Name: Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę CLARITY/CUBIC do obrazowania włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy. Technika ta umożliwia analizę trójwymiarowej struktury włóknerw w miejscu ich występowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), grant projektu NHMRC (#1086643). Prof. George Paxinos jest wspierany przez Senior Principal Research Fellow NHMRC grant (#1043626).

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (ACEC) na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii (zatwierdzony numer ACEC to 14/94A).
1. Przygotowanie przezroczystego rdzenia kręgowego myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie lodowatego roztworu hydrożelu
	<ol>
		<li>Przygotowanie 16% roztworu paraformaldehydu (PFA)
		<ol>
			<li>Dodać 16 g proszku paraformaldehydu do 70 ml wstępnie podgrzanej wody destylowanej (50-55 °C) i mieszać na rozgrzanym mieszadle magnetycznym, aż do rozpuszczenia paraformaldehydu. Uwaga: Nie dopuścić do nagrzania roztworu powyżej 55 °C i należy pamiętać, że paraformaldehyd jest toksyczny.</li>
			<li>Przenieść roztwór paraformaldehydu do cylindra i dodać wodę destylowaną do 100 ml. Schłodzić roztwór paraformaldehydu w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozpuścić 125 mg inicjatora VA-044 w 26,25 ml wody destylowanej i schłodzić roztwór w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Chłodny 5 ml roztworu akrylamidu (40%), 1,25 ml roztworu Bis (2%) (UWAGA: roztwory Bis i akrylamidu są toksyczne, mogą powodować wady genetyczne lub raka), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% roztworu PFA i roztwór inicjatora VA-044 na lodzie.</li>
		<li>Wymieszaj powyższe roztwory z lodem. 
		Uwaga: całkowita objętość wynosi 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja i pobranie rdzenia kręgowego myszy
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 mg/kg) i ksyliny (5 mg/kg) rozcieńczonych w 0,9% soli fizjologicznej. Dawka dla myszy może być niższa niż dla szczurów.</li>
		<li>Na odpowiedniej plastikowej powierzchni w dygestorii przymocuj kończyny myszy z dala od ciała (skuteczna jest taśma klejąca), gdy mysz nie zareaguje na uszczypnięcie skóry stopy.</li>
		<li>Przetnij skórę myszy na klatce piersiowej, a następnie na kościstej klatce piersiowej, aby odsłonić serce nożyczkami.</li>
		<li>Za pomocą pompy perystaltycznej, z igłą o sile 25 G przymocowaną do końca rurki, włóż igłę do lewej komory serca, odetnij prawy przedsionek, aby stworzyć punkt wyjścia krwi, a następnie rozpocznij płukanie 40 ml 0,9% soli fizjologicznej z szybkością około 10 ml/min.</li>
		<li>Po zakończeniu przelej mysz 35 ml lodowatego roztworu hydrożelu. 
		Uwaga: perfuzja z prędkością 10 ml/min, aby uniknąć obrzęku tkanki nerwowej.</li>
		<li>Naciąć skórę na plecach ostrzem, a następnie usuń mięśnie obok kręgowca. Po przecięciu łuków kręgowych z jednej strony i odwróceniu ich na drugą stronę, wyjmij rdzeń kręgowy z kręgosłupa za pomocą cienkich nożyczek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie rdzenia kręgowego myszy
	<ol>
		<li>Umieścić rdzeń kręgowy w 15 ml roztworu hydrożelu na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć 10 ml roztworu hydrożelu i wlać resztę roztworu wraz z segmentami rdzenia kręgowego do probówki o pojemności 5 ml. Napełnij probówkę o pojemności 5 ml roztworem hydrożelu, aż do całkowitego napełnienia.</li>
		<li>Rozciągnąć mały kawałek parafilmu na górnej części probówki o pojemności 5 ml, a następnie owinąć parafilm wokół szyjki probówki. Uwaga: Upewnij się, że parafilm styka się z roztworem hydrożelu i że między roztworem hydrożelu a parafilmem nie ma pęcherzyków.</li>
		<li>Wstaw probówkę o pojemności 5 ml na noc do piekarnika o temperaturze 37 °C. Obserwuj roztwór hydrożelu, aż stanie się żelem.</li>
		<li>Wyjmij probówkę o pojemności 5 ml z piekarnika i usuń żel z probówki za pomocą klucza (takiego jak łopatka do pipety o pojemności 1 ml). Usuń żel z tkanki rdzenia kręgowego, przyklejając grubą tkankę do żelu, a następnie usuń grubą tkankę (żel przyklei się do tkanki i dlatego zostanie usunięty przez tkankę).</li>
		<li>Po usunięciu żelu z tkanki rdzenia kręgowego, przemyj rdzeń kręgowy 4 razy 1x PBS (pH 7,4) przez 24 godziny na shakerze.</li>
		<li>Przygotować CUBIC roztwór czyszczący, rozpuszczając 3,85 g mocznika i 3,85 g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy w 5,38 ml wody destylowanej. 
		Uwaga: Używane jest gorące mieszadło. Dodać 2,31 g eteru mono-p-izooktylofenylowego glikolu polietylenowego/Triton X-100 do roztworu, gdy będzie klarowny i ostygnie do temperatury pokojowej. 
		Uwaga: 10 g tych trzech substancji chemicznych jest przeznaczone dla jednej myszy.</li>
		<li>Przeciąć rdzeń kręgowy myszy na segmenty o długości 2-3 mm za pomocą żyletki i umieścić je w 5 ml powyższego roztworu czyszczącego CUBIC. Umieścić na shakerze w piekarniku w temperaturze 37 °C na 3 dni.</li>
		<li>Trzy dni później zmień roztwór czyszczący na nowy. Uwaga: powyższy roztwór przygotowuje się przed użyciem.</li>
		<li>Dwa do trzech dni później, po odświeżeniu roztworu czyszczącego CUBIC, sprawdź przezroczystość chusteczki na papierze z czcionką 8 liter. Jeśli jest przezroczysty, litery można zobaczyć przez oczyszczoną tkankę. Usuń roztwór klarujący i dodaj 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), aby przemyć tkankę 4 razy dziennie (co 6 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Segmenty rdzenia kręgowego inkubować w roztworze przeciwciała pierwotnego (antyserotonina, hodowana u królika, rozcieńczana w stosunku 1:100 w PBST) przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała i dodać 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) w celu przemycia segmentów rdzenia kręgowego 4 razy dziennie (co 6 godzin) w suszarce o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór PBST i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała (594 sprzężone kozie przeciwciała anty-królicze IgG, rozcieńczone w stosunku 1:100 w PBST) w celu inkubacji tkanki przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i dodać 4 ml PBST w celu przemycia segmentów rdzenia kręgowego 4 razy dziennie (co 6 godzin) na wytrząsarce w suszarce o temperaturze 37 °C. Następnego dnia tkanka jest gotowa do obrazowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Usuń roztwór PBST i dodaj 4 ml 85% glicerolu, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanki.</li>
	<li>Sprawdź przejrzystość tkanki. Gdy będzie czysty w ciągu około 1 godziny, umieść tkankę na dużym, cienkim szkiełku podstawowym, które pasuje do ramy mocującej mikroskopu wielofluorescencyjnego.</li>
	<li>Umieść kilka kropli 85% glicerolu obok tkanki rdzenia kręgowego i nakryj ją szkiełkiem nakrywkowym 22 x 50mm2. 
	Uwaga: Orientacja rdzenia kręgowego decyduje o tym, jak wygląda obraz.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko na ramie mocującej wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła.</li>
	<li>Wybierz linię lasera Helium Neon 594 nm i dostosuj intensywność lasera do optymalnego poziomu, sprawdzając jasność sygnału dodatniego w obrazie na żywo.</li>
	<li>Wybierz obszar skanowania tkanki rdzenia kręgowego za pomocą obiektywu 20X (w wodzie, NA 0,7) i przygotuj się do utworzenia stosu z, a głębokość każdego kroku ustaw na 3 μm.</li>
	<li>Zeskanuj tkankę od góry do dołu stosu z odpowiednio pod obiektywem 20X, a następnie obiektywem 63X (w oleju, NA 1,4) (rozmiar kroku wynosił 1 μm). Rekonstrukcja filmów 3D za pomocą oprogramowania3D 28.</li>
</ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół pokazuje, jak obrazować włókna serotoninergiczne w rdzeniu kręgowym myszy za pomocą połączonych technik CLARITY i CABIC. Wprowadza szybszy proces rozliczania w porównaniu z pasywnym protokołem rozliczeń opracowanym przez Cheunga i wsp.14 oraz Tomer i wsp.15 i pozwala na dobre podparcie tkanki rdzenia kręgowego przez hydrożel podczas oczyszczania.
Ważny krok podczas stabilizacji rdzenia kręgowego myszy, jak donoszą Cheung i wsp.<...

Projekcje nadrdzeniowe są odpowiedzialne za modulację różnych zachowań, takich jak percepcja bólu. Jedna z wypustek przenoszących informację nocyceptywną zawiera włókna serotoninergiczne, które wywodzą się ze szwu tyłomózgowiowego i przyległych jąder siatkowatych1,2. Badania fizjologiczne i farmakologiczne wykazały zwiększone uwalnianie serotoniny w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego po elektrycznej stymulacji jąder szwu w tyłomózgowiu3-5. U szczurów i oposów serotoninergiczne włókna szwiordzeniowe mają gęste zakończenia, nie tylko w rogu grzbietowym6-8, ale także w strefie pośredniej7,9,10, rogu brzusznego7,11, a nawet blaszki 1012,13. Nie ma podobnych badań na myszach. Niniejsze badania miały na celu odwzorowanie wzorca zakończenia włókien serotoninergowych powstających z jąder szwu tyłomózgowiowego i przylegających do nich jąder siatkowatych w rdzeniu kręgowym myszy przy użyciu niedawno opublikowanej metody CLARITY14 i jej modyfikacji - CUBIC15. 
Konwencjonalna immunohistochemia fluorescencji lub peroksydazy rdzenia kręgowego wyraźnie pokazuje rozkład włókien serotoninergowych w istocie szarej rdzenia kręgowego w przekrojach o grubości 30-40 μm. Podejście to nie wykazuje jednak ciągłości szlaków włókien serotoninergicznych w istocie białej i ich zabezpieczeń w istocie szarej. Chociaż rekonstrukcja 3D skrawków histologicznych poszerzyła naszą wiedzę na temat dróg włóknistych, nadal wyzwaniem dla histologów i anatomów jest śledzenie pojedynczego odcinka ze względu na niewielkie zniekształcenia w tkance spowodowane cięciem. Aby obejść tę przeszkodę, wielu badaczy opracowało różne protokoły uczynienia całej struktury tkanki przezroczystą i zebrania obrazu niezmienionej tkanki w jednym pliku wideo17-21. Jak dotąd, najbardziej skuteczna jest przezroczysta, wymieniana lipidami, sztywna hybrydyzacja akrylamidu, kompatybilna z obrazowaniem / barwieniem immunologicznym, technika hydrożelu tkankowego (CLARITY), opracowana przez grupę Deisserotha14,15, a także CUBIC, opracowana przez Susaki iwsp. 16. Od czasu opublikowania protokołów wielu badaczy zaczęło używać tych technik do badania różnych aspektów tkanek biologicznych, w tym nie tylko mózgu22-25, ale także serca, nerek, jelit i płuc26,27. 
Poprzez utrwalenie rdzenia kręgowego myszy roztworem hydrożelu (CLARITY) i oczyszczenie odczynnikami CUBIC (co jest znacznie szybszą metodą niż ta opisana w oryginalnym protokole CLARITY14,15), blok tkanki rdzenia kręgowego o długości 2-3 mm został usunięty w ciągu dwóch tygodni, a barwienie immunofluorescencyjne dla serotoniny zakończyło się w ciągu ośmiu dni. Wystarczy kombinacja środków chemicznych, aby konwencjonalna immunohistochemia mogła być wykorzystana do stworzenia obrazu poszczególnych odcinków włókien w pliku wideo 3D w ciągu około jednego miesiąca.

<table><tbody><tr><td>Fotoinicjator VA044</td><td>Wako</td><td>VA-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% roztwór Bis Bio</td><td>Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879C-4D63-BA0B-82556A0CCF1D</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiamina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>przeciwciało serotoninowe</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>mikroskop wielofotonowy</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką clarity/cubic

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Długie włókna zstępujące do rdzenia kręgowego są niezbędne do poruszania się, odczuwania bólu i innych zachowań. Wzorzec zakończenia włókien w rdzeniu kręgowym większości tych systemów światłowodowych nie został dokładnie zbadany u żadnego gatunku. Włókna serotoninergiczne, które wystają do rdzenia kręgowego, badano u szczurów i oposów na odcinkach histologicznych, a ich znaczenie funkcjonalne wydedukowano na podstawie wzorca zakończenia włókien w rdzeniu kręgowym. Dzięki opracowaniu technik CLARITY i CUBIC możliwe jest zbadanie tego układu włókien i jego rozmieszczenia w rdzeniu kręgowym, co prawdopodobnie ujawni nieznane wcześniej cechy serotoninergicznych ścieżek nadrdzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy przy użyciu połączonych technik CLARITY i CUBIC. Metoda polega na perfuzji myszy roztworem hydrożelu i klarowaniu tkanki za pomocą kombinacji odczynników czyszczących. Tkanka rdzenia kręgowego została usunięta w niecałe dwa tygodnie, a późniejsze barwienie immunofluorescencyjne serotoniny zostało zakończone w mniej niż dziesięć dni. Za pomocą wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego tkankę zeskanowano, a obraz 3D zrekonstruowano za pomocą oprogramowania Osirix.

W tej sekcji przedstawiono wyniki barwienia przeciwciałem przeciwko serotoninie w przezroczystym rdzeniu kręgowym myszy, z zastosowaniem kombinacji protokołów CLARITY i CUBIC. Wykazujemy, że włókna serotonergiczne występują we wszystkich blaszkach rdzenia kręgowego, z przewagą w części brzusznej rogu przedniego (Rycina 1, patrz także Wideo 1). Tkanka kontrolna nie wykazała obecności włókien dodatnich (wynik nie został przedstawiony). W rogu przednim, gęst...

Projekcje nadrdzeniowe są ważne dla percepcji bólu i innych zachowań, a włókna serotoninergiczne są jednym z tych systemów włókien. Niniejsze badanie koncentrowało się na zastosowaniu połączonego protokołu CLARITY/CUBIC do rdzenia kręgowego myszy w celu zbadania zakończenia tych włókien serotoninergicznych.

Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu z wykorzystaniem metod CLARITY/CUBIC jest ujawnienie trójwymiarowych cech włókien serotonergicznych w rdzeniu kręgowym myszy, których nie można zaobserwować za pomocą tradycyjnej histologii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroanatomii, takie jak: w jaki sposób włókna serotonergiczne są rozłożone w całym rdzeniu kręgowym? Głównymi zaletami tej techniki są możliwość obserwacji włókien serotonergicznych in situ oraz identyfikacja wektorów, których nie da się dostrzec przy użyciu tradycyjnej histologii.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat organizacji ośrodkowego układu nerwowego, może być ona również zastosowana w innych układach, takich jak układ sercowo-naczyniowy. Po raz pierwszy postanowiliśmy wykorzystać tę metodę, gdy napotkaliśmy ograniczenia w stosowaniu tradycyjnej metody śledzenia (tracingu) podczas analizy włókien serotonergicznych w rdzeniu kręgowym myszy. Rozpocznij od przymocowania kończyn znieczulonej myszy do plastikowej podstawy sekcyjnej w dygestorium.Potwierdź brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy i za pomocą nożyczek rozetnij skórę nad klatką piersiową. Następnie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce i wprowadź igłę o rozmiarze 25 G, podłączoną do drenu pompy perystaltycznej, do lewej komory. Przetnij prawy przedsionek, aby stworzyć punkt odpływu krwi.Następnie wypłucz serce 40 mililitrami 9% soli fizjologicznej z prędkością około 10 mililitrów na minutę. Po całkowitym wypłukaniu krwi, przeprowadź perfuzję zwierzęcia za pomocą 35 mililitrów świeżo przygotowanego, lodowatego hydrożelu z tą samą prędkością perfuzji. Następnie nacinaj skórę na grzbiecie myszy i rozchyl mięśnie przylegające do kręgosłupa.Po przecięciu łuków kręgowych po jednej stronie i ich odchyleniu na drugą, wyciąć rdzeń kręgowy z kolumny kręgosłupa za pomocą precyzyjnych nożyczek. Niezwłocznie po pobraniu umieścić rdzeń kręgowy w 15 ml świeżo przygotowanego roztworu hydrożelu na noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia odlać 10 ml hydrożelu, a pozostałą część roztworu wraz z rdzeniem kręgowym przelać do probówki o pojemności 5 ml.Dolewaj świeżego roztworu hydrożelu, aż probówka zostanie wypełniona, a następnie naciągnij mały kawałek parafilmu na wierzch probówki, dbając o to, aby parafilm stykał się z hydrożelem i aby między roztworem a folią nie pozostały pęcherzyki powietrza. Usunięcie powietrza z probówki jest najtrudniejszym etapem. Aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków, należy powoli napełniać probówkę roztworem hydrożelu, a następnie ostrożnie nałożyć parafilm na górną część probówki, uważając, aby nie rozlać żelu.Następnie owiń szyjkę probówki drugim kawałkiem parafilmu i inkubuj rdzeń kręgowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc. Gdy roztwór hydrożelu ulegnie żelowaniu, użyj klucza, aby usunąć żel i tkankę nerwową z probówki. Aby usunąć hydrożel z rdzenia kręgowego, przyciśnij krótko do żelu chłonny papier do tkanek.Żel będzie odklejał się od tkanki podczas jej usuwania. Gdy rdzeń kręgowy będzie czysty, należy umieścić go w PBS i płukać przez cztery okresy po sześć godzin na wytrząsarce. Po 24 godzinach, za pomocą żyletki, należy pociąć rdzeń kręgowy w płaszczyźnie czołowej na segmenty o długości od dwóch do trzech milimetrów i przenieść fragmenty tkanki do 5 ml świeżo przygotowanego roztworu przejaśniającego CUBIC.Wstrząsaj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, a następnie wymień trzydniowy roztwór przejaśniający na świeżo przygotowany roztwór przejaśniający. Po dwóch do trzech dniach sprawdź przezroczystość tkanki, przykładając ją do papieru z tekstem pisanym czcionką o rozmiarze 8. Gdy litery staną się widoczne przez przejaśnioną tkankę, zastąp roztwór przejaśniający CUBIC czterema mililitrami świeżego PBST i przeprowadź cztery sześciogodzinne płukania.Aby przeprowadzić barwienie segmentów rdzenia kręgowego do obrazowania fluorescencyjnego, inkubuj tkankę w odpowiednim roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez trzy dni na wytrząsarce w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi, zanurz tkankę w 4 mL PBST w celu przeprowadzenia czterech sześciogodzinnych przemyć w temperaturze 37 °C. Następnie zastąp PBST odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych i inkubuj przez kolejne trzy dni na wytrząsarce w temperaturze 37 °C.Czwartego dnia wypłukać niezwiązane przeciwciało wtórne za pomocą PBST, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Aby obrazować segmenty, ostatnie płukanie PBST zastąpić czterema mililitrami 85 procent glicerolu w celu wyrównania współczynnika załamania światła tkanki. Po około godzinie sprawdzić przezroczystość tkanki.Gdy tkanka stanie się przezroczysta, przenieś segmenty rdzenia kręgowego na duże, cienkie szkiełko przedmiotowe. Następnie nanieś kilka kropli 85% glicerolu obok tkanki rdzenia kręgowego i przykryj ją szkiełkiem nakrywnym o wymiarach 22 by 50 mm. Umieść szkiełko w uchwycie mikroskopu i przesuń tkankę w pole widzenia światła.Następnie wybierz laser helowo-neonowy i sprawdź jasność sygnału dodatniego w obrazie na żywo, aby dostosować intensywność lasera. Przy optymalnej intensywności lasera użyj obiektywu 20x, aby wybrać obszar skanowania tkanki rdzenia kręgowego. Następnie ustaw urządzenie tak, aby utworzyć stos obrazów (z-stack), przy czym głębokość każdego poziomu stosu powinna wynosić 3 µm.Na koniec przeskanuj tkankę od góry do dołu stosu z, najpierw przy użyciu obiektywu 20x, a następnie wykonaj skan stosu z przy użyciu obiektywu 63x. Następnie można wykorzystać oprogramowanie 3D do zrekonstruowania odpowiednich filmów 3D. W tym miejscu można zaobserwować obecność włókien serotonergicznych we wszystkich blaszkach rdzenia kręgowego, z przewagą w części brzusznej rogu przedniego.W rogu przednim, w obszarze przyśrodkowym, występują gęsto upakowane włókna serotonergiczne, które rozciągają się w kierunku części bocznej rogu przedniego, przy czym niektóre z włókien immunopozytywnych biegną również z rogu przedniego w stronę rogu tylnego lub kanału centralnego. Włókna immunopozytywne są obecne we wszystkich blaszkach rogu tylnego, jednak występuje niewielka przerwa między włóknami pozytywnymi w blaszkach drugiej i czwartej, szczególnie w bocznej części rogu tylnego. W przekroju poziomym można zaobserwować, że gęsto upakowane włókna serotonergiczne w rogu przednim, biegnące wzdłuż osi podłużnej rdzenia kręgowego, regularnie wypuszczają odgałęzienia wzdłuż osi prostopadłej do pęczka włókien.Gałęzie te rozgałęziają się dalej wzdłuż swoich dróg w kierunku bocznej części rogu brzusznego. W porównaniu z nimi, rozgałęzienia biegnące w stronę linii środkowej są bardziej nieregularne i mniejsze. Przy użyciu obiektywu 63x obserwuje się, że włókna serotonergiczne w rogu grzbietowym przebiegają wzdłuż osi rdzenia kręgowego i kończą się w różnych punktach na drodze traktu, przy czym grube włókna są rozproszone sporadycznie wśród włókien cienkich.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż trzy tygodnie, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne badania, takie jak podwójne znakowanie przeciwciałami przeciwko acetylocholinotransferazie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, czy włókna serotonergiczne kończą się na neuronach ruchowych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie obrazowania biomedycznego do eksploracji złożonych relacji przestrzennych między różnymi typami komórek w preparatach zwierzęcych lub tkankach ludzkich.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić klarowanie tkanki rdzenia kręgowego myszy do obrazowania 3D po barwieniu immunofluorescencyjnym.

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.

Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.

Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną

Poznaj metodę CLARITY/CUBIC do obrazowania włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy. Technika ta umożliwia analizę trójwymiarowej struktury włóknerw w miejscu ich występowania.

Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC

Przeglądaj więcej filmów