Name: Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę oceny teratogennego potencjału azotynów na embrionach Danio rerio w toksykologii rozwojowej. Technika ta pozwala obserwować defekty rozwojowe pod mikroskopem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VK został ufundowany z grantów z Wydziału Biologii IUP oraz Szkoły Studiów Podyplomowych i Badań (Graduate Student Professional Development). CQD i TWS były wspierane przez IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). Dziękujemy również członkom laboratorium Diep za utrzymanie obiektu dla danio pręgowanego.

Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Indiana w Pensylwanii.
1. Zbieranie zarodków
<ol>
	<li>Utrzymuj danio pręgowanego w temperaturze 28,5 °C, pH 7, przewodności między 500-1 500 μS i cyklu światło/ciemność trwającego 14 godzin światła i 10 godzin ciemności24. Używaj odmian typu dzikiego, takich jak hybryda Tü, AB lub Tü/AB. Różne szczepy mogą różnie reagować na obróbkę chemiczną25.</li>
	<li>Przygotuj ryby do krycia na noc przed zebraniem jaj, dodając wodę z systemu rybnego do zbiornika godowego. Dodaj samca i samicę ryby do zbiornika i oddziel dwie ryby przegrodą. Każda para ryb wyprodukuje od 50 do 300 jaj. Aby zapewnić wyprodukowanie wystarczającej ilości jaj, ustaw 30 par ryb. Zazwyczaj około 50% par ryb w najlepszym wieku godowym (6-9 miesięcy) produkuje jaja, co daje do 200 jaj na parę i maksymalnie do 3,000 jaj w tym eksperymencie.</li>
	<li>Następnego ranka po włączeniu światła wyjmij przegrodę, aby rozpocząć krycie. Sprawdzaj zbiorniki kryjące pod kątem jaj co 15 minut.</li>
	<li>Gdy ryby złożą jaja, zbierz wszystkie zarodki za pomocą sitka do herbaty i połącz je w jednym dużym pojemniku z buforem E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4). W temperaturze 1,5 hpf usuń i wyrzuć niezapłodnione jaja za pomocą plastikowej pipety transferowej pod mikroskopem preparacyjnym. Niezapłodnione jaja są nieprzezroczyste, podczas gdy zapłodnione jaja są przezroczyste34.</li>
	<li>Przenieść 50 zarodków na szklaną szalkę Petriego o wymiarach 100 x 15 mm zawierającą 50 ml buforu E3 dla każdego warunku leczenia. W sumie potrzebne są 33 szalki do 11 warunków leczenia i 3 powtórzeń.</li>
</ol>
2. Leczenie zarodków
<ol>
	<li>Zabiegi należy wykonywać po 2 godzinach od zapłodnienia (hpf)35. Inkubować zarodki/larwy w temperaturze 28,5 °C i badać larwy w temperaturze 120 hpf. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia każdego warunku leczenia w celu analizy statystycznej.</li>
	<li>Dla 3 szalek Petriego (każda zawierająca 50 zarodków) w temperaturze 2 hpf, usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 50 ml 300 mM etanolu rozcieńczonego w buforze E3. Przykryj szalki Petriego Parafilmem, aby zminimalizować parowanie etanolu.
	<ol>
		<li>Kontynuuj wystawianie zarodków na działanie etanolu przez 22 godziny. Następnie usunąć etanol za pomocą pipety transferowej. Dodać 50 ml buforu E3 i kilkakrotnie zamieszać naczynie, aby wypłukać etanol. Usuń ten bufor E3 za pomocą pipety transferowej i powtórz etap mycia jeszcze 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla 3 szalek Petriego (każda zawierająca 50 zarodków) w temperaturze 2 hpf, usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 50 ml nowego buforu E3.</li>
	<li>Dla 9 szalek Petriego (każda zawierająca 50 zarodków) w temperaturze 2 hpf usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 50 ml azotynu sodu o stężeniu 1 000 mg/l rozpuszczonego w buforze E3. Potwierdzić wcześniej stężenie podstawowego roztworu azotynów, stosując modyfikację metody spektrofotometrycznej diazotyzacji (metoda USEPA 354.1)28.
	<ol>
		<li>Kontynuuj naświetlanie 3 szalek przez 46 godzin, 3 szalek przez 70 godzin i 3 szalek przez 94 godziny. Codziennie zastępuj roztwór azotynów świeżo przygotowanym roztworem azotynów.</li>
		<li>Po każdym czasie ekspozycji usuń azotyny za pomocą pipety transferowej. Dodać 50 ml buforu E3 i kilkakrotnie zamieszać naczynie, aby wypłukać azotyny. Usuń ten bufor E3 za pomocą pipety transferowej i powtórz etap mycia jeszcze 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla 3 szalek Petriego (każda zawierająca 50 zarodków) w temperaturze 2 hpf usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 50 ml 200 mg/l azotynu sodu. Powtórzyć tę czynność z 400, 600, 800 i 1000 mg/l azotynu sodu.
	<ol>
		<li>Kontynuuj wystawianie zarodków na działanie azotynów przez 70 godzin. Codziennie zastępuj roztwór azotynów świeżo przygotowanym roztworem azotynów.</li>
		<li>Po upływie czasu ekspozycji usunąć azotyny za pomocą pipety transferowej. Dodać 50 ml buforu E3 i kilkakrotnie zamieszać naczynie, aby wypłukać azotyny. Usuń ten bufor E3 za pomocą pipety transferowej i powtórz etap mycia jeszcze 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla 3 szalek Petriego (każda zawierająca 50 zarodków) w temperaturze 2 hpf, usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 50 ml azotanu sodu o stężeniu 1 000 mg/l rozpuszczonego w buforze E3. Potwierdzić wcześniej stężenie podstawowego roztworu azotanu, stosując modyfikację metody spektrofotometrycznej28 dotyczącej redukcji kadmu (metoda USEPA 353.3).
	<ol>
		<li>Kontynuuj wystawianie zarodków na działanie azotanów przez 70 godzin. Roztwór azotanu należy codziennie zastępować świeżo przygotowanym roztworem azotanu.</li>
		<li>Po upływie czasu ekspozycji usunąć azotan za pomocą pipety transferowej. Dodać 50 ml buforu E3 i kilkakrotnie zamieszać naczynie, aby wypłukać azotan. Usuń ten bufor E3 za pomocą pipety transferowej i powtórz etap mycia jeszcze 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W każdym dniu ekspozycji należy policzyć liczbę martwych zarodków/larw za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Oznaki śmierci obejmują brak bicia serca i krążenia krwi lub brak motoryki po 1 minucie obserwacji. Usunąć martwe zarodki/larwy za pomocą pipety transferowej w celu zmniejszenia zanieczyszczenia buforu E3.</li>
	<li>Kiedy eksperymenty zakończą się przy 120 hpf, larwy należy poddać eutanazji.
	<ol>
		<li>Usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej. Następnie dodać 50 ml 0,2% MS-222 (zbuforowanego do pH 7) i odczekać 10 minut.</li>
		<li>Usunąć MS-222 za pomocą pipety transferowej. Dodać 50 ml buforu E3 i zamieszać, aby wypłukać MS-222.</li>
		<li>Usunąć bufor E3 za pomocą pipety transferowej i dodać 20 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w celu utrwalenia larw. Zakręć naczyniem kilka razy. Użyj pipety do przenoszenia, aby przenieść larwy do szklanej fiolki wraz z wystarczającą ilością PFA, aby napełnić fiolkę. Przechowywać fiolki w lodówce przez noc (O/N).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rób zdjęcia unieruchomionych larw za pomocą stereoskopu z aparatem cyfrowym. Użyj 30-krotnego powiększenia, ISO 200 i czasu naświetlania 200 ms. Ustaw larwy tak, aby przód po lewej stronie, a grzbiet znajdował się do górnej części pola.</li>
</ol>

<ol><li>Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+causes+of+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Teratogenic causes of malformations.</a> Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).</li>
<li>Brent, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cause+and+prevention+of+human+birth+defects%3A+What+have+we+learned+in+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Con+Anom%22%5BJournal%5D)">The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years.</a> Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).</li>
<li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li>
<li>Pamanji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+effects+of+profenofos+on+embryonic+and+larval+development+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio).</a> Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).</li>
<li>Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitrite+on+development+of+embryos+and+early+larval+stages+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).</li>
<li>Mantecca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+Evaluation+of+a+New+Zn-Doped+CuO+Nanocomposite+With+Highly+Effective+Antibacterial+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties.</a> Toxicol Sci. , (2015).</li>
<li>Jensen, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+formation+from+nitrite+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish.</a> J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).</li>
<li>Scholz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+embryo+model+in+environmental+risk+assessment--applications+beyond+acute+toxicity+testing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing).</a> Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+abortions+possibly+related+to+ingestion+of+nitrate-contaminated+well+water--LaGrange+County%2C+Indiana%2C+1991-1994%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).</li>
<li>Brender, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+nitrate+intake+from+drinking+water+and+selected+birth+defects+in+offspring+of+participants+in+the+national+birth+defects+prevention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study.</a> Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).</li>
<li>Huber, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+dietary+intake+of+nitrates%2C+nitrites+and+nitrosamines+and+selected+birth+defects+in+offspring%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+J%22%5BJournal%5D)">Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study.</a> Nutr J. 12, 34(2013).</li>
<li>Phillips, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nitrate+and+nitrite+in+foods+in+relation+to+infant+methaemoglobinaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Cosmet+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia.</a> Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).</li>
<li>Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%3A+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology.</a> Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).</li>
<li>Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+nitric+oxide%2C+nitrite%2C+and+hemoglobin%3A+role+in+blood+flow+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation.</a> Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).</li>
<li>Gupta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+acute+respiratory+tract+infections+in+areas+with+high+nitrate+concentrations+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water.</a> Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).</li>
<li>Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methemoglobinemia%3A+nitrate+toxicity+in+rural+America%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America.</a> Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).</li>
<li>Greer, F. R., Shannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infant+methemoglobinemia%3A+the+role+of+dietary+nitrate+in+food+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water.</a> Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).</li>
<li>Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methemoglobinemia+and+consumption+of+vegetables+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants.</a> Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).</li>
<li>Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf</a> (1991).</li>
<li>Virtanen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+and+nitrite+intake+and+the+risk+for+type+1+diabetes+in+Finnish+children.+Childhood+Diabetes+in+Finland+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group.</a> Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).</li>
<li>Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf">http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf</a> (2001).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Loucks, E., Carvan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+effects+of+developmental+ethanol+exposure+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).</li>
<li>Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+exposure+alters+zebrafish+development%3A+a+novel+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).</li>
<li>Li, J., Jia, W., Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+nitrite+affects+zebrafish+valvulogenesis+through+yielding+too+much+NO+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling.</a> PLoS One. 9 (3), e92728(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+chemical+analysis+of+water+and+wastes%22">Methods for chemical analysis of water and wastes</a>. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).</li>
<li>Loucks, E., Ahlgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+teratogenic+changes+in+a+zebrafish+model+of+fetal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAddiscott%2C+TM+%22Agricultural+Chemicals+and+the+Environment%2C+Issues+in+Environmental+Science+and+Technology%22">Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology</a>. , book 5 1-26 (1996).</li>
<li>Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+treatment+of+methemoglobinemia+in+an+elderly+couple+with+severe+cyanosis%3A+two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports.</a> Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).</li>
<li>Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+methaemoglobinaemia+induced+by+self-poisoning+with+sodium+nitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Emergency+Medicine+Australasia%22%5BJournal%5D)">Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite.</a> Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).</li>
<li>Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autopsy+case+of+fatal+methemoglobinemia+due+to+ingestion+of+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Research%22%5BJournal%5D)">An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium.</a> Forensic Research. 6, (2015).</li>
<li>Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Laboratory%3A+An+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tu metoda pokazuje przydatność danio pręgowanego w ocenie potencjału teratogennego azotynów i azotanów. W porównaniu z innymi kręgowcami danio pręgowany ma zalety, które obejmują wysoką płodność, nawożenie zewnętrzne, przezroczystość optyczną i szybki rozwój. Dostępne mutanty, które nie mają pigmentacji (takie jak danio pręgowany36) również pomagają zwiększyć widoczność narządów wewnętrznych. Łatwo jest również wygenerować transgenicznego danio pręgowanego z genami reporterowymi, aby ułatwić analizę u ...

Teratogeneza to proces, który zakłóca normalny rozwój zarodka lub płodu, powodując trwałe nieprawidłowości strukturalne i funkcjonalne, opóźnienie wzrostu lub poronienie w ciężkich przypadkach1. Może to być spowodowane przez niektóre czynniki naturalne (teratogeny), które na wiele sposobów zakłócają rozwój zarodka2. Podczas rozwoju płodu doniesiono, że powszechne teratogeny, takie jak promieniowanie, czynniki zakaźne, metale toksyczne i organiczne chemikalia, powodują defekty w fałdach epikantycznych (fałd skórny w górnej powiece) i klinodaktylii (zakrzywiony palec u ręki lub nogi) poprzez błędy morfogenetyczne1.
Zrozumienie molekularnego mechanizmu teratogenezy jest pierwszym krokiem w kierunku rozwoju leczenia i profilaktyki. Kilka modeli kręgowców, takich jak afrykańska żaba szponiasta (Xenopus laevis) i danio pręgowany (Danio rerio), wykorzystano do określenia szlaków molekularnych, na które wpływają teratogeny. W poprzednich badaniach wykorzystano danio pręgowanego jako model dla epidemiologii, toksykologii i teratogenezy3-7. Scholz i wsp. uznał danio pręgowanego za "złoty standard" w ocenie toksyczności środowiskowej. Wynika to po części z przezroczystości zarodka danio pręgowanego, która pozwala naukowcom na wizualizację wady rozwojowej w momencie jej wystąpienia8. Około 70% ludzkich genów ma ortologie u danio pręgowanego, co czyni danio pręgowanego pożądanym modelem kręgowców do badania wad u ludzi9.
Niektóre badania epidemiologiczne sugerują, że azotany i azotyny, powszechnie obecne w żywności i wodzie, są związane z wadami wrodzonymi lub samoistnymi poronieniami10,11, podczas gdy inne badania nie potwierdzają tego związku12. Azotany (NO3-) i azotyny (NO2-) są naturalnie obecne w glebie i wodzie. Są źródłem azotu dla roślin i wchodzą w skład cyklu azotowego13. Pokarmy takie jak fasolka szparagowa, marchew, dynia, szpinak i buraki z gospodarstw stosujących nawozy o wysokiej zawartości azotanów znacznie zwiększyły poziom azotanów i azotynów7. Mleko od krów karmionych pokarmami o wysokiej zawartości azotanów i ryb w wodzie o wysokiej zawartości azotanów (głównie ze spływu glebowego30) może prowadzić do spożywania przez ludzi dużych ilości azotanów i azotynów14. Azotany i azotyny są również powszechnie stosowane w konserwowaniu żywności, co znacznie zwiększa ilość spożywaną przez ludzi12.
Optymalna zawartość azotanów i azotynów odgrywa fundamentalne role w procesach fizjologicznych, takich jak homeostaza i funkcja naczyń krwionośnych, neurotransmisja i immunologiczne mechanizmy obronne gospodarza13-15. Jednak narażenie na wysokie poziomy azotanów i azotynów może prowadzić do działań niepożądanych, zwłaszcza u niemowląt i dzieci16. Spożyte azotany są dalej przekształcane w azotyny w jamie ustnej przez mikroflorę oraz w przewodzie pokarmowym przez mikroflorę jelitową17.
Azotany narażają niemowlęta na wysokie ryzyko wystąpienia zespołu niebieskiego dziecka poprzez utlenianie hemoglobiny do methemoglobiny, co pogarsza zdolność hemoglobiny do przenoszenia tlenu18. Powoduje to niebieski kolor skóry, który w cięższych przypadkach rozciąga się na tkanki obwodowe. Zahamowane dotlenienie tkanek skutkuje innymi objawami, z których najpoważniejsze prowadzi do śpiączki i śmierci19,20. Podobne objawy obserwuje się u niemowląt i dorosłych przy wyższych stężeniach azotanu21. Podwyższony poziom methemoglobiny u dorosłych spowodowany zatruciem azotynami powoduje sinicę, ból głowy, zaburzenia oddychania31 i śmierć, jeśli nie są leczone z powodu powikłań związanych z niedotlenieniem tkanek życiowych32,33.
Azotany spożywane w wyższych stężeniach mogą również powodować różne komplikacje zdrowotne. Cukrzyca dziecięca, nawracająca biegunka i nawracające infekcje dróg oddechowych u dzieci są związane z wysokim spożyciem azotanów11,17,22. Przewlekłe narażenie na wysoki poziom azotanów wiąże się z oddawaniem moczu i krwotokiem śledziony. Ostre narażenie na wysokie dawki azotanów może prowadzić do szerokiego spektrum schorzeń, takich jak ból brzucha, osłabienie mięśni, krew w stolcu i moczu, omdlenia i śmierć11. Prenatalne narażenie na wysokie stężenia azotanów wiąże się z cewą nerwową i wadą układu mięśniowo-szkieletowego11.
Niedawny raport wykazał, że traktowanie zarodków danio pręgowanego azotynami prowadziło do obrzęku woreczka żółtkowego, wad rozwojowych twarzoczaszki i osiowości oraz nienadmuchiwania pęcherza pławnego5. W tym badaniu demonstrujemy metodę leczenia zarodków danio pręgowanego azotanami i azotynami w celu określenia ich potencjału teratogennego. Zarodki poddano działaniu azotynów w różnych stężeniach i przez różny czas. Etanol był używany jako kontrola pozytywna, ponieważ jest uznanym teratogenem23. Nasza metoda wykazała, że zarówno wysokie stężenia, jak i długie czasy ekspozycji na azotyny były szkodliwe dla przeżycia i skutkowały różnymi fenotypami, od łagodnych (obrzęk) do ciężkich (poważne wady rozwojowe). W związku z tym danio pręgowany jest użytecznym modelem do bezpośredniego badania potencjalnego teratogennego wpływu azotanów i azotynów na zarodki w celu uzupełnienia badań epidemiologicznych.

<table><tbody><tr><td>DREL/2010 instrument</td><td>Hach</td><td>26700-03</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Szkło KIMAX szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89001-244</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>NitraVer 5 Odczynnik azotanowy</td><td>Hach</td><td>14034-46</td><td></td></tr><tr><td>NitriVer 3 Odczynnik azotynowy</td><td>Hach</td><td>14065-99</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>3-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy S6E</td><td>Leica</td><td>10446294</td><td></td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S343</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S347</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Laboratorium Produkty Sprzedaż</td><td>L320072</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr></tbody></table>

danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Wysoki poziom azotanów w środowisku może powodować wady wrodzone lub poronienia u ludzi. Przypuszczalnie jest to spowodowane konwersją azotanów do azotynów przez bakterie jelitowe i ślinowe. Jednak w innych badaniach na ssakach wysoki poziom azotynów nie powoduje wad wrodzonych, chociaż może prowadzić do złych wyników reprodukcyjnych. W związku z tym potencjał teratogenny azotynów nie jest jasny. Przydałby się system modelowania kręgowców, aby łatwo ocenić teratogenne działanie azotynów lub innych substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu pokazujemy przydatność danio pręgowanego (Danio rerio) do badań przesiewowych związków pod kątem toksyczności i wad embrionalnych. Zarodki danio pręgowanego są zapładniane zewnętrznie i szybko się rozwijają, co czyni je dobrym modelem do badań teratogennych. Pokazujemy, że wydłużenie czasu ekspozycji na azotyny negatywnie wpływa na przeżycie. Zwiększenie stężenia azotynów również niekorzystnie wpływa na przeżywalność, podczas gdy azotany nie. W przypadku zarodków, które przetrwają ekspozycję na azotyny, mogą wystąpić różne wady, w tym obrzęk osierdzia i woreczka żółtkowego, brak nadęcia pęcherza pławnego i wady rozwojowe twarzoczaszki. Nasze wyniki wskazują, że danio pręgowany jest wygodnym systemem do badania teratogennego potencjału azotynów. Podejście to można łatwo zaadaptować do testowania innych substancji chemicznych pod kątem ich wpływu na wczesny rozwój kręgowców.

Ekspozycja na 300 mM etanolu przez 22 h nie miała wpływu na przeżywalność (dane nie pokazano), co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami5,23,26. Jest to oczekiwany wynik, ponieważ etanol jest znanym teratogenem i służył jako kontrola pozytywna. Zaobserwowane fenotypy obejmowały obrzęk osierdzia, brak wypełnienia pęcherza pławnego powietrzem (Rysunek 1), wady czaszkowo-twarzowe oraz opóźnienie rozwoju (dane nie pokazano).
<p class="jove_content" fo:keep-...

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest poddanie zarodków ryb danio pręgowanego działaniu azotynów i określenie ich efektu teratogennego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii rozwojowej, takie jak ocena wpływu substancji chemicznych na rozwój embrionalny. Główną zaletą tej procedury jest wykorzystanie zarodków ryb danio pręgowanego, które rozwijają się zewnętrznie i mogą być obserwowane pod mikroskopem.W przypadku eksperymentów przedstawionych w niniejszym materiale, szczepy dzikiego typu danio przebrany, takie jak szczep Tuebingen, należy utrzymywać w temperaturze 28,5 °C, przy cyklu światła i ciemności wynoszącym odpowiednio 14 godzin i 10 godzin. W noc poprzedzającą zbiór ikry należy wlać wodę dla ryb i wstawić przegrody do zbiorników hodowlanych, a następnie umieścić osobniki męskie i żeńskie po przeciwnych stronach przegrody. Aby zapewnić uzyskanie odpowiedniej liczby ikry, należy przygotować 30 par ryb.Następnego ranka, po zapaleniu świateł, należy usunąć przegrody, aby zainicjować tarło. Zbiorniki z rybami należy sprawdzać co 15 minut w celu wykrycia ikry. Gdy ryby złożą ikrę, należy użyć sitka do herbaty, aby zebrać embrio

zebrafish-as-a-model-to-assess-the-teratogenic-potential-of-nitrite

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Zwiększona częstotliwość analiz farmakologicznych i toksykokinetycznych metali i związków na bazie metali u danio pręgowanego może być korzystna dla środowiskowych i klinicznych badań tłumaczeniowych. Ograniczenie związane z nieznaną ekspozycją na wodę zostało przezwyciężone poprzez przeprowadzenie analizy metali śladowych na strawionej tkance danio pręgowanego przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę oceny teratogennego potencjału azotynów na embrionach Danio rerio w toksykologii rozwojowej. Technika ta pozwala obserwować defekty rozwojowe pod mikroskopem.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Przeglądaj więcej filmów