Name: Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Odkryj metodę monitorowania transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika FRET. Technika ta umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym bez konieczności barwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty startowe ERC (ERC-2011-StG 280255 i ERC-2013-StG 337479) oraz przez Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia (Vidi 91713319).

<ol><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
<li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li>
<li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Stickiness%3A+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo%CC%88rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li>
<li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heteromeric+organic+solute+transporter+%CE%B1-%CE%B2%2C+Ost%CE%B1-Ost%CE%B2%2C+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li>
<li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li>
<li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170(2011).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania nowatorskiego, genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych, zdolnego do monitorowania czasoprzestrzennej dynamiki transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach. Ten bioczujnik składa się z białek fluorescencyjnych ceruleanu i cytrynu, które są połączone z FXR-LBD, tworząc w ten sposób czujnik kwasów żółciowych (BAS) na bazie FRET.
Czujnik kwasu żółciowego jest stosunkowo prosty i wygodny w użyciu, gdy masz podstawowe doświadcz...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) jest szeroko stosowany do lepszego zrozumienia funkcji komórkowych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną1. W FRET energia z wzbudzonego fluoroforu donorowego jest przenoszona do fluoroforu akceptorowego. Wydajność FRET jest silnie zależna od odległości między fluoroforem donorowym a akceptorowym oraz ich orientacji, a zatem jest czułym odczytem zmian konformacyjnych, które wpływają na te dwa fluorofory. Zjawisko to jest wykorzystywane do generowania bioczujników opartych na FRET do obrazowania małych cząsteczek. Zmiany ich stężenia mogą być monitorowane jako wzrosty/spadki stosunku intensywności emisji akceptora do donorowego fluoroforu2. Na przykład bioczujniki wapnia oparte na FRET pozwalają na szybkie i stabilne wykrywanie stężeń wolnego wapnia w żywych komórkach3. Inne zalety bioczujników opartych na FRET to obrazowanie w pojedynczych żywych komórkach, ich nieinwazyjność, zdolność do celowania w różne typy komórek i przedziały komórkowe4.
Wiele aspektów wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych jest nadal słabo poznanych. Na przykład niewiele wiadomo na temat mechanizmu leżącego u podstaw regulacji sprzężonego i niesprzężonego transportu kwasów żółciowych. Istniejące techniki monitorowania tego transportu wykorzystują przede wszystkim reportery na bazie lucyferazy, znakowane radioaktywnie kwasy żółciowe lub fluorescencyjne analogi kwasów żółciowych. To ostatnie wymaga modyfikacji kwasów żółciowych, co może wpłynąć na ich właściwości. Reporterzy bazujący na lucyferazie mają słabą rozdzielczość czasową. Poza tym techniki te powodują utratę próbki i nie mają zastosowania do obrazowania w pojedynczych komórkach. W związku z tym korzystne byłoby stosowanie metod, które umożliwiają obrazowanie na żywo aktywności transportowej pojedynczych komórek za pomocą biosensorów FRET, zwłaszcza, że ma to zaletę detekcji ratiometrycznej 5,6. Podczas gdy warianty CFP/YFP tworzą najczęściej używane pary FRET, nowe strategie wykorzystujące mutacje indukujące samoasocjację mOrange i mCherry doprowadziły do rozszerzenia zestawu narzędzi FRET o nowatorskie czujniki, w tym czujnik kwasów żółciowych z przesunięciem ku czerwieni7.
Poprzednio stworzyliśmy genetycznie kodowany czujnik kwasów żółciowych FRET (BAS), który składa się z donorowego fluoroforu (cerulean) i akceptora fluoroforu (cytryny), które są połączone z domeną wiążącą ligand receptora farnezoidu X (FXR) (FXR-LBD) oraz peptydem zawierającym motywLXXLL 8. Peptyd ten wiąże się z FXR-LBD w sposób zależny od kwasów żółciowych. Po aktywacji FXR odległość między cytrynem a błękitem zmieni się z powodu zmiany konformacyjnej. W liniach komórkowych ssaków aktywacja FXR powoduje wyraźnie wykrywalny wzrost stosunku cytrynu do błękitu, podczas gdy oczyszczony czujnik działa w przeciwnym kierunku i prowadzi do zmniejszenia współczynnika FRET po aktywacji FXR. Czujnik ten (CytoBAS) umożliwia monitorowanie dynamiki cytozolowych kwasów żółciowych. Poprzez dodanie końców karboksylowych subkomórkowych motywów docelowych, konstrukt BAS może być ukierunkowany na jądro (NucleoBAS) i peroksysomy (PeroxiBAS), umożliwiając pomiary stężeń kwasów żółciowych w różnych przedziałach komórkowych. Chociaż dodanie peroksysomalnego motywu celowania nie upośledza jego reakcji na kwasy żółciowe, przepuszczalne dla komórek ligandy FXR nie indukowały żadnych zmian FRET PeroxiBAS wewnątrz peroksysomów8. Ponieważ natura tej rozbieżności jest nieznana, poniższy protokół koncentruje się na CytoBAS i NucleoBAS.
Użycie tego genetycznie kodowanego czujnika FRET zostało niedawno zademonstrowane w komórkach zawierających transportery kwasów żółciowych Na+/taurocholate kotransportujące polipeptyd (NTCP) i transporter organicznych substancji rozpuszczonych alfa/beta (OSTαβ)8. NTCP jest głównym importerem wątrobowych kwasów żółciowych, a OSTαβ jest transporterem kwasów żółciowych w jelicie podstawno-bocznym, który może funkcjonować zarówno jako importer, jak i eksporter, w zależności od elektrochemicznego gradientu stężenia kwasów żółciowych 9,10. Najnowsze dane wykazały, że po transporcie kwasów żółciowych przez NTCP i/lub OSTαβ można zaobserwować silne i szybkie odpowiedzi w stosunku FRET w wyniku interakcji ligand-FXR-LBD.
Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły metod pomiaru FRET, takich jak konfokalna analiza mikroskopowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), podkreślamy kluczowe kroki, rozwiązujemy potencjalne problemy i omawiamy alternatywne metody. Korzystając z tego genetycznie kodowanego czujnika FRET, interakcja kwasów żółciowych z FXR-LBD może być określana ilościowo i monitorowana bezpośrednio w żywych komórkach i zapewnia szybką i prostą metodę wizualizacji transportu i dynamiki kwasów żółciowych w czasie rzeczywistym. Plazmidy ekspresyjne ssaków kodujące CytoBAS i NucleoBAS są dostępne na rynku. W związku z tym ten bioczujnik może jeszcze bardziej przyczynić się do zrozumienia transporterów kwasów żółciowych lub związków, które aktywują FXR i zapewniają głębszy wgląd w biologię i sygnalizację kwasów żółciowych.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagles firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Wysoka glukoza bez L-glutaminy</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td> Kolba do hodowli komórkowych T-175 <td>z powłoką lamininową</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0238</td> Płytka 6-dołkowa <td>z powłoką lamininową</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0229</td> Naczynie <td>10 cm pokryte poli-L-lizyną i laminą</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Powlekane laminą</td></tr><tr><td>Dietyloaminoetylo (DEAE) - Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenimina (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (genetycyna) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder do klonowania (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Pożywka hodowlana Leibovitz</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Polistyren okrągłodenna probówka (5 ml) Probówka Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Bez nakrętki, niesterylne</td></tr><tr><td>Falcon 2 063 probówki (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Zakrętka, sterylna</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe Nunc Lab-Tek 8</td><td>dołków Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Sterylne</td></tr> technologie <tr><td>FBS Life filtrowane węglem drzewnym</td><td></td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Inne chemikalia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na fret

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) stał się potężnym narzędziem do monitorowania fałdowania, interakcji i lokalizacji białek w pojedynczych komórkach. Bioczujniki działające na zasadzie FRET umożliwiły wizualizację w czasie rzeczywistym subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. W tym miejscu opisujemy zastosowanie genetycznie kodowanego czujnika kwasu żółciowego (BAS), który składa się z dwóch fluoroforów połączonych z domeną wiążącą ligand receptora farnesoidu X (FXR-LBD), tworząc w ten sposób czujnik kwasów żółciowych, który może być aktywowany przez dużą liczbę gatunków kwasów żółciowych i innych (syntetycznych) ligandów FXR. Czujnik ten może być ukierunkowany na różne przedziały komórkowe, w tym jądro (NucleoBAS) i cytozol (CytoBAS), w celu lokalnego pomiaru stężenia kwasów żółciowych. Umożliwia szybkie i proste ilościowe określenie napływu komórkowych kwasów żółciowych, wypływu i subkomórkowej dystrybucji endogennych kwasów żółciowych bez konieczności znakowania znacznikami fluorescencyjnymi lub jądrami promieniowymi. Ponadto czujniki BAS FRET mogą być przydatne do monitorowania wiązania ligandów FXR. Na koniec pokazujemy, że ten bioczujnik FRET można łączyć z obrazowaniem innych spektralnie odrębnych fluoroforów. Pozwala to na połączoną analizę wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych oraz i) lokalizacji i/lub obfitości interesujących białek lub ii) sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczej komórce.

Przedstawiony sensor FRET-BAS opiera się na domenie wiążącej ligand receptora FXR (LBD-FXR) połączonej z dwoma fluoroforami (cytryną i ceruleanem) oraz motywem LXXLL. Sensor ten umożliwia badanie transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową (Rysunek 1A). W celu promowania tworzenia kompleksu wewnątrzmolekularnego zastosowano mutacje w ceruleanie i cytrynie (Rysunek <stron...

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania dynamiki kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika BAS FRET. Ten czujnik kwasu żółciowego stanowi unikalne narzędzie do badania (regulacji) transportu kwasów żółciowych i aktywacji FXR w szerokim zakresie typów komórek.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie genetycznie kodowanego czujnika kwasu żółciowego FRET w celu łatwej wizualizacji transportu i dynamiki kwasów żółciowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Czujnik ten może odpowiedzieć na kluczowe pytania metaboliczne, takie jak związek żółci i dynamiki z glukozą, lipidami i metabolizmem energetycznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że transport kwasów żółciowych może być teraz bezpośrednio monitorowany do pojedynczych żywych komórek bez konieczności znakowania kwasów żółciowych.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu i dynamiki komórek i kwasów żółciowych. Może być również stosowany do wizualizacji efektów lub aktywacji i pojedynczych żywych komórek lub do łączenia obrazowania lokalizacji białek i transportu kwasów żółciowych. Genetycznie kodowany czujnik kwasów żółciowych, zwany dalej czujnikiem, składa się z donorowego fluoroforu ceruleanowego i z wyjątkiem fluoroforu cytrynu.Dwa fluorofory są połączone domeną wiążącą ligand jądrowego receptora kwasów żółciowych FXR, połączonego z kofaktorem FXR, peptydem. Dwie zmodyfikowane zmiany aminokwasów w dwóch fluoroforach sprzyjają interakcjom międzycząsteczkowym między cyrulenem a cytrynem. Wykorzystywane są dwie różne konstrukcje przenoszące czujnik.W jednej z konstrukcji czujnik zawiera sygnał lokalizacji jądrowej c-końca, a zatem kumuluje się w jądrze. W drugim konstrukcie czujnik nie ma żadnej sekwencji celowania, a zatem lokalizuje się w cytoplazmie. Poniższy protokół wideo koncentruje się na tym, jak obrazować czujnik w żywych komórkach.Protokół tekstowy opisuje, jak zaprojektować komórki, które wyrażają czujnik i jak dalej analizować je na podstawie faktów. Przygotowując się do obrazowania komórek, należy płytkować komórki, które wyrażają czujnik, o pożądanej gęstości w sterylnym, ośmiodołkowym szkiełku z dnem poślizgu przykrywkowego w kompletnym pożywce hodowlanej. Gdy komórki osiągną 60 t0 70 procent zbiegalności, kontynuuj eksperyment.Komórki, które są przyklejone do szkiełka komorowego, przemyć raz 200 mikrolitrami 1x PBS lub Leibovitz L-15 Culture Medium. Następnie odessać roztwór i zastąpić go 300 mikrolitrami pożywki hodowlanej Leibovitz L-15, aby nie była konieczna kontrola CO2. Jeśli używany jest DMEM z czerwienią fenolową zamiast Leibovitz L-15, zaplanuj śledzenie PH podczas zbierania danych, ponieważ czujnik jest wrażliwy na PH. Następnie należy przygotować rozcieńczenia związków, które mają być użyte w eksperymencie w postaci koncentratów od 3 do 5 razy, w tym GW4064 i TCDCA.Przygotuj się do dodania podwielokrotności od 50 do 100 mikrolitrów podczas obrazowania, tak aby roztwory szybko wymieszały się w komorze szkiełka. Teraz uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopu konfokalnego i włącz laser. Mikroskop musi być wyposażony w obiektyw olejowy o kącie 63x, komorę inkubacyjną o temperaturze 37 stopni Celsjusza oraz fioletowy laser o długości fali 405 nanometrów.Następnie dostosuj ustawienia mikroskopu. Ustaw tryb akwizycji na XYT, aby uzyskać obrazowanie poklatkowe pojedynczej płaszczyzny ogniskowej. Ustaw szybkość akwizycji obrazu na 20-sekundowe interwały, aby można było dodawać związki podczas przerw.Pamiętaj również, aby ustawić zakres spektralny dla wykrywania misji. Skoncentruj się na komórkach za pomocą transoświetlenia. Następnie w kontrolce oprogramowania narysuj okręgi, aby zdefiniować obszary zainteresowania.Wybierz komórki o podobnej intensywności kwitnienia oraz normalnej wielkości i kształcie. Nie zbliżaj się zbytnio do obwodów komórki. Następnie zacznij wykonywać pomiary.Zwróć uwagę na ich wartość i kontynuuj pomiary, aż kwiatostan błękitu i cytrynu ustabilizuje się. Po osiągnięciu stabilności kwitnienia dodaj od 50 do 100 mikrolitrów kwasów żółciowych lub innych związków w wybranych punktach czasowych podczas pomiaru. Podczas pipetowania należy unikać krawędzi komory i powoli dodawać płyn.Prawidłowe wykonanie tego kroku ma kluczowe znaczenie dla eksperymentu. Ponownie, pozwól kwiatostanowi ustabilizować się przed kontynuowaniem. Zakończ eksperyment, ostrożnie dodając 100 mikrolitrów GW4064 do stężenia od pięciu do 10 mikromolowych.Kontynuuj nagrywanie, aż kwiatostan ponownie się ustabilizuje. Następnie zapisz eksperyment i wyeksportuj dane jako plik avi. Otwórz zapisane pliki avi na obrazie J, wybierając wtyczki, stosy, przeplot stosu.Następnie kliknij edytuj, wybierz i dodaj do menedżera, aby otworzyć okno menedżera RLI. Następnie przełącz opcję, pokaż wszystko. Za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnego narysuj kilka ROI, które obejmują określone komórki.Nie zbliżaj się do obwodów komórek, ponieważ komórki prawdopodobnie ulegną pewnemu ogniskowemu dryfowi lub migracji. Narysuj także jeden okrąg w obszarze poza komórkami, aby określić sygnał tła. Można również użyć obszaru wewnątrz komórki, który nie wyraża czujnika.Teraz wybierz jeden ROI i kliknij wtyczki, a następnie profiler proporcji. Pojawią się trzy ekrany. RAW, Ratio i Ratio Profile.Okno RAW pokazuje wzrost intensywności cytrynu jako niebieską linię i spadek intensywności cytrynu jako czerwoną linię, jeśli występuje FRET. Okno proporcji pokazuje informacje o stosunku cytrynu do błękitu, który będzie rósł wraz ze wzrostem FRET. W oknie profilu proporcji wyświetlane są wartości pomiarów intensywności kwitnienia w obu kanałach.Jeśli używane są pliki konfiguracyjne specyficzne dla mikroskopu, kolejność kanałów może wydawać się odwrócona. Teraz skopiuj dane z okna profilu wskaźnika do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy statystycznej. Następnie postępuj zgodnie ze wszystkimi innymi wybranymi zwrotami akcji, a także z roi w tle.Eksperyment ilościowy FRET oparty na intensywności żywych komórek przeprowadzono na komórkach U2OS wykazujących ekspresję czujnika i pozbawionych endogennych transporterów kwasów żółciowych. Komórki poddano działaniu TCDCA. Nie spowodowało to żadnych zmian w FRET.Kiedy komórki były traktowane GW4064, średni stosunek cytrynu do błękitu znacznie wzrósł. Aby zademonstrować, że czujnik może być łączony z innymi białkami, zaprojektowano komórki U2OS współwyrażające czujnik z NTCP i OST alpha-beta. Wykazali oni wyraźny wzrost stosunku cytrynu do cyrynu po dodaniu do TCDCA i GW4064.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować dynamikę kwasów żółciowych za pomocą czujnika kwasów żółciowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny. Procedurę tę można łatwo rozszerzyć, aby uwzględnić więcej informacji obrazowych, takich jak subkomórkowa lokalizacja białka będącego przedmiotem zainteresowania.Pod warunkiem, że długość fali tego białka różni się od czujnika. Aby zapobiec fotowybielaniu, ważne jest, aby czujnik wyrażał komórki w jak największym stopniu w ciemności.

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Ten artykuł pokaże, jak monitorować dynamikę glutaminy w żywych komórkach za pomocą FRET. Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych dla genetycznie kodowanych czujników glutaminy.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Narzędzia do diagnozowania zaburzeń wchłaniania kwasów żółciowych i pomiaru transportu kwasów żółciowych in vivo są ograniczone. Opisano innowacyjne podejście na żywych zwierzętach, które wykorzystuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego protonem (1H) i fluorem (19F); Ta nowatorska metodologia ma potencjał translacyjny w badaniach przesiewowych w kierunku złego wchłaniania kwasów żółciowych w praktyce klinicznej.

Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Aktywacja wielofunkcyjnej kinazy Ser/Thr AURKA jest charakterystyczna dla jej autofosforylacji na Thr288. Sondy fluorescencyjne polegające na FRET mogą rozróżniać między jego stanem nieaktywnym i aktywowanym. Tutaj ilustrujemy niektóre strategie inżynierii sondy, wraz z szybkim protokołem FRET, aby śledzić aktywację kinazy przez cały czas trwania mitozy.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kinazy A zorzy polarnej za pomocą konformacyjnych biosensorów FRET w żywych komórkach

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Ten artykuł opisuje monitorowanie w czasie rzeczywistym ablacji HIFU w wątrobie psa za pomocą obrazowania ultradźwiękowego z dużą liczbą klatek na sekundę przy użyciu obrazowania fal dywercyjnych i płaskich. Obrazowanie ruchu harmonicznego dla zogniskowanych ultradźwięków służy do obrazowania zmniejszenia przemieszczenia wywołanego siłą promieniowania akustycznego w obszarze poddanym ablacji.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym ablacji zogniskowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności (HIFU) wątroby psów in vitro przy użyciu obrazowania ruchu harmonicznego dla zogniskowanych ultradźwięków (HMIFU)

Odkryj metodę monitorowania transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika FRET. Technika ta umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym bez konieczności barwienia.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

Przeglądaj więcej filmów