Name: Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia szybką i ilościową analizę interakcji białek z DNA podczas replikacji i naprawy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca nad tym manuskryptem była wspierana przez fundusze z Dept. of Radiation Oncology i Huntsman Cancer Institute oraz grant National Institute of Health (R01-CA188520) dla SB. Dziękuję Danielle Johnson i Stevenowi Bennettowi w moim laboratorium za zademonstrowanie protokołu i wyjaśnienie jego zalet. Jestem wdzięczny dr Maheshowi Chandrasekharanowi (Huntsman Cancer Institute) za krytyczne uwagi na temat manuskryptu.

1. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) po znakowaniu BrdU
<ol>
	<li>Hodowla komórek NIH3T3 w obecności selektywnych inhibitorów DMSO lub HDAC1,2, jak opisano wcześniej6.</li>
	<li>Po leczeniu selektywnymi inhibitorami DMSO lub HDAC1,2 dodać BrdU do komórek w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej. Inkubować 2 x 106 komórek NIH3T3 posianych w 10 ml pożywki NIH3T3 z końcowym stężeniem 20 μM bromodeoksyurydyny (BrdU) przez 60 minut w sterylnym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Sieciowanie białek wewnątrzkomórkowych z DNA poprzez dodanie formaldehydu bezpośrednio do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 1%. Inkubować 2 x 106 komórek NIH3T3 z formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 minut na shakerze.</li>
	<li>Ugasić sieciowanie przez dodanie glicyny do końcowego stężenia 125 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na wytrząsarce.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i zebrać komórki z PBS w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 956 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dwukrotnie przemyć osad komórkowy lodowatym PBS. Usunąć PBS z probówki. Usieciowany osad komórkowy bez PBS (supernatantu) należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować lizat z usieciowanego osadu komórkowego, dodając 500 μl buforu FA140 (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Ścinaj chromatynę, sonikując próbki pięć razy z mocą 35% i z 15-sekundowym impulsem, 0,9 sekundy włączeniem i 0,1 sekundy wyłączeniem. Utrzymuj probówki na lodzie po każdej rundzie sonikacji, aby uniknąć podgrzewania próbek.
	<ol>
		<li>Sprawdź ścinanie na żelu DNA, ponieważ skuteczność ścinania będzie się różnić w zależności od różnych sonikatorów. Aby sprawdzić sonikację, odwróć sieciowanie, dodając NaCl do stężenia 0,16 M i wykonaj kroki 1.17.1. - 1.22. Uruchom elucję 10 μl DNA na 1,5% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy ścinanie wynosi od 300 do 700 pz ze średnią intensywnością przy 500 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po sonikacji odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 17 949 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki.
	<ol>
		<li>Wykonaj oszacowanie białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek zgodnie z protokołem producenta. Użyć równej ilości lizatu do ChIP próbek kontrolnych i eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć 1 mg całkowitego lizatu na reakcję ChIP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 50% zawiesinę białka A-agarozy za pomocą buforu FA140 zawierającego koktajl inhibitorów proteazy. Dodaj 1/10 objętości koktajlu inhibitorów proteazy. Oblicz potrzebną objętość koralików na podstawie całkowitej liczby próbek.
	<ol>
		<li>Umyj kulki białkowe A-agarozy buforem FA140 dwukrotnie, aby usunąć bufor do przechowywania i dodaj równą objętość do buforu FA140 do kulek, aby uzyskać 50% zawiesiny.</li>
		<li>Aby usunąć białka, które niespecyficznie wiążą się z kulkami, należy dodać 50 μl 50% zawiesiny białka A-agarozy i inkubować próbki w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją od końca do końca w mieszalniku rożna przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 956 x g w temperaturze 4 °C przez minutę. Zebrać supernatant i przeprowadzić immunoprecypitację, dodając do supernatantu 8 μl przeciwciała H4K16ac lub 5 μl (5 μg) 1 mg/ml SMARCA5 przeciwciała. Inkubować w temperaturze 4 °C O/N ze stałą rotacją od końca do końca w mieszalniku rożenowym.</li>
	<li>Zachowaj 1/10 ekstraktu do kontroli "wejściowej" i odstaw go na bok w temperaturze -20 °C. Dane wejściowe muszą być odwrotnie usieciowane wraz z próbkami IP.</li>
	<li>Użyć równej ilości króliczej IgG (5 μl z 1 mg/ml) jako próbki immunoprecypitacji kontroli ujemnej.</li>
	<li>Następnego dnia dodać 50 μl 50% zawiesiny białkowej A-agarozy do ekstraktu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
	<li>Granulki agarozy osadzać przez odwirowanie przy 956 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant i kolejno przemyć kulki następującymi. W preparatach buforowych należy dodać inhibitory proteazy bezpośrednio przed użyciem.
	<ol>
		<li>Przemyć kompleksowym buforem płuczącym o niskiej zawartości soli (FA140; końcowe stężenie 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.</li>
		<li>Przemywać kompleksowym buforem płuczącym o wysokiej zawartości soli (FA500; końcowe stężenie 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.</li>
		<li>Przemywać buforem płuczącym LiCl Immune Complex (końcowe stężenie 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 i 0,5% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z obrotem od końca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przepłukaniu zgodnie z powyższym opisem dodać 200 μl roztworu elucyjnego (końcowe stężenie 1% SDS i 100 mM wodorowęglanu sodu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją od końca do końca w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować próbki przy 956 x g w temperaturze pokojowej i przenieść eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć krok 1.15 z dodatkowymi 200 μl roztworu elucyjnego.</li>
	<li>Do 400 μl eluatu dodać NaCl do stężenia 0,16 M i dobrze wymieszać.
	<ol>
		<li>Ponadto dodać 400 μl roztworu elucyjnego do 10 μl wejściowego, który został odłożony na bok (krok 1.11) i dodać NaCl do stężenia 0,16 M, aby również odwrócić sieciowanie próbek wejściowych. Odwrotne sieciowanie próbek poprzez inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 5 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 ml 100% EtOH do usieciowanego wstecznie usieciowanego eluatu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C przez 2-3 godziny lub w temperaturze -20 °C O/N. Obracać próbki w temperaturze 17,949 x g przez 15 minut i wyrzucić etanol.</li>
	<li>Dodaj 800 μl 70% etanolu, aby umyć granulki. Wirować w temperaturze 17 949 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić etanol. Krótko zakręć, aby usunąć resztki etanolu. Próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu usunięcia pozostałości etanolu.</li>
	<li>Rozpuścić DNA w 90 μl wody wolnej od RNaz i DNaz i dodać 2 μl 10 mg/ml RNazy w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml. Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 min.</li>
	<li>Dodaj 10 μl 10x bufor proteinazy K (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Dobrze wymieszać i dodać 1 μl proteinazy K. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oczyść DNA wejściowe i ChIP za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta i eluuj DNA w 50 μl wody. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Analiza plam szczelinowych DNA ChIP
<ol>
	<li>Zmierzyć wydajność sygnału wejściowego i DNA ChIP eluowanego w 50 μl wody, jak opisano w kroku 1.22, za pomocą spektrofotometru przy długości fali 280 nm zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Weź równe objętości (50 μl) wejściowego lub immunoprecypitowanego DNA, które mieszczą się w liniowym zakresie wykrywania.
	<ol>
		<li>Na przykład, jeśli wejściowy wynik DNA wynosi 1,5 ng/μl, weź 30 μl (lub 45 ng całkowitego DNA) i zwiększ objętość do 50 μl wodą. W przypadku czynnika ChIP należy pobrać całe 50 μl eluatu z kroku 2.1 i przejść do kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Denaturować 50 μl wejściowego lub immunoprecypitowanego DNA przez dodanie 2,5 objętości 0,4 N NaOH, krótko wirować i wirować przez 956 x g przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Zneutralizować zdenaturowane DNA przez dodanie 175 μl 1 M Tris-HCl o pH 6,8, wirować, odwirowywać przez 956 x g przez 10 sekund i umieścić próbki na lodzie.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenie wejściowego i immunoprecypitowanego DNA do testu Slot Blot, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 2.3 - 2.4, aby uzyskać całkowitą objętość próbki 350 μl (tj. 50 μl wejścia/ChIP DNA, 125 μl 0,4 N NaOH, 175 μl 1 M Tris-HCl, pH 6,8). 
		Uwaga: W powyższym przykładzie 45 ng wejściowego DNA będzie równać się 0,129 ng / μl.</li>
		<li>W przypadku wejściowego DNA oznacz trzy probówki jako 100, 50 i 25 i dodaj 100 μl, 50 μl i 25 μl zdenaturowanej i zneutralizowanej próbki DNA. Uzupełnić końcową objętość do 100 μl wodą wolną od nukleaz. W przypadku DNA ChIP oznacz trzy probówki jako 200, 100 i 50 i dodaj 200 μl, 100 μl i 50 μl zdenaturowanej i zneutralizowanej próbki DNA. Uzupełnić końcową objętość do 200 μl wodą wolną od nukleaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przytnij membranę do rozmiaru aparatu Slot Blot. Wstępnie zwilż membranę i bibułę w 20x SSC przed i przed dodaniem DNA. Zmontuj je w aparacie Slot Blot zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Odpipetować DNA z kroku 2.5.2 do odpowiednich szczelin. Powoli stosuj podciśnienie, aby wciągnąć DNA na membranę sondy zeta. Zatrzymać próżnię, gdy wszystkie próbki przejdą przez aparat.
	<ol>
		<li>Zdemontuj aparat i natychmiast unieruchom DNA na błonie za pomocą środka sieciującego UV. Umieść DNA stroną do góry w sieciowniku UV i użyj ustawienia automatycznego sieciowania w sieciowniku. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj BrdU na plamie szczelinowej, wykonując western blot.
	<ol>
		<li>Zablokuj błonę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBS zawierającym 0,1% Tween-20 (PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z błoną.</li>
		<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-BrdU (rozcieńczenie 1:500) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST i inkubować blot z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Przemyć błonę PBST trzy razy po inkubacji przeciwciał pierwotnych.</li>
		<li>Dodać sprzężone z HRP drugorzędowe przeciwciało przeciw-mysie do blot (rozcieńczenie 1:5 000) i inkubować w RT przez 1 godzinę. Przemyć membranę PBST trzy razy po inkubacji przeciwciał drugorzędowych. 
		UWAGA: Użyj wystarczającej objętości przeciwciał, aby całkowicie pokryć błonę podczas inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę ECL i dodaj ją do blot zgodnie z protokołem producenta. Inkubować błonę z mieszanką ECL przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Umieść membranę w kasecie rentgenowskiej, naświetl membranę na film rentgenowski i wywołaj blot zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Określ ilościowo sygnał uzyskany dla sygnału wejściowego i ChIPed DNA po zeskanowaniu blot za pomocą oprogramowania Image J zgodnie z protokołem producenta. Do oznaczania ilościowego należy użyć sygnału, który znajduje się w liniowym zakresie wykrywania, aby zapewnić dokładność pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

Nie mam konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół opisany w tym manuskrypcie jest stosunkowo szybką metodą wykazania obecności białek lub ich form zmodyfikowanych potranslacyjnie w nowo zreplikowanym lub powstającym DNA. Dodatkowo technika ta pozwala na pomiar kinetyki asocjacyjno-dysocjacyjnej białka lub jego zmodyfikowanej formy z powstającym DNA. Technika ta jest komplementarna z elegancką technologią iPOND13. W technologii iPOND nowo zsyntetyzowane DNA jest znakowane deoksyurydyną etylową (EdU). Koniugat biotyny jest następnie dodawany do EdU za ...

Wadliwa naprawa i/lub replikacja DNA są główną przyczyną niestabilności genomu, która może spowodować śmierć komórki. Pojedyncze nienaprawione pęknięcie podwójnej nici wystarczy, aby spowodować śmierć komórki1. Organizacja chromatyny jest przejściowo zmieniona zarówno podczas replikacji, jak i naprawy2,3, a brak utrzymania informacji epigenetycznej podczas tych procesów spowoduje zagrożenie integralności genomu. Utrata funkcji HDAC3 lub HDAC1,2 utrudnia progresję fazy S, replikację i naprawę DNA, prowadząc do stresu genotoksycznego (uszkodzenia DNA) i śmierci komórki4-9. Jest to zatem praktyczna strategia polegająca na stosowaniu selektywnych inhibitorów HDAC w celu zakłócenia replikacji, naprawy i chromatyny w komórkach nowotworowych oraz spowodowania uszkodzenia DNA, co z kolei może zatrzymać wzrost i selektywnie indukować śmierć komórki w szybko rosnących komórkach rakowych.
Podczas replikacji DNA, chromatyna jest szybko demontowana, a następnie ponownie składana po duplikacji DNA. Nowo zsyntetyzowany histon H4 jest acetylowany przy resztach K5 i K12 (H4K5K12ac), a po osadzeniu na chromatynie są szybko deacetylowane przez deacetylazy histonowe (HDAC)10,11. Niezdolność komórek do utrzymania powstającej integralności chromatyny przez deacetylację histonów może prowadzić do zapadnięcia się wideł, co z kolei może skutkować uszkodzeniem DNA i śmiercią komórki. Niedawno wykazaliśmy, że selektywne hamowanie HDAC1,2 zwiększa acetylację histonów (H4K5ac, H4K12ac i H4K16ac) i hamuje aktywność remodelera chromatyny SMARCA5 powstającą chromatynę, co koreluje ze zmniejszoną progresją widełek replikacyjnych, zwiększonym zapadaniem się widełek i zwiększonym uszkodzeniem DNA wywołanym stresem replikacyjnym6. Tak więc leczenie inhibitorem HDAC może zmienić powstającą strukturę chromatyny, aby bardzo szybko wywołać uszkodzenie DNA i śmierć w komórkach rakowych, ponieważ komórki te szybko się zmieniają i wielokrotnie przechodzą przez fazę S. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób HDAC regulują acetylację histonów i wiązanie białek w celu utrzymania replikacji DNA w komórkach ssaków.
Aby ilościowo zmierzyć ilość acetylacji histonów i SMARCA5 remodelera chromatyny związanego z powstającym DNA podczas replikacji DNA, opracowaliśmy zmodyfikowany test ChIP o nazwie BrdU-ChIP-Slot-Western. Po immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) pożądanej modyfikacji białka lub histonu, ilość powstającego DNA (znakowanego analogiem tymidyny, BrdU) w próbce ChIP można wykryć za pomocą zachodniej analizy DNA ChIP znakowanego BrdU przeniesionego na błonę za pomocą aparatu Slot Blot. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy, że H4K16ac (znak zaangażowany w pakowanie chromatyny) i członek rodziny ISWI SMARCA5 (SWI/SNF-related matrix-associated matrix-dependent regulator chromatyny) remodeler chromatyny są związane z powstającym DNA w komórkach fazy S6. Odkryliśmy również, że powstający znacznik H4K16ac jest deacetylowany przez HDAC1,2 podczas replikacji DNA6. H4K16ac hamuje aktywność remodelera chromatyny członka rodziny ISWI SMARCA512. W związku z tym, korzystając z techniki BrdU-CHIP-Slot-Western, mogliśmy połączyć funkcje HDAC1,2 w regulacji przebudowy chromatyny podczas replikacji DNA. W związku z tym technika BrdU-ChIP-Slot-Western Blot jest potężnym podejściem do ilościowego pomiaru dynamiki asocjacji i dysocjacji białek lub ich modyfikacji potranslacyjnych, które są związane z powstającym DNA.

<table><tbody><tr><td>Anty-BrdU (westerny)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anty-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Aktywny motyw</td><td>anty-H4K16ac</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Zeta-Probe GT</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td></td><td>Fisher BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Białko A agaroza</td><td>Milipor</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika i nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>Film rentgenowski</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&nbsp; Cyfrowy ultradźwiękowy zakłócacz komórek</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp Model: Spektrofotometr 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>ThermoScientific</td> Model: Aparat do klotów <td>1000</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td>Inkubator do hodowli tkankowych <td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Termo Scientific</td><td>Series II 3110 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnym</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie białek związanych z powstającym dna w komórkach ssaków techniką brdu-chip-slot-western

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Deacetylazy histonowe 1 i 2 (HDAC1,2) lokalizują się w miejscach replikacji DNA. W poprzednim badaniu, przy użyciu selektywnego inhibitora i genetycznego systemu knockdown, wykazaliśmy nowe funkcje HDAC1,2 w progresji widełek replikacyjnych i utrzymaniu powstającej chromatyny w komórkach ssaków. Dodatkowo zastosowaliśmy technikę BrdU-ChIP-Slot-Western, która łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) DNA znakowanego bromo-deoksyurydyną (BrdU) z plamą szczelinową i analizami zachodnimi w celu ilościowego pomiaru białek lub modyfikacji histonów związanych z powstającym DNA.
Aktywnie dzielące się komórki zostały potraktowane selektywnym inhibitorem HDAC1,2 lub transfekowane siRNA przeciwko Hdac1 i Hdac2, a następnie nowo zsyntetyzowane DNA zostało oznaczone analogiem tymidyny bromodeoksyurydyną (BrdU). Znakowanie BrdU przeprowadzono w momencie, gdy nie było znaczącego zatrzymania cyklu komórkowego lub apoptozy z powodu utraty funkcji HDAC1,2. Po znakowaniu komórek za pomocą BrdU przeprowadzono immunoprecypitację chromatyny (ChIP) znaczników acetylacji histonów lub remodelera chromatyny za pomocą specyficznych przeciwciał. DNA wejściowe znakowane BrdU i DNA immunoprecypitowane (lub ChIPed) zostały następnie naniesione na błonę przy użyciu techniki plamy szczelinowej i unieruchomione za pomocą promieniowania UV. Ilość powstającego DNA w każdym gnieździe została następnie oceniona ilościowo za pomocą zachodniej analizy z przeciwciałem anty-BrdU. Wpływ utraty funkcji HDAC1,2 na poziomy nowo zsyntetyzowanych znaczników acetylacji histonów związanych z DNA i remodelera chromatyny określono następnie poprzez normalizację sygnału BrdU-ChIP uzyskanego z próbek poddanych działaniu substancji do próbek kontrolnych.

Aby określić swoistość inhibitorów selektywnych dla HDAC1,2, wykorzystano komórki włókniakowraka Hdac1,2FL/FL oraz Hdac3FL/FL. Do usunięcia Hdac1,2 oraz Hdac3 w tych komórkach zastosowano rekombinazę Cre dostarczaną przez adenowirusa (Ad-Cre). Po infekcji komórek Hdac1,2FL/FL za pomocą Ad-Cre zaobserwowano wyraźny wzrost poziomu H4K5ac. Leczenie komórek z knockoutem Hdac1,2 związka...

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie i dokładne zbadanie białek związanych z powstającym DNA przy użyciu znakowania BrdU i wytrącania chromatyny. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji, naprawy chromatyny, takie jak, jakie białka są związane z powstającym DNA podczas replikacji DNA i jakie białka naprawcze są związane z powstającym DNA podczas stresu replikacyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to stosunkowo szybka metoda wykrywania białek związanych z powstającym DNA w sposób wysoce ilościowy.Na początek należy skonfigurować hodowle dwóch milionów komórek NIH 3T3 w 10 mililitrach pożywki z DMSO lub inhibitorami. Należy również dodać BrdU do końcowego stężenia 20 mikromolowych. Po platerowaniu inkubuj komórki przez 60 minut.Po godzinie należy usieciować białka wewnątrzkomórkowe z DNA, dodając formaldehyd bezpośrednio do pożywki hodowlanej do stężenia 1% objętości. Następnie pozwól komórkom inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut z mieszaniem. Po 10 minutach wygasić reakcję, dodając glicynę do pożywki do 125 milimolów i kontynuować inkubację przez kolejne pięć minut.Następnie zbierz komórki w PBS i umyj je dwukrotnie PBS za pomocą wirowania. W razie potrzeby pellet można zamrozić w temperaturze 80 stopni Celsjusza na przechowywanie. Teraz przygotuj lizat z usieciowanych komórek, dodaj 500 mikrolitrów buforu FA140 uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i ścinaj chromatynę za pomocą pięciu 15-sekundowych impulsów sonikacji.Utrzymuj komórki schłodzone między impulsami. Następnie uruchom 10 mikrolitrów próbki na 1,5% żelu, aby zdiagnozować skuteczność ścinania. Po ścięciu próbki należy odwirowywać przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.Następnie należy oszacować stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu. Następnie przygotuj 50% zawiesinę kulek agarozy z białkiem A z buforem FA140 zawierającym inhibitor proteazy. Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny do każdej próbki i inkubować próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją od końca do końca przez 30 minut.Po pół godzinie odwirowywać próbki przez minutę około 1000 g w wirówce z chłodzeniem. Następnie należy zebrać supernatant zawierający znakowaną chromatynę. Zanim przejdziesz dalej, zachowaj 1/10 ekstraktu w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby później służyć jako kontrola wejściowa.Aby immunoprecypitować chromatynę, dodaj do supernatantów osiem mikrolitrów przeciwciała H4K16ac lub pięć mikrogramów SMARCA5 przeciwciała. Należy również dodać pięć mikrogramów szybkiej IgG do ekstraktu, który służy jako ujemna próbka kontrolna. Inkubuj chromatynę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc na mikserze rożna.Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny agarozy 50% Protein A do immunoprecypitacji i inkubuj mieszaniny przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją. Po godzinie osadź kulki agarozy i ostrożnie wyrzuć supernatant. Teraz umyj koraliki, obracając się od końca do końca w temperaturze 4 stopni Celsjusza w trzech sekwencyjnych.Najpierw użyj świeżo przygotowanego buforu do mycia kompleksu odpornościowego o niskiej zawartości soli przez pięć minut. Po drugie, użyj świeżo przygotowanego buforu do mycia kompleksu odpornościowego o wysokiej zawartości soli przez pięć minut. Po trzecie, użyj świeżo przygotowanego buforu do płukania kompleksu immunologicznego chlorku litu przez pięć minut.Po przepłukaniu dodać roztwór elucyjny do próbek, jak opisano w tekście. Odwiruj próbki i przenieś eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Teraz inkubuj próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 5 godzin, aby odwrócić sieciowanie.Później wytrącić DNA. Dodaj jeden mililitr 100% etanolu do próbek i dobrze wymieszaj. Następnie inkubuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin lub przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po wytrąceniu usuń etanol za pomocą 15-minutowej ceintrifugacji w temperaturze 18000 G. Następnie, postępując zgodnie z protokołem tekstowym, umyj osad, potraktuj próbki RNazą, następnie proteinazą K, oczyść DNA zgodnie z opisem w tekście, a na koniec przechowuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Na początek zmierz wydajność danych wejściowych i DNA ChIP na spektrofotometrze.Następnie należy dokonać denaturacji próbek. Dodać 2,5 objętości 0,4 normalnego wodorotlenku sodu, krótko odwirować i odwirować i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie zneutralizuj zdenaturowane DNA, dodając 175 mikrolitrów jednego molowego hydochlorku Tris o pH 6,8.Odwirować, odwirować i umieścić próbki na lodzie. Teraz przygotuj seryjne rozcieńczenia wejściowego i immunoprecypitowanego DNA i przystąp do testu szczelinowego, jak opisano w protokole tekstowym. Po unieruchomieniu DNA na plamie UV wykryj BrdU na plamie szczelinowej za pomocą western blot.Najpierw zablokuj membranę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBST na godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie przygotuj kąpiel z 1% odtłuszczonego mleka w proszku w PBST z dodatkiem 1:500 rozcieńczonego przeciwciała anty-BrdU. Inkubuj blot w tej kąpieli przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na shakerze.Następnie trzykrotnie przemyć membranę PBST. Następnie zanurz blot w rozcieńczeniu 1:5000 sprzężonego z HRP drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego w PBST. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę z potrząsaniem.Użyj trzech płukań z PBST, aby usunąć wtórną i przeanalizować wynik. Zachodnia technika BrdU H4K16ac ChIP slot została wykorzystana do określenia ilości H4K16ac związanego z powstającym DNA. Zaobserwowano silne wzbogacenie w H4K16ac związane z powstającym DNA w porównaniu z szybką kontrolą IgG.Po zahamowaniu HDAC1/2 związkiem 233 zaobserwowano wzrost H4K16ac związanego z powstającym DNA. Ten sam wynik uzyskano przy użyciu związku 898. Na koniec poziom SMARCA5 remodelera chromatyny na powstającym DNA określono za pomocą zachodniej techniki BrdU SMARCA5 ChIP slot.Rzeczywiście, SMARCA5 związane z powstającym DNA i związkiem 898 nie zmieniły poziomów SMARCA5. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć zmiany zachodzące w chromatynie i enzymach modyfikujących chromatynę podczas replikacji DNA w komórkach ssaków. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się replikacją do zbadania zmian chromatyny w powstającym DNA, a także dynamiki białek naprawczych DNA w powstającym DNA.W przyszłości technika ta może być również wykorzystana do badania dynamiki odpowiedzi na uszkodzenie DNA i białek naprawczych DNA w zablokowanym widelcu, a także do badania modyfikacji histonów i enzymów modyfikujących chromatynę w widelcu.

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Ten film opisuje protokół barwienia immunofluorescencyjnego BrdU. Technika ta pozwala na identyfikację komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciał pozwala na szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Barwienie immunofluorescencyjne BrdU: technika identyfikacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Zaburzenia laminopatii często prowadzą do zmian w otoczce jądrowej, co może powodować pęcherzyki jądrowe i wycieki. W badaniu przedstawiono metodę immunofluorescencji do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA), zapewniając środki do oceny struktury i integralności jądra w komórkach ssaków.

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

Poznaj technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia szybką i ilościową analizę interakcji białek z DNA podczas replikacji i naprawy.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Przeglądaj więcej filmów