Elektroaktywne nanocząstki polimerowe wykazujące właściwości fototermiczne

Ogólnym celem tego protokołu jest przygotowanie przewodzących nanocząstek polimerowych, które wykazują właściwości fototermiczne, oraz ocena ich cytotoksyczności. Przewodzące nanocząstki polimerowe są idealnymi środkami do terapii fototermicznej, ponieważ pochłaniają światło w zakresie bliskiej podczerwieni i przekształcają je w ciepło w celu zabicia komórek rakowych. Główną zaletą polimerowych środków fototerapii jest to, że można je dostosować tak, aby dostroić ich właściwości absorpcyjne poprzez kompatybilność i zdolność do celowania w guz, aby umożliwić skuteczną nieinwazyjną miejscową terapię raka.

Polimery, których używamy do terapii fototermicznej, mogą być również wykorzystywane do alternatywnych zastosowań energetycznych, czujników i elektrochromu. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, ponieważ reakcja jest wrażliwa na wilgoć. Niezbędne jest dobre zrozumienie technik syntezy bezpowietrznej.

Wizualna demonstracja testów hodowli komórkowych ma kluczowe znaczenie, ponieważ techniki sterylne są trudne do opanowania. Wszystkie testy gry wielorolowej wymagają dokładności i spójności, aby osiągnąć prawidłowe wyniki. Do kolby z trzema szyjkami i okrągłym dnem przymocuj przegrodę, skraplacz wyposażony w adapter sterujący wlotem i adapter sterujący wylotem gazu.

Podłącz adapter wylotu gazu do bełkotki. Następnie podłącz adapter wlotowy do linii argonowej Shlenk z grubościennymi rurkami PVC. Rozpocząć przepływ argonu do kolby reakcyjnej i pozwolić gazowi płynąć przez kilka minut.

Po włączeniu próżni należy za pomocą palnika Bunsena wysuszyć reakcję na płomieniu, a następnie przepłukać aparat argonem. Powtórz to jeszcze dwa razy, aby uzyskać środowisko pozbawione powietrza. Za pomocą strzykawki dodać jeden punkt zero siedem gramów EDOT do aparatu przez przegrodę.

Dodaj 20 mililitrów tetrahydrofuranu do kolby i zamieszaj. Przygotować kąpiel z suchym lodem i acetonem w niskiej formie kolby Dewara i schłodzić kolbę EDOT przez 15 minut w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza. Następnie zanurz się w 11 milimolach n-butyllitu w heksanach, utrzymując temperaturę minus 78 stopni Celsjusza.

Po całkowitym dodaniu mieszaj przez dodatkową godzinę. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikami z litu organicznego. Roztwory te są wyjątkowo niebezpieczne i powinny być obsługiwane wyłącznie przez kogoś, kto został gruntownie przeszkolony w ich stosowaniu.

Usunąć kąpiel acetonowo-lodową z suchym lodem. I natychmiast rozpocznij dodawanie kroplami 14 punktów 13 mililitrów jednomolowego roztworu chlorku, mieszając przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie do reakcji dodać cztery milimole jednego, czterech dialkoksy, dwóch pięciu dibromobenzenu i 80 mikromoli palladu tetrakis trifenylofosfiny.

Rozpocznij ponowne przepływanie reakcji w temperaturze 75 stopni Celsjusza za pomocą kąpieli olejowej. Każdego dnia za pomocą strzykawki pobieraj małą próbkę mieszaniny reakcyjnej. Wytrącić próbkę w dwóch mililitrach jednego molowego kwasu solnego i użyć dwóch mililitrów dichlorometanu do ekstrakcji materiału.

Odnotuj ekstrakt na chromatografii cienkowarstwowej krzemionki lub płytce TLC, wraz z gotowymi roztworami oczyszczonego EDOT i odpowiadającego mu jednego czterech dialkoksy dwóch pięciu dibromobenzenu. Użyj roztworu octanu etylu i heksanów o stężeniu od 60 do 40, aby rozwinąć płytkę w szklanej komorze. Po zakończeniu reakcji, w ciągu trzech do pięciu dni, schłodzić reakcję do temperatury pokojowej.

Dodaj 10 mililitrów jednego molowego kwasu solnego, a następnie 20 mililitrów dichlorometanu, aby wygasić reakcję. Przenieść zarobek reakcji do rozdzielacza i wyizolować warstwę organiczną. Umyj substancje organiczne wodą dejonizowaną, aż mycie wodą przestanie być kwaśne.

Następnie wysusz substancje organiczne na 15 gramach siarczanu magnezu. Po odfiltrowaniu ciała stałego usuń rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać żółto-pomarańczowe ciało stałe. W szklanym podłożu przygotuj jeden mililitr dwóch procent objętości PSS-co-MA w wodzie i dodaj mały mieszadło.

Przygotuj 16 miligramów na mililitr roztworu monomeru w chloroformie i przenieś 100 mikrolitrów do probówki z mikrowirówką. Rozpuść 30 miligramów kwasu dodecylobenzenosulfonowego w probówce do mikrowirówki, a następnie użyj automatycznego mieszalnika wirowego przez 30 do 60 minut w celu homogenizacji roztworu. Następnie co 60 sekund dodawać homogenizowaną fazę organiczną w 10 mikrolitrach podwielokrotności do dwuprocentowego roztworu PSS-co-MA.

Po całkowitym dodaniu rozcieńczyć roztwór dwoma mililitrami wody i usunąć mieszadło. Umieść emulsję w łaźni lodowej, a następnie użyj sondy do sonizacji emluzji w dwóch 10-sekundowych odstępach przy amplitudzie 30 procent. Wyjąć fiolkę z łaźni lodowej i wymienić mieszadło, aby kontynuować mieszanie emulsji.

Następnie dodaj trzy punkty osiem mikrolitrów stu miligramów na mililitr wodnego roztworu chlorku żelaza do emulsji monomeru i mieszaj przez godzinę, aby uzyskać nanocząstki polimerowe stabilizowane PSS-co-MA. Przenieś zawiesinę nanocząstek do siedmiomililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj zawiesinę w temperaturze 75 600 razy G przez trzy minuty. Na koniec odzyskaj supernatant i dializa w wodzie przez 24 godziny za pomocą rurki do dializy o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów.

Hodowla SCOV trzech komórek raka jajnika w DMEM uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla w kolbach T 75. Po dysocjacji i zliczeniu komórek przy użyciu standardowych protokołów, podawaj komórki o gęstości 5 000 komórek na studzienkę na płytce 96-dołkowej. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla.

Bezpośrednio przed użyciem należy wprowadzić zawiesinę nanocząstek do pełnej pożywki wzrostowej w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Przefiltruj zawiesinę nanocząstek przez sterylny filtr mikrometryczny o temperaturze zerowej dwóch. Następnie rozcieńczyć zawiesinę do pożądanych stężeń ekspozycyjnych pełną pożywką wzrostową uzupełnioną jednoprocentową penicyliną streptomycyną.

Delikatnie usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 100 mikrolitrami zawiesiny nanocząstek o różnych stężeniach ekspozycji. Po inkubacji komórek ostrożnie usuń roztwór, a następnie zastąp pożywkę 100 mikrolitrami sterylnego, przefiltrowanego punktu zerowego o temperaturze pięciu miligramów na mililitr roztworu MTT. Inkubuj komórki przez dwie do czterech godzin w inkubatorze.

Następnie zbadaj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy nie tworzą się kryształy Formazanu. Ostrożnie usuń roztwór MTT i zastąp go 100 mikrolitrami dimetylosulfotlenku. Umieść talerz na shakerze i mieszaj przez kilka minut.

Na koniec zmierz absorbenty każdej studzienki przy 590 nanometrach i 700 nanometrach. Wartości te odpowiadają odpowiednio maksymalnym absorbentom produktu Formazan i linii bazowej. Otrzymane monomery można scharakteryzować za pomocą spektroskopii wodoru i węgla 13 NMR.

Reakcje sprzęgania Negishi przyłączają pierścień fenylowy do EDOT, powodując przesunięcie piku fenylowego protonu z siedmiu punktów jeden PPM do siedmiu punktów ośmiu PPM. Proton Theyenel przesuwa się również w górę pola do sześciu punktów pięć PPM. Cztery protony na węglach mostka etylenodioksylowego rozpadają się na dwa zestawy multipletów w czterech punktach i trzech PPM.

Widmo NMR węgla 13 wykazuje piki przy jednym 70, jednym 45, jednym 40 i jednym 13 dla atomów węgla thyenelu oraz jednym 50, jednym 20 i jednym 12 dla atomów węgla fenylenu. Kompatybilność cytalna nanocząstek polimerowych określa się za pomocą testu żywotności komórek MTT. W zakresie stężeń nanapcząstek od punktu zerowego dwa trzy do 56 mikrogramów na mililitr, nanocząstki nie zmniejszają żywotności komórek do mniej niż 90 procent kontroli.

Zazwyczaj zmniejszenie żywotności komórek o mniej niż 20 procent jest uważane za dopuszczalne. Po opanowaniu synteza monomeru zajmuje około tygodnia, kolejny tydzień na jego oczyszczenie i mniej niż jeden dzień na przygotowanie i oczyszczenie nanocząstek. Badanie citotoksyczności można przeprowadzić w ciągu dwóch i pół dnia od wysiewu komórek do zakończenia testu.

Podczas prób badań komórkowych in vitro bardzo ważne jest przestrzeganie odpowiednich technik aseptyki. Dodatkowe badania, takie jak testy żywych zmarłych, badania mikroskopowe oraz biodystrybucja in vivo i badania owulacji fototermicznej, mogą być przeprowadzone z nanocząstkami przygotowanymi za pomocą tych protokołów, aby lepiej zrozumieć ich potencjał jako czynników fototermicznych w terapii raka.