Indukcja matczynej aktywacji immunologicznej u myszy w połowie ciąży za pomocą wirusowego poli(I:C)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie matczynej aktywacji immunologicznej (MIA, ang. maternal immune activation) u myszy poprzez douszczytnicze wstrzyknięcie mimetyku wirusowego poly w środkowym etapie rozwoju embrionalnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii, takie jak wpływ dysfunkcji odpornościowej na zaburzenia rozwoju mózgu i zachowania. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że została ona opracowana specjalnie dla badaczy zainteresowanych analizą MIA jako środowiskowego czynnika ryzyka autyzmu i schizofrenii.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ niewielkie różnice w metodzie indukcji MIA mogą znacząco zmienić późniejszą odpowiedź u potomstwa. Aby przygotować parę do zapłodnienia w określonym czasie, należy zacząć od umieszczenia pięciu samic myszy w klatce obok siebie w standardowych klatkach dla myszy w celu synchronizacji ich cyklów rujestralnych, a następnie oznaczyć każde zwierzę za pomocą dziurkacza do uszu. Od zero do dwóch godzin przed rozpoczęciem cyklu ciemnego należy przenieść samice myszy tak, aby w każdej klatce znajdowały się dwie sztuki, zważyć i zapisać masę ciała każdej myszy, a następnie dodać jednego samca do każdej klatki z dwiema samicami.

Od zera do czterech godzin po zakończeniu cyklu ciemności, delikatnie unieś każdą samicę myszy za nasadę ogona, pozwalając zwierzęciu chwycić przednimi łapami kratkę klatki, aby stwierdzić obecność białawej masy w otworze pochwy. Jeśli czop nie jest widoczny, delikatnie wprowadź końcówkę pipety o pojemności 200 µL do otworu pochwy. Opór wynikający z koagulacji potwierdza obecność czopu.

Przenieś myszy z czopem pochwą do nowej klatki, ponieważ obecność czopa potwierdza jedynie fakt odbycia kopulacji. W dniach embrionalnych od 10,5 do 11,5 unieś każdą samicę z czopem za nasadę ogona i sprawdź, czy w obrębi jamy brzusznej widoczne jest uwypuklenie, następnie zważ myszy w celu potwierdzenia ciąży i umieść ciężarne zwierzęta w oddzielnych, czystych klatkach. Odważ proszek poly(I:C) do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

W 12,5 dniu embrionalnym do odpowiedniej objętości poly(I:C) w probówce stożkowej należy dodać odpowiednią objętość 0,9% NaCl i zamknąć nakrętkę. Delikatnie toczyć kropelkę soli fizjologicznej po proszku, aż do uzyskania klarownego roztworu. Następnie probówkę należy odwirować, a roztwór poly(I:C) przenieść do probówki do mikrocentryfugi.

Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stosunek absorbancji 260 do 280 nm roztworu poly(I:C). Stosunek ten powinien mieścić się w przedziale od 1,54 do 1,82, zgodnie z opisem producenta. Następnie zważ pierwszą mysz i nabierz do strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml odpowiednią, obliczoną objętość roztworu poly(I:C).

Następnie, chwyciwszy mysz za ogon, umieść ją na górze klatki i zabezpiecz, chwytając za kark. Teraz wprowadź igłę, ściętym końcem do góry, w obszar pomiędzy dwoma górnymi sutkami pod kątem około 20 stopni względem ciała myszy i podaj roztwór poly(I:C). Następnie umieść mysz z powrotem w klatce.

Po wstrzyknięciu preparatu wszystkim myszom, należy umieścić klatki w cichym pomieszczeniu o niskim natężeniu ruchu, aby uniknąć innych czynników zakłócających, a następnego dnia rano zważyć zwierzęta. Przynajmniej trzy dni przed badaniami behawioralnymi należy wymienić ściółkę w klatkach potomstwa z grupy MIA (maternal immune activation) w wieku od 8 do 12 tygodni. Na 30 minut przed testem należy poddać myszy aklimatyzacji w pomieszczeniu badawczym.

W celu przeprowadzenia testu hamowania reakcji orientacyjnej (PPI), unieruchom myszy w cylindrach z pleksiglasu umieszczonych na czujniku piezoelektrycznym. Adaptuj mysz do komory PPI przez pięć minut, stosując sześć prób białego szumu o natężeniu 120 dB. Następnie poddaj myszy działaniu zrandomizowanych mieszanek dźwięków, zgodnie z opisem w tabeli, i porównaj wyniki z bazową reakcją orientacyjną, aby określić stopień hamowania PPI u zwierząt z modelem MIA.

W celu przeprowadzenia testu otwartego pola, umieść mysz w rogu otwartej kwadratowej areny z wyznaczoną strefą centralną o wymiarach 17 na 17 centymetrów, a następnie rejestruj trajektorię poruszania się myszy przez 10 minut za pomocą kamery zamontowanej na suficie. Następnie określ liczbę wejść do strefy centralnej oraz czas spędzony w tej strefie. W przypadku testu zakopywania kulek, poddaj mysz 10-minutowej aklimatyzacji w klatce testowej z ubitym, czystym ściółką z drewna osiki o głębokości 5 centymetrów, po czym przenieś mysz z powrotem do klatki domowej i ostrożnie ułóż 20 granatowych szklanych kulek o średnicy 1,5 centymetra w siatce o wymiarach cztery na pięć w klatce testowej.

Następnie należy zwrócić mysz do klatki testowej na 10 minut, po czym umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej i policzyć liczbę zakopanych kulek w czasie trwania testu. Iniekcja Poly(I:C) w 12,5 dniu embrionalnym może wywołać ostrą odpowiedź zapalną w osi matka-łożysko-płód oraz wywołać chroniczny wpływ na rozwój mózgu i fenotypy behawioralne. Rzeczywiście, poly(I:C) indukuje wyższą ekspresję genu Il6 w śledzionie matki, łożysku i mózgu płodu trzy godziny po iniekcji.

Ogólnie, w porównaniu z dorosłym potomstwem traktowanym solą fizjologiczną, dorose potomstwo MIA wykazuje rzadsze wejścia do strefy centralnej oraz krótszy czas przebywania w strefie centralnej w teście otwartego pola. Zwierzęta wstrzyknięte poly(I:C) wykazują również częstsze zachowania zakopywania w teście zakopywania kulek oraz niższe hamowanie wywołane bodźcem wstępnym. Utrata komórek Purkinjego w siódmym zakucie móżdżku jest kolejną cechą charakterystyczną dla potomstwa MIA, przy czym w siódmym zakucie móżdżku tych zwierząt obserwuje się mniej kalbindyna-dodatnich komórek Purkinjego w porównaniu z grupą kontrolną wstrzykniętą solą fizjologiczną.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o tym, by nie niepokoić ciężarnych myszy po indukcji MIA. Następnie można wywołać dodatkowe czynniki, takie jak stres ponatalny lub infekcja, w celu zbadania dodatkowych interakcji środowiskowych.