Procedura rejestracji poligraficznej do pomiaru snu u myszy
25 stycznia 2016
Zapis elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) u swobodnie zachowujących się myszy jest kluczowym krokiem do skorelowania zachowania i fizjologii ze snem i czuwaniem. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny zapewnia przewodowy system do pozyskiwania zapisów EEG i EMG u myszy.
Ogólnym celem tej procedury rejestracji poligraficznej jest określenie stanu czujności myszy i zmierzenie czasu spędzonego w stanie czuwania, snu z szybkimi ruchami gałek ocznych lub snu bez szybkich ruchów gałek ocznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w prawie każdej dziedzinie neuronauki, która stara się skorelować zachowanie i fizjologię z aktywnością neuronów korowych u zachowujących się zwierząt. Główną zaletą tej techniki jest to, że może rejestrować wiele węzłów, elektroencefalogram i elektromiogram oraz może być łączona z innymi implantami mózgu, takimi jak włókna światłowodowe i kaniule infuzyjne.
Wizualna demonstracja tej metody jest bardzo ważna, ponieważ implantacja elektrody musi być wykonana prawidłowo, a jakość elektrody jest niezwykle krytyczna dla oceny stanów fizycznych. Procedurę zademonstruje Yohko Takata, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
Gdy potwierdzisz, że mysz jest znieczulona przez uszczypnięcie palca u nogi, zgol włosy na głowie i szyi. Następnie przymocuj dom do ramy stereotaktycznej i przymocuj głowę między dwoma nausznikami. Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
Kontynuuj oczyszczanie ogolonej skóry peelingami na bazie alkoholu i jodu. Następnie przetnij wzdłuż linii środkowej skalpelem, aby odsłonić czaszkę i przymocuj skórę z boku za pomocą klipsów, aby utrzymać otwarte pole operacyjne. Za pomocą frezu z węglików spiekanych z wiertłem 0,8 milimetra wykonaj dwa otwory.
Umieść jeden otwór nad czołową częścią kory mózgowej. Umieść drugi otwór nad obszarem ciemieniowym prawej półkuli. Następnie za pomocą śrubokręta jubilerskiego wkręć w otwory rejestrujące EEG ze stali nierdzewnej.
Wkręć za pomocą zaledwie dwóch do dwóch i pół obrotu, aby uzyskać znieczulenie zewnątrzoponowe nad korą. nie powinny się poruszać po włożeniu. To bardzo ważne.
Teraz przymocuj zespół elektrod kołkami do góry do czaszki. Elektrody muszą być przymocowane prosto. Użyj bawełnianego wacika, aby zabezpieczyć pozycję elektrody i przyklej elektrodę za pomocą cyjanoakrylanu, a następnie cementu dentystycznego.
Następnie wykonaj małe otwory w mięśniu czworobocznym i włóż do nich elektrodę EMG. Następnie zszyj skórę jedwabną nicią o średnicy 0,1 milimetra. Teraz wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją na poduszce grzewczej.
Podać myszy dootrzewnowe wstrzyknięcia ampicyliny i meloksykamu i monitorować mysz aż do odzyskania pozycji mostkowej. Następnie trzymaj mysz w spokoju. Tydzień po wszczepieniu elektrod przenieś mysz do eksperymentalnej klatki w dźwiękoszczelnej komorze nagraniowej.
Przymocuj zespół elektrody EEG/EMG w myszy do nagrywającego podłączonego do pierścienia ślizgowego. Podłącz konwertera AD do filtra sygnału EEG/EMG amplifier podłączony do pierścienia ślizgowego. Użyj konwertera AD, aby przekonwertować sygnał na sygnał cyfrowy 128 Hz, a na koniec nagrać sygnał do komputera.
Przyzwyczaj mysz do dwóch do trzech dni w komorze nagraniowej. Jeśli zapis EEG/EMG obejmuje podawanie leków, delikatnie dotykaj myszy każdego dnia, tak jak w tych, w których podawano lek. Następnie uruchom oprogramowanie do rejestracji EEG/EMG.
Aby rozpocząć, kliknij kartę Informacje o pliku danych i kliknij pole obok nazwy pliku. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz. Następnie z zakładki Warunek zapisu wybierz wszystkie kanały EEG/EMG, które mają być rejestrowane.
Wybierz również opcję Częstotliwość próbkowania na tej karcie. Teraz w zakładce Informacje o kanale sprawdź, czy wybrane kanały są wyświetlane poprawnie. Po potwierdzeniu rozpocznij nagrywanie, wybierając najpierw zakładkę Ustawienia timera.
Następnie kliknij monitor, aby wyświetlić EEG i EMG. Jeśli sygnały są wyświetlane poprawnie, ustaw czas rozpoczęcia i zakończenia nagrania w obszarze Zegar główny. Następnie kliknij przycisk Monitor, aby rozpocząć nagrywanie.
Teraz rejestruj sygnały w warunkach wyjściowych i różnych warunkach leczenia przez kilka dni. Po zakończeniu eksperymentu poddaj mysz eutanazji pentobarbitalem. Uruchom oprogramowanie do analizy EEG/EMG.
Otwórz surowe dane EEG/EMG, które są plikiem KCD. Kliknij kartę Uśpienie i ustaw czas epoki na 10 sekund. Następnie wybierz Multi-screening, aby automatycznie ocenić wszystkie dziesięć drugich epok w trzech etapach na podstawie amplitud EEG i EMG oraz na podstawie analizy widma mocy EEG.
Następnie kliknij na zakładkę Warunek FFT dla EEG. Tam ustaw parametry do analizy spektralnej mocy. Użyj 256 punktów odniesienia odpowiadających co dwie sekundy EEG, użyj funkcji okna hamminga i użyj średnio pięciu widm na epokę.
Następnie kliknij przycisk OK.Teraz kliknij przycisk Rozpocznij klasyfikowanie, aby rozpocząć automatyczne sprawdzanie. Następnie otwórz zapisane dane, które są zapisane w formacie pliku RAF i sprawdź wyniki automatycznego sprawdzania. W razie potrzeby popraw wyniki, jeśli nie spełniają standardowych kryteriów.
Aby dokonać korekty, kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy na nieprawidłowo punktowanej epoce i przeciągnij kursor po ciągu błędnie punktowanych epok. Zwolnij lewy przycisk myszy i wybierz prawidłowy stan zachowania w wyskakującym okienku. W warunkach wyjściowych myszy wykazywały wyraźny rytm dobowy snu i czuwania zgodny z ich nocnym charakterem.
Podczas 12-godzinnego okresu świetlnego myszy spędzały średnio 6,7 godziny snu NREM i 0,9 godziny snu REM. Natomiast podczas 12-godzinnego okresu ciemności dominowała czuwanie. Zarejestrowano również inne pomiary.
Obejmowały one rozkład epok snu, ich średni czas trwania i przejścia fazowe dla każdego stanu czujności. Widma mocy EEG dla snu NREM i REM wykazują silną gęstość mocy EEG w zakresie częstotliwości od 0,5 do czterech herców dla snu NREM w porównaniu z gęstością mocy od sześciu do 10 herców dla snu REM. Aby ocenić wpływ kofeiny na sen, myszy C57 Black 6 podawano nośnikiem jednego dnia i kofeiną następnego dnia.
Dootrzewnowe zastrzyki kofeiny podawano na początku cyklu świetlnego. Zgodnie z oczekiwaniami, nagranie ujawniło, że kofeina zwiększyła ilość czuwania u myszy. Trzykrotne zwiększenie stanu czuwania nastąpiło przez trzy godziny po wstrzyknięciu.
Po opanowaniu zabieg implantacji elektrody można wykonać w mniej niż 20 minut. Ocena i korekta danych EEG przez okres 24 godzin może być wykonana w około 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować zapis elektroencefalogramu i elektromiogramu u myszy oraz jak ocenić, czy i jak długo zwierzę nie śpi lub śpi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę zapisu poligraficznego służącą do oceny stanu czuwania u swobodnie poruszających się myszy za pomocą pomiarów EEG i EMG. Metoda ta pozwala badaczom na korelację zachowania i fizjologii ze stanami snu, dostarczając informacji na temat aktywności neuronów korowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Analiza behawioralna
Wprowadzenie
- Rejestracja elektroencefalograficzna (EEG) i elektromiograficzna (EMG) są niezbędne do badania snu i czuwania.
- Technikę tę można łączyć z innymi implantami mózgowymi w celu kompleksowego gromadzenia danych.
- Prawidłowa implantacja elektrod jest kluczowa dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Demonstracje wizualne ułatwiają zrozumienie procedury chirurgicznej.
Cel badania
- Określenie stanu czuwania u myszy.
- Pomiar czasu spędzonego w różnych stanach snu.
- Korelacja danych fizjologicznych z obserwacjami behawioralnymi.
Zastosowane metody
- Poligraficzne rejestrowanie EEG i EMG u myszy.
- Wykorzystanie systemu opartego na kablach do akwizycji danych.
- Chirurgiczna implantacja elektrod w warunkach sterylnych.
- Wizualna demonstracja procedury implantacji.
Główne wyniki
- Pomyślna rejestracja wielu sygnałów fizjologicznych.
- Możliwość oceny snu i czuwania u myszy w stanie swobodnego zachowania.
- Możliwa jest integracja z innymi układami eksperymentalnymi.
- Jakość umiejscowienia elektrod ma istotny wpływ na dokładność danych.
Wnioski
- Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia zależności między zachowaniem a fizjologią.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań w różnych dziedzinach neuronauki.
- Właściwa technika i odpowiedni sprzęt są niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena stanów czuwania i snu w modelach przedklinicznych jest niezbędna do minimalizacji ryzyka w przypadku kandydatywnych leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy, poprzez powiązanie fenotypów behawioralnych z odpowiadającą im aktywnością neuronalną. Ta metoda rejestracji poligraficznej umożliwia ilościowe, podłużne monitorowanie stanów czujności u swobodnie poruszających się myszy, co wspiera walidację mechanistyczną związków modulujących sen. Technika ta zapewnia ciągłość translacyjną od zaangażowania celu terapeutycznego do efektu funkcjonalnego, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnych etapach rozwoju leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację stanów snu zdefiniowanych za pomocą EEG/EMG z manipulacjami farmakologicznymi lub genetycznymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez obiektywne, mierzalne pomiary stanu czuwania, co pozwala zredukować niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego, co zwiększa pewność co do zaangażowania celu i modulacji szlaków.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje standaryzowane, wysokiej wierności sygnały EEG i EMG, odpowiednie do zautomatyzowanych potoków scoringowych z wykorzystaniem analizy widmowej i progów amplitudy.
- Wynik ilościowy: Zapewnia klasyfikację czuwania, snu NREM i REM w oparciu o epoki, co umożliwia powtarzalne porównania między grupami.
- Skalowalność: Kompatybilność z układami do rejestracji chronicznej pozwala na podłużną ocenę w różnych warunkach leczenia i cyklach okołodobowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje architekturę snu u ludzi poprzez mierzalne parametry snu NREM i REM, wspierając badania nad zaburzeniami snu oraz schorzeniami neuropsychiatrycznymi.
- Zgodność z biomarkerami translacyjnymi: Przesunięcia w widmie mocy EEG (delta 0,5–4 Hz dla NREM, theta 6–10 Hz dla REM) służą jako mierzalne biomarkery przejść między stanami snu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dane dotyczące rozkładu cykli czuwania i snu dostarczają informacji dla przedklinicznego profilowania bezpieczeństwa i skuteczności, szczególnie w przypadku związków aktywnych w OUN wpływających na pobudzenie lub sedację.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkrywania leków – od testowania hipotez po optymalizację wiodących związków – dostarczając fizjologicznych odczytów, które łączą interwencję molekularną z odpowiedzią behawioralną w procesie opracowywania leków neuropsychiatrycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących obwodów neuronalnych regulujących pobudzenie oraz przejścia między snem a czuwaniem poprzez manipulacje specyficzne dla typu komórek w połączeniu z odczytem fizjologicznym.
- Przesiewanie: Pozwala na powtarzalne monitorowanie stanu czujności w formie gotowej do analizy w celu oceny wpływu związków na architekturę snu w cyklach 24-godzinnych.
- Analityka: Analiza widma mocy oraz zautomatyzowana ocena epok dostarczają ilościowych, porównywalnych wyników do oceny zmian w czasie trwania i fragmentacji snu wywołanych podaniem leku.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie ludzkich fenotypów EEG snu oraz regulacji okołodobowej w genetycznie podatnym systemie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Powtarzalna infrastruktura chirurgiczna i rejestracyjna umożliwia prowadzenie badań podłużnych w ramach wielu projektów, zmniejszając nakłady na przygotowanie każdego pojedynczego badania.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności pomiędzy efektami molekularnymi a funkcjonalnymi wynikami cyklu sen-czuwanie.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane przepływy pracy w zakresie implantacji elektrod i akwizycji sygnałów zwiększają powtarzalność pomiędzy laboratoriami i seriami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejszą identyfikację efektów poza celami w OUN, co zwiększa efektywność kapitałową i zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach z powodu nieprzewidzianych zaburzeń snu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o profile wpływu na sen i czuwanie, dostosowując decyzje o dalszym rozwoju do uwarunkowań dotyczących indeksu terapeutycznego.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaksycznej, akwizycji sygnałów EEG/EMG oraz analizie spektralnej w celu wyznaczania faz snu.
- Zależność od stabilnej infrastruktury rejestracyjnej, w tym pierścieni ślizgowych, wzmacniaczy oraz oprogramowania umożliwiającego analizę EEG opartą na FFT i zautomatyzowaną klasyfikację stanów.
- Konieczność standaryzacji rozmieszczenia elektrod, parametrów filtrowania i kryteriów punktacji w ramach zespołu badawczego w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują dostosowania do różnych szczepów myszy, wieku lub modeli z chorobami współistniejącymi, które mogą zmieniać architekturę snu bazowego lub jakość sygnału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas rekonwalescencji pooperacyjnej, ograniczenia behawioralne związane z przewodami oraz potrzebę habituacji do komór rejestracyjnych w celu zminimalizowania fragmentacji snu wywołanej stresem.
