0 ml na basenik). 
		Uwaga: Badacz powinien określić czas wywoływania pod mikroskopem świetlnym. Jednak 5 do 10 minut zapewnia dobrą intensywność barwienia.</li>
		<li>Gdy intensywność barwienia jest optymalna (kontrolowana pod mikroskopem świetlnym, patrz Rysunek 5 i Rysunek 6), należy zatrzymać reakcję, myjąc skrawki przez 10 minut 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej (2,5 ml na studzienkę). Powtórz 4 razy. Następnie umyj sekcje wodą destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż pobierania próbek (ostrożny uchwyt i rękawice pod osłoną chemiczną)
	<ol>
		<li>Sekcje montować szeregowo na prowadnicach i suszyć na powietrzu. W tym celu ostrożnie rozprowadź sekcje w kolejności rostro-doogonowej za pomocą szczotek na szkiełkach. Wyraźnie oznacz szkiełka zgodnie z próbkami.</li>
		<li>Odwodnić alkoholem bezwodnym: zanurzyć szkiełka na 30 sekund w temperaturze pokojowej w absolutnej kąpieli alkoholowej. Powtórz dwa razy.</li>
		<li>Wyczyść ksylenem: zanurz szkiełka w kąpieli ksylenowej na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz dwukrotnie.</li>
		<li>Nakryj szkiełka za pomocą medium montażowego. W tym celu nałóż 5 kropli podłoża montażowego na szkiełko, a następnie nałóż szkło nakrywkowe, wybijając pęcherzyki powietrza. Suszyć na powietrzu przez 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Dane i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Zbadaj skrawki pod mikroskopem świetlnym. Wizualnie policz neurony FLI przy dużym powiększeniu (200x) przy użyciu standardowych punktów orientacyjnych23,24. Barwienie punktowe c-Fos jest zlokalizowane w jądrach neuronów.</li>
	<li>Dla każdego analizowanego obszaru policz liczbę komórek c-FOS-dodatnich na sekcję i porównaj średnią liczbę między warunkami kontrolnymi i stymulowanymi. W zależności od normalności danych użyj niesparowanego testu t studenta lub testu Manna-Whitneya. Różnice uznano za istotne, jeśli P<0,05. Narysuj rozkład neuronów FLI na rysunku (powiększenie 100x) za pomocą rurki do rysowania dołączonej do mikroskopu i sfotografowanej aparatem cyfrowym (ryc. 5).</li>
</ol>

<ol><li>Curran, T., Teich, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+39%2C000-dalton+protein+in+cells+transformed+by+the+FBJ+murine+osteosarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus.</a> Virology. 116, 221-235 (1982).</li>
<li>Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+FBJ+murine+osteosarcoma+virus+genome%3A+molecular+cloning+of+its+associated+helper+virus+and+the+cellular+homolog+of+the+v-fos+gene+from+mouse+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells.</a> Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).</li>
<li>Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+cellular+fos+proteins%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis.</a> Cell. 36, 259-268 (1984).</li>
<li>Herdegen, T., Leah, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+constitutive+transcription+factors+in+the+mammalian+nervous+system%3A+control+of+gene+expression+by+Jun%2C+Fos+and+Krox%2C+and+CREB%2FATF+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins.</a> Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).</li>
<li>Dragunow, M., Faull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+c-fos+as+a+metabolic+marker+in+neuronal+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing.</a> J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).</li>
<li>Bullitt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos-like+protein+as+a+marker+for+neuronal+activity+following+noxious+stimulation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.</a> J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).</li>
<li>Greenberg, M. E., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+3T3+cells+induces+transcription+of+the+c-fos+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene.</a> Nature. 311, 433-438 (1984).</li>
<li>Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+epidermal+growth+factor+induce+rapid+transient+changes+in+proto-oncogene+transcription+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells.</a> J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).</li>
<li>Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+c-fos+gene+and+protein+by+growth+factors+precedes+activation+of+c-myc%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc.</a> Nature. 312, 716-720 (1984).</li>
<li>Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercapnia+induces+c-fos+expression+in+neurons+of+retrotrapezoid+nucleus+in+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats.</a> Brain Res. 635, 353-356 (1994).</li>
<li>Teppema, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos+in+the+rat+brainstem+after+exposure+to+hypoxia+and+to+normoxic+and+hyperoxic+hypercapnia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia.</a> J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).</li>
<li>Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos-like+immunoreactivity+in+the+cat%27s+neuraxis+following+moderate+hypoxia+or+hypercapnia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia.</a> J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).</li>
<li>Bodineau, L., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+and+hypothalamic+areas+activated+by+tissue+hypoxia%3A+Fos-like+immunoreactivity+induced+by+carbon+monoxide+inhalation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat.</a> Neuroscience. 108, 643-653 (2001).</li>
<li>Erickson, J. T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+electrical+stimulation+of+the+carotid+sinus+nerve+induce+Fos-like+immunoreactivity+within+catecholaminergic+and+serotoninergic+neurons+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem.</a> J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).</li>
<li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+in+utero+caffeine+exposure+on+respiratory+output+in+normoxic+and+hypoxic+conditions+and+related+changes+of+Fos+expression%3A+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-sensing+properties+of+the+newborn+rat+ventral+medullary+surface+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro.</a> J Physiol. 577, 55-68 (2006).</li>
<li>Voituron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kreisler+mutation+leads+to+the+loss+of+intrinsically+hypoxia-activated+spots+in+the+region+of+the+retrotrapezoid+nucleus%2Fparafacial+respiratory+group%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group.</a> Neuroscience. 194, 95-111 (2011).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. , e3564(2012).</li>
<li>Rousseau, J. P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+on+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations+from+newborn+rodents+allows+neural+respiratory+network+output+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording.</a> J Vis Exp. , e53071(2015).</li>
<li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 4th ed, Academic Press. CA. (1998).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd ed, Academic Press. CA. (2001).</li>
<li>Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+and+hypothalamic+areas+involved+in+respiratory+chemoreflexes%3A+a+Fos+study+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats.</a> Brain Res. 857, 30-40 (2000).</li>
<li>Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+Fos-like+immunoreactivity+evoked+by+hypoxia+in+the+rat+brainstem+and+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus.</a> Brain Res. 877, 149-159 (2000).</li>
<li>Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos+study+of+ponto-medullary+areas+involved+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).</li>
<li>Takakura, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptor+inputs+to+retrotrapezoid+nucleus+%28RTN%29+CO2-sensitive+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats.</a> J Physiol. 572, 503-523 (2006).</li>
<li>Mulkey, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+control+by+ventral+surface+chemoreceptor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats.</a> Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).</li>
<li>Finley, J. C., Katz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+organization+of+carotid+body+afferent+projections+to+the+brainstem+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat.</a> Brain Res. 572, 108-116 (1992).</li>
<li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+a+new+physiological+role+for+brain+apelin+in+the+regulation+of+hypothalamic+oxytocin+neurons+in+lactating+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats.</a> Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).</li>
<li>Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+arrangement+of+hypercapnia-activated+cells+in+the+superficial+ventral+medulla+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).</li>
<li>Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+adenosinergic+A1+systems+in+the+occurrence+of+respiratory+perturbations+encountered+in+newborns+following+an+in+utero+caffeine+exposure.+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Neuroscience. 127, 505-518 (2004).</li>
<li>Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+patterns+of+c-fos+expression+in+the+central+nervous+system+after+seizure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure.</a> Science. 237, 192-197 (1987).</li>
<li>Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos+protein+in+brain%3A+metabolic+mapping+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level.</a> Science. 240, 1328-1331 (1988).</li>
<li>Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+temporal+and+spatial+distribution+of+JUN%2C+FOS%2C+and+KROX-24+proteins+in+spinal+neurons+following+noxious+transsynaptic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation.</a> J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).</li>
<li>Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling-induced+activation+of+neural+c-fos+expression+at+lower+thoracic+rat+spinal+cord+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments.</a> Brain Res. 954, 100-114 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

C-fos jest natychmiastowym wczesnym genem, a wykrycie jego produktu, białka c-FOS, jest klasycznie wykorzystywane do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje oddechowe in vivo11,13,25,28 i ex vivo16-18,27,32,33.
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Zachowaj ostrożność na etapie perfuzji. 4% roztwór PFA musi być dobrze przygotowany, a etapy utrwalania i po utrw...

Gen c-fos został zidentyfikowany po raz pierwszy na początku 1980 roku1,2, a jego produkt został scharakteryzowany w 1984 roku jako białko jądrowe o właściwościach aktywatora genów3,4. Bierze udział w długotrwałych mechanizmach związanych ze stymulacją neuronów. Rzeczywiście, zmiany w aktywności neuronalnej prowadzą do kaskad sygnalizacyjnych drugiego przekaźnika, które indukują ekspresję natychmiastowego wczesnego genu c-fos, który indukuje produkcję czynnika transkrypcyjnego c-FOS. Ten ostatni inicjuje ekspresję późnych genów, a tym samym uczestniczy w reakcjach adaptacyjnych układu nerwowego na wiele różnych rodzajów bodźców4. Tak więc od końca 1980 roku5,6 wykrywanie białka c-FOS jest często wykorzystywane do badania wpływu czynników egzogennych na transkrypcję genów wogóle4 oraz na aktywność ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w celu mapowania szlaków neuronalnych zaangażowanych w różne stany fizjologiczne.
Podstawowa ekspresja c-fos była badana u różnych gatunków, w tym u myszy, szczurów, kotów, małp i ludzi4. W związku z tym kinetyka jego ekspresji jest stosunkowo dobrze znana. Aktywacja transkrypcji jest szybka (od 5 do 20 minut)7,8, a akumulacja mRNA osiąga maksimum między 30 a 45 minutami po rozpoczęciu stymulacji9 i zmniejsza się z krótkim okresem półtrwania wynoszącym 12 minut. Synteza białka c-FOS następuje po akumulacji mRNA i może być wykryta za pomocą immunohistochemii w 20 do 90 minut po stymulacji6.
Analiza ekspresji c-fos jest klasycznie stosowana w badaniach in vivo do identyfikacji centralnej sieci oddechowej zaangażowanej w reakcje oddechowe na niedotlenienie lub hiperkapnię10-14. Niedawno narzędzie to zostało również wykorzystane w preparatach ex vivo pnia mózgu w celu zbadania adaptacji centralnej sieci oddechowej do hipoksji lub hiperkapnii15-18. Rzeczywiście, preparaty te generują rytmiczną aktywność klasycznie przyswojoną do ośrodkowego napędu oddechowego19. Tak więc ten rodzaj preparatu ma tę zaletę, że jest całkowicie pozbawiony kofeiny, a zatem wyniki dotyczące ekspresji c-fos odzwierciedlają jedynie konsekwencje centralnej stymulacji bez jakiejkolwiek interwencji struktur obwodowych.
Wykrywanie c-FOS może być dokonane za pomocą metod immunohistochemicznych lub immunohistofluorescencyjnych. Immunodetekcja pośrednia wymaga zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko c-FOS i przeciwciała drugorzędowego skierowanego przeciwko gatunkowi, u którego wyprodukowano przeciwciało pierwszorzędowe. W przypadku metody immunohistochemicznej przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z enzymem (na przykład peroksydazą), który działa na substrat (H2O2dla peroksydazy). Produkt reakcji enzymatycznej jest wytwarzany przez chromogen (tetrachlorowodorek 3,3-diaminobenzydyny), który barwi go i można go obserwować pod mikroskopem świetlnym. Reakcję można wzmocnić za pomocą siarczanu niklu i amonu. Metody te pozwalają na wykrycie aktywnych neuronów podczas różnych wyzwań fizjologicznych, a tym samym na identyfikację i/lub mapowanie szlaków obwodowych i centralnych zaangażowanych w następujące po sobie reakcje fizjologiczne.

<table><tbody><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych 12-dołkowa</td><td>Costa</td><td>35/3</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Wkładki Netwell z siatkową membraną poliestrową</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>Wkładki studzienne o średnicy 15 mm mają 74&mikro; m spody z siatki poliestrowej przymocowane do wkładek polistyrenowych</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne (królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko białku c-Fos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-52</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC KIT&nbsp;</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>PK-6101</td><td></td></tr> <tr><td>(przeciwciało wtórne królika IgG)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaH2PO4*2H2O</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 0,1N</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylo-pirolidon</td><td>Sigma</td><td>PVP-360</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma</td><td>33068</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trisma HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trisma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Czterochlorowodorek 3,3-diaminobenzydyny&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>DAB50</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan niklowo-amonowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>12519</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>33817</td><td></td></tr><tr><td>Entellan Neo</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp;</td><td>Thermo-scientific</td><td>1014356190</td><td>Superfrost ultraplus</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Thermo-scientific</td><td>Q10143263NR1</td><td>24 x 60mm</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie immunohistologiczne białka c-fos: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Wiele badań ma na celu zidentyfikowanie i zmapowanie regionów mózgu zaangażowanych w określone regulacje fizjologiczne. Protoonkogen c-fos, gen występujący we wczesnym stadium, ulega ekspresji w neuronach w odpowiedzi na różne bodźce. Produkt białkowy można łatwo wykryć za pomocą technik immunohistochemicznych prowadzących do zastosowania detekcji c-FOS do mapowania grup neuronów, które wykazują zmiany w swojej aktywności. W tym artykule skupiliśmy się na identyfikacji populacji neuronów pnia mózgu zaangażowanych w adaptację wentylacji do niedotlenienia lub hiperkapnii. Opisano dwa podejścia do identyfikacji zaangażowanych populacji neuronów in vivo u zwierząt i ex vivo w preparatach z pnia mózgu pozbawionych kofeiny. In vivo zwierzęta były narażone na działanie mieszanin gazów hiperkapnicznych lub hipoksyjnych. Ex vivo, preparaty pozbawione kofeiny były superpołączone ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym niedotlenionym lub hiperkapnicznym. W obu przypadkach utrzymano kontrolę u zwierząt in vivo lub preparaty ex vivo w warunkach normoksycznych i normokapnicznych. Porównanie tych dwóch podejść pozwala na określenie pochodzenia aktywacji neuronalnej, tj. obwodowej i/lub centralnej. In vivo i ex vivo pnie mózgu zebrano, utrwalono i pocięto na sekcje. Po przygotowaniu skrawków wykonano immunohistochemiczną detekcję białka c-FOS w celu identyfikacji grup komórek pnia mózgu aktywowanych przez stymulacje hipoksyczne lub hiperkapniczne. Wyznakowane komórki policzono w strukturach oddechowych pnia mózgu. W porównaniu z sytuacją kontrolną, niedotlenienie lub hiperkapnia zwiększyły liczbę komórek znakowanych c-FOS w kilku określonych miejscach pnia mózgu, które są zatem konstytutywne dla szlaków neuronalnych zaangażowanych w adaptację ośrodkowego napędu oddechowego.

Wykrywanie c-FOS jest użytecznym narzędziem, które pozwala na identyfikację grup aktywowanych komórek w określonych warunkach, takich jak hipoksja i hiperkapnia in vivo (Rycina 2A) lub w sytuacjach naśladujących te warunki ex vivo (Rycina 2B). In vivo noworodki, młode lub dorosłe gryzonie umieszczano w szczelnym pojemniku, w którym środowisko gazowe było stale odnawiane mieszaniną gazów o precyzyjnie zdefiniowanym składzie przez...

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Ogólnym celem tej detekcji immunohistochemicznej przeciwko białku c-FOS jest ocena aktywności neuronalnej w tkankach mózgowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurofizjologii, takie jak mapowanie mózgu oraz identyfikacja obszarów mózgu zaangażowanych w konkretne regulacje fizjologiczne. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że gen c-FOS wykazuje niską ekspresję w warunkach braku stymulacji, co umożliwia łatwiejszą kwantyfikację aktywności neuronalnej w badanej symulacji.Aby rozpocząć tę procedurę, należy płukać koronalne przekroje pnia mózgu przez 10 minut w 0,1 molarnym PBS w temperaturze pokojowej. Czynność tę należy powtórzyć trzykrotnie. Następnie należy zahamować endogenną aktywność peroksydazy, inkubując przekroje w 3% nadtlenku wodoru w 0,1 molarnym PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie płukać przekroje przez 10 minut 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej, powtarzając tę czynność trzykrotnie. Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując przekroje koronowe w 2% surowicy koziej w PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować przekroje z szybkim poliklonalnym przeciwciałem przeciwko białku c-FOS w PBST z 0,25% albuminą surowicy bydlęcej przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na tym etapie należy przemyć skrawki 0,1 M PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć tę procedurę trzykrotnie. Następnie inkubować skrawki koronalne przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z biotynilowanym przeciwciałem kozim anty-króliczym w PBST z dodatkiem 0,25% albuminy surowicy bydlęcej. Po godzinie przemyć skrawki przez 10 minut PBST w temperaturze pokojowej i powtórzyć czynność trzykrotnie.Następnie inkubuj przekroje wieńcowe przez jedną godzinę z kompleksem awidyny, biotyny i peroksydazy w PBST. Po tym czasie przemyj przekroje PBST w temperaturze pokojowej przez 10 minut i powtórz tę czynność jeszcze dwa razy. Następnie przemyj przekroje przez 10 minut 0,5 M buforem Tris w temperaturze pokojowej i powtórz przemywanie jeszcze dwa razy.Następnie inkubuj przekroje wieńcowate z DAB, siarczanem niklowo-amonowym i nadtlenkiem wodoru w 0,5 M buforze Tris w temperaturze pokojowej. Dodaj 17 µL nadtlenku wodoru do pozostałego buforu Tris. Gdy intensywność barwienia będzie optymalna, przerwij reakcję, przemywając przekroje 0,1 M PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie powtórz przemywanie cztery razy.Następnie przemyj skrawki wodą destylowaną. Teraz zamocuj skrawki seryjnie na szkiełkach, ostrożnie rozkładając je pędzlem w kolejności rostrokaudalnej. Po tym czasie pozostaw skrawki do wyschnięcia na powietrzu i wyraźnie opisz szkiełka zgodnie z próbkami.Następnie odwodnij skrawki, zanurzając preparaty w kąpieli z alkoholu absolutnego na 30 sekund w temperaturze pokojowej i powtórz tę procedurę dwukrotnie. Następnie zanurz preparaty w kąpieli z ksylenem na trzy minuty w temperaturze pokojowej i powtórz dwukrotnie. W dalszej kolejności nanieś pięć kropli medium montażowego na każdy preparat.Przykryć je szkiełkami i unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Pozostawić preparaty do wyschnięcia na powietrzu przez 48 godzin. Przedstawiono tutaj rysunek przekroju rdzenia przedłużonego.Obszar zaznaczony kropkowaniem przedstawia części komisuralną i medianową jądra pasma samotnego. Prostokąt wskazuje obszar, z którego wykonano mikrofotografie. Są to mikrofotografie c/mNTS w warunkach normoksji lub hipoksji.Czarne strzałki wskazują komórki c-FOS-dodatnie. Przedstawiono histogram obrazujący średnią liczbę komórek c-FOS-dodatnich na przekrój w c/mNTS w warunkach normoksji oraz hipoksji. Liczba komórek c-FOS-dodatnich była znacząco wyższa w warunkach hipoksji niż w warunkach normoksji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania immunohistochemicznej detekcji białka c-FOS jako markera szlaków centralnych zaangażowanych w konkretną stymulację fizjologiczną.

the-c-fos-protein-immunohistological-detection-useful-tool-as-marker

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Celem tego badania jest zidentyfikowanie rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą poprzez nakreślenie niezawodnej techniki immunohistologicznej wykorzystującej komórkową aktywację c-fos do pomiaru jednoczesnych zmian w szlakach dopaminy i miejscach końcowych po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów.

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Poznaj metodę immunohistochemicznego wykrywania białka c-FOS do oceny aktywności neuronowej w tkankach mózgu. Technika ta umożliwia mapowanie mózgu i identyfikację regionów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Przeglądaj więcej filmów