Name: Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj syntezę liposomów reagujących na światło z nanocząstkami złota i mechanizm kontrolowanego uwalniania leków po wzbudzeniu laserem impulsowym. Ta metoda umożliwia badania dostarczania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundusze Badań Akademickich Tier-1 Ministerstwa Edukacji Singapuru (RG 64/12 do CX) oraz NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wyczyść kolby okrągłodenne o pojemności 100 ml za pomocą wody królewskiej (1 część stężonego kwasu azotowego (HNO3) i 3 części stężonego kwasu solnego (HCl)), a następnie opłucz kolby wodą dejonizowaną. Poddaj kolby autoklawowaniu i wysusz je w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 100 °C przez 15 min. Zawiń i przechowuj sterylne kolby do momentu użycia.</li>
	<li>Zdezynfekuj zestaw ręcznego mini-ekstrudera za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Włącz rotacyjny ewaporator i ustaw temperaturę kąpieli wodnej oraz chłodnicy odpowiednio na 37 °C i 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór zapasowy kalceiny o stężeniu 60 mM, rozpuszczając 374 mg kalceiny w 10 ml 0,1 mM fosforanowego buforu solnego (PBS) (pH 7,4). Dostosuj pH do wartości 7,4 za pomocą 1 M roztworu wodorotlenku sodu (NaOH).</li>
</ol>
2. Synteza liposomów
<ol>
	<li>Wyjąć lipidy (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) oraz 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)) z zamrażarki (-20 °C) i rozmrozić je do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Odważyć 15,9 mg DPPC, 1,3 mg MPPC oraz 2,8 mg DSPE-PEG2000. Rozpuścić je razem w 2 ml chloroformu.</li>
	<li>Przenieść roztwór chloroformu do sterylnej kolby okrągłodennej i odparować rozpuszczalnik za pomocą wirówki rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem, aby utworzyć cienką, suchą warstwę lipidową.</li>
	<li>Hydratować warstwę lipidową w temperaturze 45 °C przez 30 min za pomocą 2 ml roztworu wodnego zawierającego 1,95 ml 60 mM kalceiny przygotowanej w kroku 1.4 oraz 50 µl Au NPs (3,36 × 1016 cząsteczek/ml).</li>
	<li>Rozgrzać blok grzejny do 45 °C. Umieścić membranę filtracyjną z poliwęglanu o porach 200 nm pomiędzy wspornikami filtra i złożyć zestaw do mini-ekstruzji. Sprawdzić szczelność układu za pomocą wody dejonizowanej (DI water).</li>
	<li>Napełnić jedną z strzykawek 1 ml roztworu liposomów z kroku 2.4 i przeprowadzić ekstruzję próbki, przepuszczając roztwór do strzykawki znajdującej się po drugiej stronie złożonego mini-ekstrudera. Powtórzyć czynność 11 razy.</li>
	<li>Przepuścić zsyntetyzowane liposomy przez kolumnę odsalającą PD-10, aby usunąć wolne Au NPs, lipidy i kalceinę, używając PBS jako eluentu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Próbki przechowywać w sterylnych probówkach w temperaturze 4 °C i wykorzystać w ciągu 2 dni.</li>
</ol>
3. Uwalnianie kalceiny z liposomów pod wpływem ogrzewania
<ol>
	<li>Oblicz molalność lipidów w roztworze stokowym, sumując molalności DPPC, MPPC oraz DSPE-PEG2000 z kroku 2.2. Rozcieńcz roztwór stokowy liposomów do stężenia lipidów 5 mM, używając buforu PBS 0,1 mM (pH 7,4). Przenieś próbki do probówki wirówkowej (2 ml).</li>
	<li>Umieść probówkę w łaźni wodnej i stopniowo podnoś temperaturę od 25 do 70 °C. Zwiększaj temperaturę w tempie 1 °C/min.</li>
	<li>Pobieraj aliquoty (10 µl) w różnych punktach temperaturowych (27, 32, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 57, 62, 67 i 70 °C).</li>
	<li>Dodaj 10 µl 2% Triton X-100 do 2 ml aliquoty roztworu liposomalnego, aby przeprowadzić trawienie liposomów przez 10 min w RT i uzyskać całkowite uwolnienie kalceiny.</li>
	<li>Przenieś 200 µl roztworu liposomalnego do każdego dołka w mikropłytce 96-dołkowej i zmierz intensywność fluorescencji pobranych próbek za pomocą mikro forecastszytowego czytnika fluorescencji. Długości fal wzbudzenia i emisji kalceiny wynoszą odpowiednio 480 i 515 nm.</li>
	<li>Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 za 100% uwolnienia, oblicz procent uwolnionej kalceiny w każdym punkcie czasowym, korzystając z wzoru: 
	<img alt="Wzór równowagi statycznej. Równanie na procent uwolnienia, potencjalnie stosowane w analizie chemicznej." src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Formula1"> 
	Ft to intensywność fluorescencji roztworu w danym punkcie czasowym. Fi oraz Fx to odpowiednio znormalizowane początkowa i końcowa intensywność fluorescencji roztworu.</li>
</ol>
4. Uwalnianie kalceiny z liposomów za pomocą lasera impulsowego
<ol>
	<li>Przenieś 100 µl roztworu liposomów do kuwety kwarcowej i umieść ją w uchwycie na kuwetę. Jako źródło światła zastosuj impulsowy laser Nd:YAG o czasie trwania impulsu 6 nsec i długości fali 532 nm. Użyj następujących parametrów lasera — Częstotliwość repetycji: 1 Hz; Gęstość energii lasera: 1 mJ/cm2; Średnica wiązki: 0.5 mm.</li>
	<li>Kieruj skolimowaną wiązkę lasera przez kuwetę w taki sposób, aby światło przechodziło przez roztwór liposomów, a następnie pobieraj aliquoty po określonej liczbie impulsów.</li>
	<li>Do 2 ml aliquoty roztworu liposomalnego dodaj 10 µl 2% Triton X-100, aby przeprowadzić trawienie liposomów przez 10 min w RT i uzyskać całkowite uwolnienie kalceiny.</li>
	<li>Biorąc pod uwagę, że kalceina jest wrażliwa na światło i może ulec fotowybieleniu podczas eksperymentu laserowego, zmierz wcześniej efekt wybielania wywołany przez laser impulsowy w roztworze kalceiny, aby znormalizować dane dotyczące uwalniania z liposomów.
	<ol>
		<li>W szczególności poddaj roztwór kalceiny (60 mM) działaniu lasera impulsowego o częstotliwości 1 Hz dla różnych liczb impulsów (0, 25, 50 i 100). Zmierz intensywność fluorescencji kalceiny przy długościach fal wzbudzenia 480 nm i emisji 515 nm odpowiednio przed i po naświetlaniu laserowym.</li>
		<li>Oblicz stopień wybielenia (intensywność fluorescencji kalceiny przed naświetlaniem laserowym / intensywność fluorescencji kalceiny po określonej liczbie impulsów). Wykorzystaj ten współczynnik do normalizacji wartości uzyskanych z próbek liposomów, mnożąc intensywność fluorescencji liposomów przez ten współczynnik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz intensywność fluorescencji pobranej próbki za pomocą mikroczytnika płytek fluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia 480 nm i emisji 515 nm.</li>
	<li>Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 jako 100% uwalniania, oblicz procent uwolnionej kalceiny dla każdej liczby impulsów, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór równowagi statycznej. Równanie na procent uwalniania, potencjalnie stosowane w analizie chemicznej." src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Formula1"> 
	Ft to intensywność fluorescencji roztworu dla danej liczby impulsów po normalizacji. Fi i Fx to odpowiednio znormalizowane początkowa i końcowa intensywność fluorescencji roztworu.</li>
</ol>
5. Pomiar impulsów ciśnienia
<ol>
	<li>Nanieś 100 µl próbki na szkiełko mikroskopowe i ustaw ostrość lasera na próbce.</li>
	<li>Zanurz hydrofon igłowy (średnica 1 mm i czułość 450 nV/Pa) w roztworze. 
	Uwaga: Hydrofon nie może być naświetlany światłem lasera, aby uniknąć uszkodzenia.</li>
	<li>Naświetl próbkę impulsem lasera, stosując różną liczbę impulsów (0-100) oraz energię impulsu (20-160 µJ/pulse).</li>
	<li>Zarejestruj sygnały ciśnienia za pomocą oscyloskopu cyfrowego.</li>
</ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Hydratacja cienkowarstwowa to konwencjonalna metoda przygotowania liposomów. Rozpuszczalniki organiczne (w tym przypadku chloroform) najpierw użyto do rozpuszczenia lipidów, a następnie usunięto je w wyparce obrotowej w temperaturze 37 °C w celu wytworzenia cienkiego filmu lipidowego na kolbie. Ten film lipidowy uwodniono roztworem wodnym zawierającym 60 mM kalceiny i 5 nm Au NPs. Podczas procesu hydratacji temperatura była utrzymywana na poziomie około 50 °C, a kolba była stale mieszana poprzez obracanie kolby. Kluczowy...

Możliwość wywołania uwalniania leku za pomocą bodźców zewnętrznych jest atrakcyjnym sposobem dostarczania leków w sposób kontrolowany przestrzennie, czasowo i dawkowo, z maksymalną swoistością i minimalnymi skutkami ubocznymi. Spośród szerokiej gamy egzogennych systemów reagujących na bodźce (światło, pole magnetyczne, ultradźwięki, promieniowanie mikrofalowe), platformy wyzwalane światłem są atrakcyjne ze względu na ich nieinwazyjność, prostotę i zdolność adaptacji w klinikach. 1 Szeroko zakrojone badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady dostarczyły wielu technologii platformowych, takich jak złote nanokaże (Au) odpowiedzialne za działanie w bliskiej podczerwieni pokryte inteligentnymi polimerami,2 fotolabilne, polimerowe nanocząstki (NP) sprzężone z lekami,3 oraz samoorganizujące się nanopęcherzyki porfisomowe. 4 Technologie te znajdują się jednak nadal w przedklinicznej fazie rozwoju i wymagają jasnego zrozumienia i optymalizacji parametrów związanych z procesem inicjowania i kontrolowania uwalniania leku.
Jedną z najprostszych i łatwo dostępnych metod przygotowania takiego systemu jest integracja Au NPs z termicznie wrażliwymi liposomami5,6, które są powszechnie dostępne na rynku i zostały dokładnie zbadane w badaniach przedklinicznych, a nawet klinicznych. Pomimo ograniczenia aktywacji nanocząsteczek Au w głębokich tkankach przy ich plazmonicznej długości fali, w porównaniu z nanostrukturami Au aktywowanymi w bliskiej podczerwieni (np. nanoklatkami), system ten jest nadal bardzo obiecujący, gdy jest stosowany u małych zwierząt lub do miejscowego podawania u ludzi. 7 Istnieją pewne wczesne próby łączenia Au NPs z liposomami w celu uwolnienia wyzwalanego światłem. 8-11 Podczas gdy większość z nich skupia się na nowościach w materiałach, należy zająć się kwestiami dostępności i skalowalności. Co więcej, doniesienia na temat mechanizmów uwalniania z wykorzystaniem tych nanonośników są nadal ograniczone.
Tutaj opisano wytwarzanie liposomów reagujących na światło, jednocześnie naładowanych lekami i hydrofilowymi Au NPs. Kalceina jest stosowana jako związek modelowy do oceny skuteczności enkapsulacji i profilu uwalniania systemu. Ponadto w tym systemie światło pochłaniane przez Au NPs rozprasza się do otaczającego mikrośrodowiska w postaci ciepła, co skutkuje wzrostem lokalnej temperatury. Podczas nagrzewania laserowego powstają mikropęcherzyki powietrza, które powodują mechaniczne rozerwanie liposomów (ryc. 1). Mechanizm kawitacji mikropęcherzyków potwierdzają pomiary hydrofonu.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)</td><td>850355P</td><td>Proszek, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)</td><td>855675P</td><td>Proszek, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)</td> <td>880120P</td><td>Proszek, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Nanocząstki złota</td><td>Sigma Aldrich</td><td>752568-100mL</td><td>5&nbsp; cząstki nm, stabilizowane na poziomie 0,1&nbsp; mM PBS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875-10g</td><td>60&nbsp; mM, pH 7,4 (skorygowane za pomocą NaOH)</td></tr>sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0,1 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>Woda podwójnie destylowana</td><td>System</td><td></td><td></td>oczyszczania wody Millipore Milli-DI</tr><tr><td>Triton X100&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma, Nauki Przyrodnicze</td><td>X-100</td><td>Aby zakłócić liposomy w celu obliczenia całkowitej enkapsulacji</td></tr><tr><td>Rotavapor&nbsp; &nbsp;</td><td>Buchi (Szwajcaria)</td><td>R 210</td><td>Używany do przygotowania lipososmu</td></tr><tr><td>Kąpiel grzewcza</td><td>Buchi (Szwajcaria)</td><td>B 491</td><td>Używany do przygotowania lipososmu</td></tr><tr><td>Regulator próżni&nbsp; &nbsp;</td><td>Buchi (Szwajcaria)</td><td>V-850</td><td>Używany do przygotowania lipososmu</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Buchi (Szwajcaria)</td><td>V-700</td><td>Używany do przygotowania lipososmu</td></tr><tr><td>Kąpiel recyrkulacyjna z regulatorem temperatury</td><td>Polyscience</td><td></td><td>Używany do przygotowania lipososmu</td></tr><tr><td>Zespół mini-ekstrudera z blokiem grzewczym&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)</td> <td>610000</td><td>Używany do wytłaczania</td></tr><tr><td>strzykawek liposomów, 1,000 i #956; l</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA 610017</td><td></td> <td>Służy do wytłaczania liposomów</td></tr><tr><td>Membrana filtracyjna z poliwęglanu, 200&nbsp; nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>Służy do wytłaczania liposomów</td></tr><tr><td>Wsparcie filtra</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)</td><td>610014</td><td>Służy do wytłaczania liposomów</td></tr><tr><td>PD 10 Odsalanie kulumów, Sephadex G-25 medium</td><td>GE Healthcare, Nauki przyrodnicze</td><td>17-0851-01</td><td>Służy do oczyszczania liposomów</td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp; &nbsp;</td><td>Wirówki laboratoryjne Sigma</td><td>3K30</td><td>Służy do zagęszczania roztworu liposomalnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Sigma</td><td>19777-H</td><td>Służy do zagęszczania roztworu liposomalnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp; &nbsp;</td><td>Nano ZS Malvern</td><td></td><td>Służy do oznaczania wielkości liposomów i potencjału zetapotencjału</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Visible</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2450</td><td>Służy do pomiaru absorbancji próbek</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr fluorescencyjny&nbsp; &nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax M5</td><td>Służy do pomiaru emisji fluorescencji próbek</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 nm; Moc maksymalna: 17&nbsp; Mj; Szerokość: 406&nbsp; Nsec; Służy do naświetlania próbki</td></tr><tr><td>Hydrofon HNR</td><td>ONDA</td><td>HNR-1000</td><td>o średnicy 1 mm i czułości 450 nV/Pa, Właściwy zakres częstotliwości pracy: 0,25-10&nbsp; Mhz; Kalibracja: 50&nbsp; mV/bar; Służy do pomiaru sygnałów akustycznych</td></tr><tr><td>Oscyloskop cyfrowy</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>Częstotliwość: 600 MHz; Maksymalna częstotliwość próbkowania: 10&nbsp; Gs/s (na dwóch kanałach); Służy do nagrywania mierzonych sygnałów akustycznych</td></tr></tbody></table>

synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Nanocząstki reagujące na światło (NPs) zyskały znaczną uwagę ze względu na ich potencjał w zapewnianiu przestrzennej, czasowej i dawkowanej kontroli nad uwalnianiem leku. Jednak większość odpowiednich technologii jest nadal w fazie rozwoju i nie mogą być dostępne w przypadku klinik. Tutaj opisujemy łatwe wytwarzanie tych światłoczułych nanocząsteczek za pomocą dostępnych na rynku nanocząsteczek złota i liposomów termoczułych. Kalceina jest stosowana jako lek modelowy do oceny skuteczności enkapsulacji i profilu kinetycznego uwalniania po stymulacji cieplnej/świetlnej. Na koniec pokazujemy, że to wyzwalane światłem uwolnienie jest spowodowane rozerwaniem błony spowodowanym kawitacją mikropęcherzyków, którą można zmierzyć za pomocą hydrofonu.

Liposomy przygotowano przy użyciu konwencjonalnej techniki hydratacji cienkiej warstwy z DPPC, MPPC i DSPE-PEG2000 w stosunku molowym 86:10:4 lub stężeniach 7,95:0,65:1,39 mg/ml.12 Rozmiar nanocząsteczek Au (Au NPs) ma kluczowe znaczenie dla określenia wydajności konwersji światła na ciepło podczas następnego eksperymentu z wzbudzeniem laserowym. Im mniejszy rozmiar Au NPs, tym wyższa wydajność transdukcji.13 W związku z tym do enkapsulacji wybrano 5 nm Au NPs, będąc...

Ten protokół opisuje prostą metodę przygotowania zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło z dostępnymi na rynku materiałami. Pokazuje również, jak zmierzyć proces kawitacji mikropęcherzyków zsyntetyzowanych liposomów po leczeniu laserem impulsowym.

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zademonstrowanie syntezy liposomów wrażliwych na światło oraz wyjaśnienie mechanizmu kontrolowanego światłem uwalniania leku z tych liposomów. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odpowiedzi świetlnej liposomów w dostarczaniu leków, gdzie głównymi wyzwaniami są synteza liposomów oraz zwiększenie stopnia kontrolowanego uwalniania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość syntezy liposomów wrażliwych na światło przy użyciu materiałów dostępnych w handlu.Zastosowanie tej technologii rozszerza się na terapię tkanek powierzchownych. Wykorzystanie procedur minimalnie inwazyjnych, a także części urządzenia laserowego, sprawi, że platforma technologiczna stanie się bardziej dostępna dla pacjentów. Poza dostarczeniem wiedzy na temat najwyższą jakości opieki i precyzyjnego dostarczania leków, nasz system może być stosowany w innych układach, takich jak małe modele zwierzęce, a także w układzie śluzowym za pomocą laserów prowadzących.Najpierw należy oczyścić kolbę okrągłodenna o pojemności 100 ml za pomocą wody królewskiej. Po przemyciu wodą dejonizowaną i autoklawowaniu, wysuszyć kolbę w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 100 °C przez 15 minut. Następnie sterylną kolbę należy zapakować i przechowywać do momentu użycia.Zisterylizuj ręczny zestaw do mini-ekstruzji, używając 70% etanolu. Następnie włącz wirówkę rotacyjną i ustaw temperaturę kąpieli wodnej oraz chłodnicy odpowiednio na 37 i 4 stopnie Celsjusza. Przygotuj 60 milimolarny roztwór zapasowy wapnia, rozpuszczając 374 miligramy kalceiny w 10 mililitrach 0,1 milimolarnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo lub PBS.Dostosuj pH do wartości 7.4, używając jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu. Wyjmij lipidy z zamrażarki i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu lipidów rozpuść 15.9 mg DPPC, 1.3 mg MPPC oraz 2.8 mg DSPE-PEG2000 w dwóch mililitrach chloroformu.Po przelaniu roztworu chloroformu do sterylnej kolby okrągłogrzasnej, odparuj rozpuszczalnik za pomocą rotacyjnego odparowacza pod zmniejszonym ciśnieniem, aby utworzyć cienką, suchą warstwę lipidów. Następnie hydratuj warstwę lipidową w temperaturze 45 °C przez 30 minut, używając dwóch mililitrów roztworu wodnego zawierającego 1,95 mililitra wcześniej przygotowanego 60 mM roztworu wapnia oraz 50 µL nanocząsteczek złota. Wstępnie rozgrzej blok grzejny do 45 °C.Umieść membranę filtracyjną z poliwęglanu o porach 200 nanometrów pomiędzy wspornikami filtrów i złóż zestaw mini-ekstrudera. Następnie sprawdź szczelność układu, używając wody dejonizowanej. Napełnij jedną z strzykawek jednym mililitrem wcześniej przygotowanego roztworu liposomów i przeprowadź ekstruzję próbki, przepuszczając roztwór przez strzykawkę znajdującą się po drugiej stronie złożonego mini-ekstrudera.Po powtórzeniu poprzedniego kroku 11 razy, przeprowadź zsyntetyzowane liposomy przez kolumnę odsalającą PD-10 w celu usunięcia wolnych nanocząsteczek złota, lipidów i kalceiny, stosując PBS jako eluent zgodnie z protokołem producenta. Po zakończeniu przechowywać próbki w sterylnych probówkach w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na tym etapie oblicz molowość lipidów roztworu zapasu, sumując molowości DPPC, MPPC i DSPE-PEG2000.Rozcieńczyć roztwór zapasowy liposomów do stężenia lipidów 5 millimolar używając 0,1 millimolar PBS, a następnie przenieść próbki do probówek wirówkowych o pojemności 2 mililitrów. Następnie umieścić probówki w kąpieli wodnej i stopniowo podnieść temperaturę z 25 do 70 stopni Celsjusza. Pobrać 10 mikrolitrowe alikwoty w różnych punktach temperaturowych.Dodaj 10 µL dwuprocentowego Triton X-100 do 2 mL alikwotu roztworu liposomalnego, aby przeprowadzić lizę liposomów przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zapewnić całkowite uwolnienie kalceiny. Następnie przenieś 200 µL roztworu liposomalnego do każdej studni płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Zmierz intensywność fluorescencji zebranych próbek przy użyciu mikroczytnika płytek fluorescencyjnych.Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 jako 100% uwalniania, oblicz procent uwolnionej kalceiny w każdym punkcie czasowym, korzystając z następującego wzoru: Przenieś 100 µL roztworu liposomów do kuwety kwarcowej i umieścin kuwetę w uchwycie. Poprowadź skolimowany wiązkę lasera przez kuwetę tak, aby światło przechodziło przez roztwór liposomów. Następnie pobierz alikwoty po kolejnych impulsach.Następnie do 2 mililitrów alikwotu roztworu liposomalnego dodaj 10 mikrolitrów 2% triton x-100, aby przeprowadzić trawienie liposomów przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zapewnić całkowite uwolnienie kalceiny. Aby wstępnie zmierzyć efekt wybielania roztworu kalceiny przez laser, wystaw roztwór na działanie lasera o częstotliwości 1 herca przy zmiennej liczbie impulsów. Zmierz intensywność fluorescencji kalceiny przy długościach fal wzbudzenia i emisji wynoszących odpowiednio 480 i 515 nanometrów przed i po ekspozycji na laser.Po obliczeniu ilości wybielania należy wykorzystać ten czynnik do normalizacji wartości uzyskanych z próbek liposomów, mnożąc intensywność fluorescencji liposomów przez ten czynnik. Następnie zmierz intensywność fluorescencji pobranej próbki za pomocą mikroplate’owego czytnika fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 480 i 515 nanometrów. Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 jako 100% uwalniania, oblicz procent uwolnionej kalceiny dla każdego numeru impulsu.Nanieś 100 µl próbki na szkiełko przedmiotowe, a następnie ustaw ostrość laseru na próbkę. Laser jest prowadzony przez próbkę ręcznie, dlatego ważne jest upewnienie się, że punkt ogniskowania wiązki znajduje się wewnątrz próbki, a nie na szkiełku przedmiotowym, aby uniknąć błędów w dalszych eksperymentach. Następnie zanurz hydrofon igłowy w roztworze.Głowica hydrofonu zostaje zanurzona w próbce w dostatecznej odległości od punktu ogniskowania lasera. Zapobiega to uszkodzeniom hydrofonu wywołanym działaniem lasera. Próbkę naświetla się laserem impulsowym, stosując różną liczbę impulsów oraz różną energię impulsu.Na koniec zarejestruj sygnały ciśnienia za pomocą oscyloskopu cyfrowego. Nie zaobserwowano znaczących różnic w procencie uwalniania dla liposomów z nanocząsteczkami złota i bez nich. Liposomy pozostały niemal nienaruszone w temperaturze fizjologicznej, a procent wycieku wynosił mniej niż 10% niezależnie od obecności nanocząsteczek złota.Gdy temperaturę zwiększono do 42 stopni Celsjusza, w ciągu dwóch minut z liposomów uwolniono od 60 do 80 procent enkapsulowanej kalceiny. Liposomy z nanocząsteczkami złota uwalniały enkapsulowaną kalceinę po wzbudzeniu, przy czym ilość uwolnionej kalceiny wzrastała wraz ze wzrostem liczby impulsów. Tutaj przedstawiono sygnały akustyczne zarejestrowane dla nanocząsteczek złota, liposomów z nanocząsteczkami złota oraz liposomów bez nanocząsteczek złota: Impuls ciśnienia zawiera zarówno fazę dodatnią, jak i ujemną, co sugeruje tworzenie się i rozpad mikropęcherzyków w roztworze.Zgodnie z oczekiwaniami amplituda sygnału akustycznego stopniowo wzrastała wraz ze wzrostem energii lasera, co powinno wynikać ze zwiększonej intensywności oscylacji cząstek przyczyniających się do następującego po niej rozszerzenia i skurczu termoakustycznego. Po opanowaniu techniki przygotowanie liposomów może zostać wykonane w ciągu 3 godzin, pod warunkiem wcześniejszego przygotowania całej szklanej aparatury i sprzętu. Podczas próby kontrolowanego uwalniania za pomocą lasera należy pamiętać, aby wiązka laserowa była całkowicie skupiona na próbce, aby uniknąć utraty energii lasera.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać kolejne eksperymenty, takie jak kontrolowane uwalnianie indukowane laserem in vitro i in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące wpływu warunków fizjologicznych na proces uwalniania sterowanego laserem. Po dopracowaniu ta technika będzie wartościowa w obszarze reaktywności, umożliwiając badanie, lokalizację i kontrolowanie uwalniania substancji do skóry, oczu oraz błon śluzowych.

synthesis-gold-nanoparticle-integrated-photo-responsive-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pokazujemy przygotowanie i zajmujemy się wykonalnością nośników komórkowych zawierających złote nanopręty do fotoakustycznego obrazowania raka.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Nasycone i odwrócone saturable rozpraszanie zostały odkryte w izolowanych cząstkach plazmonicznych i przyjęte jako nowatorska metoda kontrastu bez wybielania w mikroskopii superrozdzielczej. Tutaj szczegółowo wyjaśniono eksperymentalne procedury wykrywania i ekstrakcji rozpraszania nieliniowego, a także sposoby zwiększenia rozdzielczości za pomocą nasyconej mikroskopii wzbudzenia.

Pomiar nieliniowości rozpraszania od pojedynczej nanocząstki plazmonicznej

Tutaj prezentujemy niezawodną metodę monitorowania inkorporacji nanocząstek do matrycy gospodarza polimeru poprzez enkapsulację pęcznienia. Pokazujemy, że stężenie powierzchniowe kropek kwantowych selenku kadmu można dokładnie zobrazować za pomocą przekrojowego obrazowania fluorescencyjnego.

Zaawansowana analiza składu kompozytów nanocząstkowo-polimerowych z wykorzystaniem bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

Opisana jest niezawodna i łatwo odtwarzalna metoda przygotowania funkcjonalnych, emitujących światło podczerwone fotoluminescencyjnych nanoklastrów złota i ich bezpośredniego wykrywania wewnątrz komórek HeLa za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Synteza nanoklastrów złota emitujących promieniowanie bliskiej podczerwieni do zastosowań biologicznych

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Ta praca przedstawia protokół umożliwiający osiągnięcie dynamicznego, nieinwazyjnego monitorowania transferu ciepła z napromieniowanych laserowo nanocząstek złota do tBLM. System łączy spektroskopię impedancji do pomiaru zmian przewodności w czasie rzeczywistym w tBLM z poziomo skupioną wiązką laserową, która napędza oświetlenie nanocząstek złota, w celu produkcji ciepła.

Dwuwarstwowe membrany lipidowe na uwięzi do monitorowania wymiany ciepła między nanocząstkami złota a błonami lipidowymi

Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota o średnicy ~12 nm (nanocząstek Au) w rozpuszczalniku organicznym. Nanocząstki złota są pokryte ligandami oleiloaminy, aby zapobiec aglomeracji. Nanocząstki złota są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen.

Synteza nanocząstek złota

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

Ultraszybka ablacja laserowa w cieczy to precyzyjna i wszechstronna technika syntezy nanomateriałów (nanocząstek [NPs] i nanostruktur [NSs]) w środowisku ciecz/powietrze. Nanomateriały ablowane laserowo mogą być funkcjonalizowane cząsteczkami aktywnymi Ramanem w celu wzmocnienia sygnału Ramana analitów umieszczonych na lub w pobliżu NS/NP.

Ultraszybkie nanocząstki i nanostruktury z ablacją laserową do zastosowań w wykrywaniu opartym na rozpraszaniu Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym

Poznaj syntezę liposomów reagujących na światło z nanocząstkami złota i mechanizm kontrolowanego uwalniania leków po wzbudzeniu laserem impulsowym. Ta metoda umożliwia badania dostarczania leków.

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym (Wideo) | JoVE Journal

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

Przeglądaj więcej filmów